Таблица переходов вхл: Таблица переходов онлайн — Первенство ВХЛ

ПРИШЛИ	УШЛИ	ОСТАЛИСЬ
н.Данила Квартальнов**	в. Юлиус Гудачек	н.Евгений Сорокин **
в.Алексей Красиков**	в.Никита Беспалов	з.Аким Тришин **
з.Том Хеед	н.Лукаш Радил	н.Дмитрий Силантьев **
з.Дмитрий Костенко	н.Робин Ганзл	в.Андрей Сковронский**
з.Степан Фролов	н.Илья Зубов	н.Егор Круженков**
з.Никита Громов**	з.Евгений Кулик
з.Семён Ручкин**	з.Андрей Кутейкин
н.Илья Баранов**	н. Йори Лехтеря
н.Вадим Фаттахов**	н.Анатолий Никонцев
н.Валентин Демченко**	з.Алексей Гришин
н.Василий Пономарёв**	н.Илья Аркалов
з.Максим Афанасьев**	н.Александр Торченюк
	н.Артём Фёдоров
	н.Павел Чернов
	н.Михаил Юньков
	н.Павел Медведев
	н. Илья Кляузов
	н.Богдан Львутин
	з.Антон Мишаков
	з.Дмитрий Александров
	з.Илья Селин
	н.Мартин Бакош
	в.Александр Трушков
	з.Юрий Козловский
	н.Антон Первов

Будь в курсе всех новостей, подпишись!

Обещаем присылать только самые важные новости, никакого спама!

Подписаться Введите адрес электронной почты

Самат Данияр (спортсмен, хоккей, Казахстан): новости, биография, статистика спортсмена

Пожалуйста, подождите… Укажите email Укажите имя или псевдоним Укажите пароль Для регистрации на сайте Вы должны принять Правила сообщества Для редактирования профиля необходимо авторизоваться на сайте Укажите корректный Email material_dobavlen_v_izbrannoe Добавить в избранное Убрать из избранного Пароли не совпадают Задайте пароль для входа на сайт Хороший пароль должен содержать строчные, заглавные латинские буквы и цифры. Рекомендуется добавлять знаки препинания и задавать длину пароля не менее 8 символов Спасибо за Ваш голос! Добавить +1 Убрать +1 Выберите вариант ответа

Место

Вход на сайт

>

org/PostalAddress»>

Гражданство

Вид спорта

Хоккей

Амплуа

Спортсмен

Действующий

Да

Команды

Казахстан зщ 65
Барыс зщ 65

Дата рождения

24 января 1999 (23 года)

Пол

мужской

Рост, см

182

Вес, кг

70

Проектирование и анализ модели сети Петри сети взаимодействия фон Хиппеля-Линдау (VHL) с супрессором опухоли Анализ модели сети Петри сети взаимодействия фон Хиппеля-Линдау (VHL) с опухолевым супрессором.

Редактор: Manuela Helmer-Citterich, Римский университет Тор Вергата, Италия

Поступила в редакцию: 4 сентября 2013 г.; Принято: 14 апреля 2014 г .; Опубликовано: 2 июня 2014 г.

Авторские права: © 2014 Minervini et al.Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) Грант MFAG 12740 для ST. GM является научным сотрудником AIRC (http://www.airc.it/). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы также хотели бы заявить, что: соавтор Сильвио Тосатто является членом редакционной коллегии PLOS ONE. Это не меняет приверженности авторов всем политикам PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

Патологическая дерегуляция клеточных путей часто приводит к семейству сложных и взаимосвязанных заболеваний, обычно называемых раком [1]. Рак является многофакторным заболеванием, в развитии которого участвуют различные причины.Было разработано несколько вычислительных методов для изучения функциональных путей, участвующих в онкогенезе. Некоторые из них сосредоточены на дифференциальной экспрессии генов между здоровыми и патологическими тканями [2]–[3], на анализе сетей белок-белковых взаимодействий [4]–[5] или на моделировании молекулярной динамики [6]. Другие методы приближаются к заболеванию путем дискретизации патологических компонентов, которые приводят к опухоли [7]. Все эти подходы очень эффективны, когда переменные, связанные с болезнью, хотя и сложны, но хорошо известны и изучены. К многофакторному заболеванию можно подойти с помощью математической теории, построив теоретическую модель, в которой компоненты клетки связаны друг с другом. В биологии несколько задач касались теории сетей [8]–[9]. Сеть — это группа объектов, сильно связанных друг с другом (например, белки и ферменты пути или животные, принадлежащие к взаимодействующим популяциям). Их построение и последующее моделирование осуществляется путем математического анализа связей между найденными в системе узлами и их поведения во времени [10].Биологическая сеть обычно состоит из белков, нуклеиновых кислот и кофакторов, связанных биологическими реакциями, такими как образование белковых комплексов или регуляция активности ферментов [10]. Синдром фон Хиппеля-Линдау (VHL) [11] является хорошим примером для изучения сетевой теории, применяемой к раку, из-за схожей истории болезни и патологического фенотипа, которые разделяют пациенты. В то время как наследственные виды рака составляют лишь небольшую часть всех опухолей человека, их исследование представляет собой проблему для понимания пути, ведущего к образованию опухоли. В 2010 году Хайнер и соавт. впервые подошел к VHL, используя так называемые сети моделирования Petri Net (PN) [12]. Их работа, вдохновленная предыдущей теоретической моделью клеточных путей, связанных с кислородом [13] [14], была предварительным исследованием основной системы восприятия кислорода и ее связи с началом VHL. Хайнер и его коллеги предложили три разных функциональных модуля, ответственных за контроль сети гипоксии и за деградацию HIF-1α [12]. Другими словами, они предположили, что наследственные формы рака, такие как различные проявления VHL, являются результатом различных и одновременно нарушенных метаболических путей.

Болезнь Гиппеля-Линдау

фон Хиппеля-Линдау (pVHL) является продуктом гена фон Хиппеля-Линдау, расположенного в коротком плече 3-й хромосомы и постоянно транскрибируемого как в эмбриональных, так и во взрослых тканях [15]. Мутации pVHL связаны с патологическим исходом, называемым синдромом VHL, наследственной формой рака [16]. Синдром VHL характеризуется кистами и опухолями, растущими в определенных частях организма [16]–[17]. Это считается тяжелым аутосомно-доминантным генетическим заболеванием с наследованием одного человека из более чем 35 000 [18].Опухолевые поражения, которые могут быть как доброкачественными, так и злокачественными, обычно локализуются в сетчатке, надпочечниках, придатках яичек, центральной нервной системе, почках и поджелудочной железе [19]. Как генетическое заболевание, синдром VHL следует принципу двух ударов Кнудсона. Копия гена мутирует в зародышевой линии, но другая копия гена по-прежнему производит функциональный белок. Полная инактивация белка возникает в течение жизни за счет соматической инактивации оставшейся функциональной копии [20]. Наоборот, мутации, возникающие в период раннего формирования плода, приводят к неудачному развитию [21].Ген pVHL имеет 11 213 пар оснований, включая три экзона [18], а конечный транскрипт представляет собой белок, обычно присутствующий в двух изоформах: pVHL30 и pVHL19, состоящих из 213 и 160 остатков соответственно. Ни одна из изоформ не содержит известного ферментативного домена, а скорее служит многоцелевым адапторным белком, участвующим во множественных белок-белковых взаимодействиях [22]. Структура pVHL организована в α- и β-доменах, и было показано, что ее стабильность обеспечивается прямым взаимодействием с другими белками, такими как элонгины B и C [23].И элонгин B, и C также необходимы для наиболее охарактеризованной функции pVHL, зависимой от убиквитинирования деградации Hypoxia Inducible Factor (HIF) через протеасомы [24]. Однако pVHL считается многоцелевым белком из-за большого количества известных взаимодействующих факторов. На момент написания в базе данных IntAct [25] было представлено более 200 различных партнеров по взаимодействию, причем некоторые из них конкурируют за один и тот же сайт связывания элонгина. Действительно, pVHL был обнаружен в различных клеточных компартментах и, по-видимому, участвует во многих различных клеточных процессах, таких как апоптоз, клеточная пролиферация, выживание и подвижность [26].Учитывая огромное количество интеракторов и множество клеточных локализаций, было описано или выдвинуто предположение о многих различных функциях, таких как регуляция цитоплазматических микротрубочек во время митоза [27] и отложение эндотелиального внеклеточного матрикса [28]. С другой стороны, учитывая огромное количество игроков, вовлеченных в синдром VHL, и отсутствие надежных кинетических данных, подход, основанный на PN, может быть предпочтительным вариантом для моделирования всего пути VHL.

Сеть Петри для путей взаимодействия

С момента их изобретения Карлом Адамом Петри в начале 60-х годов СП в основном использовались для описания технических систем, но позже также была продемонстрирована полезность для описания биологических и биохимических функций [29].PN были успешно использованы во многих исследованиях для описания биологических сетей [30], таких как регуляция и этиопатология при мышечной дистрофии Дюшенна человека [31] и сеть ответа на гипоксию [12]. СП представляют собой качественные математические модели, которые могут графически представлять многие типы объектов, не только метаболиты, но и различные состояния белков, и полезны для моделирования сетей, в которых задействованы не только метаболиты. Действительно, PN могут быть мощным инструментом для изучения всех одновременных взаимодействий в определенном пути, даже если белки или кинетика недостаточно известны. Из-за большого количества различных функций pVHL, участвующих в прогрессировании заболевания VHL, мы решили расширить анализ на основе PN [12], увеличив количество рассматриваемых белок-белковых взаимодействий. Мы создали новую вручную созданную модель PN всей системы регуляции VHL, собрав данные из литературы и включив сигнальные пути и глюкозный метаболизм. Чтобы построить реалистичную сеть, в качестве источника использовалась литература как по биохимическим экспериментам, так и по предсказаниям in silico .Было решено построить PN только с подтвержденными взаимодействиями pVHL, функция которых также была известна. Полученное PN было подтверждено с помощью анализа конкретных свойств, как было предложено в предыдущих исследованиях с использованием того же метода [29]. После проверки структуры PN было выполнено in silico нокаутов конкретных белков, чтобы наблюдать различное поведение сети и получающийся в результате биологический эффект.

Методы

Сеть была разработана в рамках Snoopy PN (версия 2, ревизия 1. 13) [32], соблюдая математический формализм PN, описанный в [12]–[33]. Было показано, что СП полезны для описания дискретных и параллельных процессов в простом графическом представлении [30] и использовались для описания биомедицинских процессов благодаря их способности представлять последовательные этапы процесса. Методы моделирования СП активно используются для описания, моделирования, анализа и прогнозирования поведения биологических систем. Среда Snoopy PN предоставляет расширяемую мультиплатформенную среду для проектирования, анимации и моделирования сетей Петри [32].Мы выбрали Snoopy для облегчения будущих расширений пути VHL, представленного здесь. Среди различных доступных типов PN был выбран стандартный PN, чтобы ограничить количество переменных. Для анализа и проверки PN использовались анализаторы Charlie и PInA (34). Кроме того, для проверки биологической надежности модели использовали эксперименты с нокаутом in silico . Проверка структурной модели проводилась путем анализа Т-инвариантов, чтобы продемонстрировать, покрыта ли система Т-инвариантами, и подтвердить биологический смысл каждого инварианта. Использование Т- и Р-инвариантов обусловлено их собственными свойствами: они представляют собой набор (соответственно переходов или мест), позволяющих воспроизвести одно и то же состояние после n преобразований. P-инвариант представляет собой набор мест, в которых количество токенов постоянно и не зависит от скорости срабатывания. Вместо этого T-инвариант представляет набор переходов, который циклически возвращается, чтобы показать тот же начальный набор. Биологически инвариант P может представлять процесс регуляции белка, тогда как инвариант T может представлять собой циклические биохимические преобразования, такие как метаболические реакции.С этой целью вычисленные инварианты были сгруппированы в максимальные общие наборы переходов (MCTS) и кластеры, первые из которых основаны на наличии определенных наборов переходов внутри различных Т-инвариантов, а вторые — на сходстве между Т-инвариантами. В зависимости от результирующей квадратной матрицы будут определены различные количества кластеров. Там, где MCTS создают дизъюнктивные сети, кластеры объединяют похожие T-инварианты. Поведенческая валидация проводилась путем выборочного удаления токенов внутри модели, имитируя возможные биологические нарушения, такие как мутации, вызывающие заболевание.Полученное поведение сети сравнивали с тем, что сообщается в литературе. Общее время выполнения для вычисления инвариантов составило менее десяти секунд на основной рабочей станции Linux x86. Источники литературы, использованные для построения модели, указаны в таблице S1. Среда Snoopy для построения PN, инструменты Charlie и PInA для анализа доступны на веб-сайте (URL: http://www-dssz.informatik.tu-cottbus.de/DSSZ/Software). Наконец, модель использовалась для имитации поведения сети посредством визуального контроля как движения токенов, так и их накопления в определенных частях сети.Для визуального объяснения движения токена в PN см. Видео S1.

Наличие модели

Результирующая модель PN болезни VHL доступна в файле S1.

Результаты

Обозначения и предположения

Построенная здесь PN фокусируется на взаимодействиях pVHL, которые уже были подтверждены биохимическими экспериментами и описаны в литературе. Мы решили смоделировать реалистичные пути заболевания VHL на основе подтвержденных литературных данных, включая все известные функции VHL, сигнальный путь, связанный с VHL, и глюкозный метаболизм.Все библиографические источники, использованные для разработки модели, представлены в таблице S1. Окончательный PN состоит из 323 позиций и 238 переходов, соединенных 801 дугой. Таблицы S1 и S2 показывают все места и переходы и связанные с ними биологические соответствия. Места в основном представляют собой белки и ферменты, а некоторые представляют собой ДНК или небольшие молекулярные субстраты, такие как глюкоза и кофакторы (например, АТФ). Обозначения пре- и пост-мест и их биологическое значение объяснены в Таблице S1. В некоторых случаях места используются для представления целой группы изменений, вызванных транскрипцией ДНК (например,г. p_32 и p_33 или Et_eff1 и Et_eff2). Вместо этого переходы символизируют комплексообразование между двумя белками или посттрансляционные модификации. Выходные переходы означают деградацию или перемещение в другие части клетки или организма для выполнения своих функций (например, degrad_1 и degrad_2), тогда как входные переходы показывают образование субстрата или белка. Чтобы упростить проектирование такой большой сети, мы решили использовать макроузлы для группировки реакций, представляющих сложные молекулярные пути, такие как сигнальные пути или вторичные сигнальные каскады.Весь процесс объединен в один узел с заданным именем, что позволяет осуществлять визуальный осмотр только в случае необходимости. С верхнего уровня все переходы все еще можно найти на более низком иерархическом уровне макета. Логические узлы использовались для мест, участвующих во многих реакциях по всей сети, таких как ATP и ADP (по 7 логических копий в каждом) или NAD и NADH (по 4 логических копии в каждом). Для моделирования макроузлов была выбрана общая глубина вложенности, равная двум. Специальные дуги не использовались, в то время как мы решили смоделировать постоянное присутствие некоторых объектов с помощью двойных дуг (напр.г. для elob, eloc и мест, обозначающих ферментативную активность). В случае белков, которые активно разлагаются, было предпочтительно создать входной переход, имитирующий постоянное производство (или синтез), и выход для потребления. Это относится к pkcz2, Jade1, pVHL и HIF-1α. Как видно из рисунков 1-3, которые представляют всю модель, можно сразу идентифицировать два основных узла: pVHL и vcb, комплекс, образованный pVHL и двумя элонгинами. Другой важной частью является глюкозный метаболизм, смоделированный благодаря его регуляции, индуцированной гипоксией.Подробно он представлен на рисунке 2.

Рисунок 1. Модель верхнего уровня.

Цвета некоторых маркеров были выбраны произвольно, чтобы дать более четкое определение центральных узлов (ATP, Vcb и кислород) или для узлов, участвующих в большем количестве реакций, таких как GSK3β. Группа узлов в левом нижнем углу не отключена от центрального тела сети благодаря наличию логических узлов для синтеза АТФ (t_97).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096986.g001

Рисунок 3. Нижние иерархические уровни PN, в частности регуляция HIF-1α и HIF-1α-зависимая проангиогенная передача сигналов.

Пути VEGF и EPO находятся на более низком иерархическом уровне, чем макроузел pro_angio.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096986.g003

Активность транскрипции HIF-1α

Фактор транскрипции HIF-1α стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток для создания новых кровеносных сосудов во время локализованной или обширной гипоксии.У человека он присутствует в виде трех разных паралогов: HIF-1α, HIF-2α и HIF-3α. Последовательность между первыми двумя довольно консервативна, тогда как последняя немного короче и, по-видимому, имеет совершенно другие функции по сравнению с двумя другими [33]–[34]. И HIF-1α, и -2α стимулируют транскрипцию ДНК, но точные продукты этой активности до сих пор плохо изучены. В нашей модели учитывалась только активность HIF-1α in vivo . Не исключено, что от второго паралога зависят и другие биологические эффекты.Действительно, оба имеют проангиогенетическую функцию и расщепляются pVHL посредством пролин-направленного гидроксилирования. HIF представляет собой гетеродимер HIF-1α и HIF-1β, последний также называется ядерным транслокатором рецептора арила (ARNT). Мы начали с транскрипционной активности HIF, поскольку ее регуляция является наиболее изученной функцией pVHL. Наша модель, как и ожидалось на основании литературных данных, показывает, что HIF-1α проникает в ядро, когда он не расщепляется pVHL. Впоследствии он связывает HIF-1β с образованием гетерокомплекса HIF, который взаимодействует с ДНК.Наша модель правильно имитирует повышенное сродство HIF к ДНК. Транскрипция усиливается некоторыми кофакторами, связывающими как субъединицы HIF, так и другие белки, такие как p300, Creb и cjun. Это происходит в специфической последовательности промотора ДНК, называемой элементом реакции на гипоксию (HRE). Кроме того, во время транскрипции продуцируются некоторые проангиогенные факторы: фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), эндотелин (ET) и эритропоэтин (EPO). Все описанные пути согласуются с предыдущими наблюдениями, опубликованными в [35].

Метаболические процессы

Транскрипционная активность HIF-1α включает некоторые белки, которые зависят от кислорода, но участвуют в других путях (например, в окислительном метаболизме) или полностью независимы (например, металлопротеиназа MT1MMP). Кроме того, HIF-1α стимулирует продукцию белков, участвующих в глюцидном пути. Конечным продуктом метаболизма является аденозинтрифосфат (АТФ), молекулярная форма энергии, состоящая из аденозина, аденинового кольца, соединенного с рибозным сахаром, и трех фосфатных фрагментов.Когда фосфатная часть гидролизуется, она высвобождает энергию, используемую клетками для ферментативных реакций. Метаболизм глюкидов состоит из гликолиза, цикла Кребса, образования гликогена и дыхательной цепи с синтезом АТФ. Глюкоза поглощается в клетках ферментативными переносчиками глюкозы (GLUT), которые переносят молекулу в то место внутри клетки, где происходит метаболизм [36]. Существует множество изоформ этих транспортеров: GLUT1 присутствует во всех клетках и, в частности, в мембранах эритроцитов, нейронах и глии [37].GLUT2, расположенный как в печени, так и в бета-клетках поджелудочной железы, характеризуется низким сродством к глюкозе, поэтому для его активации требуется более высокая концентрация глюкозы [38]. Сразу после еды концентрация глюкозы увеличивается, тем самым быстро активируя их. GLUT2 стимулирует выработку инсулина, гормона, регулирующего концентрацию глюкозы в плазме. Концентрация глюкозы в плазме также может увеличиваться за счет противоположного пути, возникающего из-за распада гликогена печени на глюкозу и попадания в системный кровоток.GLUT3 в основном присутствует в нейронах, тогда как GLUT4 является транспортером, активируемым инсулином, расположенным в миоцитах, адипоцитах и ​​кардиомиоцитах [36]–[39]. В нашей модели мы решили исключить GLUT3 из-за его специфической роли в нейронных клетках. Гликолиз происходит в цитоплазме, и в ходе этого процесса каждая молекула глюкозы фосфорилируется, потребляя две молекулы АТФ, а затем делится на две более мелкие молекулы. Дальнейшие модификации этих двух молекул приводят к образованию новой АТФ. Молекула, полученная в конце гликолиза, представляет собой пируват, который может быть снова модифицирован тремя различными путями.Он может быть декарбоксилирован и связан с коферментом А с образованием ацетил-кофермента А. Затем его можно карбоксилировать с получением оксалаацетата или трансформировать с помощью лактатдегидрогеназы в молочную кислоту. Пируват также может образовываться другими метаболическими путями, такими как разрушение белков или жирных кислот и модификации аминокислот. Ацетил-КоА и оксалатацетат являются молекулами, используемыми в следующем процессе метаболизма глюкидов, цикле Кребса, происходящем в митохондриальном матриксе. Цикл Кребса начинается со слияния ацетил-КоА и оксалаацетата с образованием лимонной кислоты, которая продолжает подвергаться модификациям до тех пор, пока снова не образуется оксалаксусная кислота. В процессе модифицируются некоторые коферменты. Декарбоксилирование пирувата с образованием ацетил-КоА уже превращает НАД+ (никотинамидадениндинуклеотид) в НАДН (восстановленную форму), после чего получают еще один из АТФ, ГТФ, ФАДН ₂ (флавинадениндинуклеотид) и еще три НАДН на каждую молекулу пирувата, входящую цикл Кребса. Окислительно-восстановительные коферменты считаются переносчиками электронов. В ходе метаболических реакций они восстанавливают себя и получают электроны (и протоны) для окисления субстрата ферментативной реакции.Электроны, захваченные во время метаболизма глюкозы, затем используются в дыхательной цепи, происходящей во внутренней митохондриальной мембране. Дыхательная цепь состоит из транспорта электронов через ферменты, называемые цитохромами, и другие коферменты, характеризующиеся способностью получать и отдавать электроны. НАДН (ФАДН ₂ ) снова окисляется цитохромами, возвращаясь в форму НАД (или ФАД). Электроны, полученные в результате окисления, используются для восстановления половины молекулы кислорода до воды, высвобождая больше энергии. Окислительно-восстановительная цепь FADH ₂ и NADH создает химический потенциал, вызывающий толчок протонов за пределы внутренней мембраны к межмембранному пространству, которое остается между внутренней и внешней мембранами митохондрий. Это также вызывает более высокую концентрацию протонов за пределами внутренней мембраны. Результирующий градиент вызывает стремление протонов войти в клетку. Последним этапом является АТФ-синтетаза, образованная каналом, который позволяет проникать протонам, толкаемым градиентом, позволяя ферменту изменять конформацию и вступать в реакцию.Эта кинетическая энергия превращается в АТФ. В нашей модели подробно описаны гликолитический цикл и цикл Кребса, представленные на втором уровне иерархии грубым переходным гликолизом. Вместо этого дыхательная цепь была объединена в один узел (t_97). Мы решили представить создание и потребление АТФ, чтобы показать влияние более низкой и более высокой концентрации кислорода в сети. С другой стороны, потребление кислорода для синтеза АТФ во время дыхательной цепи создает поток кислорода в модели. Кислород — не единственная связь между глюцидным метаболизмом и гипоксией. Действительно, транскрипционная активность HIF-1α усиливает транскрипцию многих изоформ GLUT (таких как 1, 3 и 9) и киназы пируватдегидрогеназы, которая определяет инактивацию пируватдегидрогеназы (PyrDH) и последующее образование ацетил-КоА из пирувата. Наконец, также производится лактатдегидрогеназа, чтобы обеспечить альтернативное соединение, вырабатывающее энергию, необходимую для выживания клеток [36]–[40].

pVHL-зависимые процессы

Некоторые интеракторы могут связывать pVHL в областях, взаимодействующих с элонгином C.Это HuR, Nur77, p53 и Jade1. Nur77 имеет сложную функцию, и его роль в pVHL супрессорной активности до сих пор не совсем ясна. Nur77 может связываться с pVHL, ингибируя связывание элонгина, но обеспечивая связывание HIF-1α. Его транскрипция стимулируется самим HIF-1α, а образование комплекса pVHL-HIF-1α-Nur77 стабилизирует транскрипционную активность HIF-1α за счет ингибирования зависимой от pVHL деградации [41]. Другой функцией Nur77 является стимуляция транскрипции проопиомеланокортина (РОМС), который является предшественником образования адренокортикотропного гормона (АКТГ).Этот гормон выполняет важную функцию реакции на стресс, стимулируя выработку кортизола и других нейротрансмиттеров надпочечниками, чтобы усилить реакцию организма на опасность и стрессовые стимулы например. увеличение глюконеогенеза и мышечной массы. Избыток этого гормона может вызвать десенсибилизацию его рецепторов для подавления обратной связи и, следовательно, мышечную слабость, усталость, гипергликемию и остеопороз [42]. p53 может связываться с pVHL, избегая деградации этого супрессора опухоли.Вместо этого он стимулирует апоптотический сигнальный каскад через коактиватор p300, который стимулирует выработку белков, усиливающих запрограммированную гибель клеток. Если p53 не может связываться с pVHL, в модели описаны еще два механизма. Одним из них является его модификация и деградация с помощью Mdm2, а другим является pVHL-независимая деградация HIF-1α. Взаимодействие с Mdm2 необходимо в обоих случаях [43]–[44]. Jade1 является короткоживущим белком, основная функция которого заключается в стимуляции зависимой от фосфорилирования деградации β-катенина.Это субъединица белкового комплекса кадгерина, действующая как внутриклеточный преобразователь сигнала в сигнальном пути Wnt. По-видимому, β-catenin способен останавливать клеточное деление с помощью контактно-зависимого ингибирующего сигнала, тогда как в передаче сигналов Wnt он также участвует в пролиферативной транскрипции. Когда Wnt отсутствует, β-катенин может фосфорилироваться киназой гликогенсинтетазы типа 3β (GSK3β) в комплексе с APC (аденоматозным полипозом кишечной палочки) и аксином. β-catenin может взаимодействовать с Jade1 и успешно разрушаться только после этого взаимодействия [45].Связанные функции представлены в узле макроса Jade1_pat. GSK3β, по-видимому, является белком, участвующим во многих различных путях. GSK3β участвует в дезактивации гликогенсинтетазы и может даже фосфорилировать pVHL и HIF-1α. В случае HIF-1α он генерирует независимый от pVHL путь деградации, где фосфорилирование делает возможным убиквитинирование, тогда как в случае pVHL он ингибирует стабилизацию pVHL микротрубочек [46].

Анализ структурной модели

Также на основе предыдущих наблюдений Heiner et al., [47], в 2008 г. Grunwald et al. продемонстрировали, что PN можно использовать для описания больших и сложных метаболических путей [31]. Они постулировали следующий набор минимальных правил, которым должна удовлетворять СП, чтобы считаться биологически надежной: (1) сеть должна быть полностью связанной, (2) сеть должна быть покрыта Т-инвариантами и (3) каждый Т-инвариант и P-инвариант должен иметь биологический смысл. Описанная здесь модель была протестирована относительно того, что ранее было сделано Грюнвальдом и его сотрудниками [31], и в результате она покрылась Т-инвариантами, связна, однородна, и каждое место имеет предпереход и постпереход.Переходы без пре- или пост-мест использовались для имитации интерфейса системы с окружением. Сеть живая, другими словами, она продолжает работать вечно, при этом все переходы навсегда вносят вклад в поведение сети, а мертвых переходов нет. MCTS и кластерный анализ были использованы из-за большого количества Т- и Р-инвариантов, включенных в модель. Оба метода используются в теории СП, чтобы уменьшить сложность, связанную с такой большой сетью, и уменьшить количество ошибок, связанных с ручным исследованием.Из 238 переходов, присутствующих в начале в модели, было вычислено 393 Т-инварианта без учета 10 тривиальных инвариантов. Последние состоят из пары переходов, которые обычно представляют собой прямую и обратную реакцию, например активное и неактивное состояние белка. Тривиальные инварианты могут быть стерты, чтобы уменьшить размер сети, не нарушая всей системы, когда интерес сосредоточен на стационарном поведении [12]. Т-инварианты были сгруппированы в 44 кластера с использованием коэффициента Танимото с порогом подобия 65%, как описано в [31].Только 11 из этих 44 содержали более одного Т-инварианта. Три самых больших кластера — это C9, состоящий из 144 T-инвариантов, C8 из 72 и C11 из 64 T-инвариантов. Разделение на кластеры позволяет упростить анализ сетевых путей, представленных каждым Т-инвариантом, поскольку они сгруппированы по сходству, в частности, по общим переходам, из которых они состоят. Т-инварианты, названные в тексте, показаны в таблице S3, а Т-инварианты, сгруппированные в C8, C9, C10, C11, объяснены в таблице S4 и описаны следующим образом.

Кластер C8

C8 объединяет все переходы, включенные в пути HIF-1α, включая транскрипцию, сигнальные каскады, деградацию через pVHL, p53 и GSK3β и, в конечном итоге, цикл Кребса. Для сигнального пути ЭПО не включены два перехода (t_35 и t_36), которые вызывают активацию Jak и последующую активацию Stat5 для стимуляции транскрипции ДНК. Регуляция стабильности матрикса также является частью кластера из-за дестабилизации, вызванной HIF-1α транскрипцией металлопротеиназы (MMP), переходами от t_134 к t_140. Самый большой T-инвариант в C8 — это Inv_280 (93 перехода), а наименьший — Inv_377 (81 переход). Различия между Т-инвариантами показывают возможность альтернативных путей внутри модели. Например, сигнальный каскад, зависимый от VEGF, может протекать тремя различными способами: t_13, t_14 и t_15, что приводит к слиянию путей в грубых узлах Vegf_path4, Vegf_path3 и Vegf_path2 соответственно. Частота возникновения в C8 составляет 24 перехода для каждого пути. Пути эндотелина, VEGF и эритропоэтина не конфликтуют и происходят вместе.Дезагрегация матрикса посредством ММР присутствует в 18 Т-инвариантах, тогда как ингибирование этих белков, т.е. стабилизация матрикса, присутствует в остальных 54 переходах. Что касается цикла Кребса, 47 Т-инвариантов имеют t_91, из которых только 24 достигают t_92 и t_93, представляющих последние три стадии цикла: от сукцината до фумарата, от фумарата до малата и от малата до оксалоацетата. Весь производимый малат используется для регенерации оксалоацетата. Деградация HIF-1α происходит в любом Т-инварианте кластера. Зависимая от pVHL деградация HIF-1α всегда присутствует (переходы с t_116 на t_119). В 19 Т-инвариантах деградация происходит через р53 (от t_191 до t_193) или, альтернативно, посредством фосфорилирования с помощью GSK3β в других 17 Т-инвариантах. Два из трех путей могут присутствовать в одном и том же Т-инварианте, как и в Inv_227, где присутствуют как деградация через pVHL, так и деградация через p53. Это рассматривалось как зависимость HIF-1α от отсутствия деградации этими белками. Все три пути деградации никогда не проявляются в одном и том же Т-инварианте.Пути p53 и GSK3β никогда не присутствуют вместе, но каждый из них сопровождается зависимой от pVHL протеасомной деградацией. У Inv_377 отсутствует сигнальный путь ЭПО, но он единственный в этом кластере имеет t_34, t_33 и t_37. Эти инварианты имеют все входные и выходные переходы. Например, t_202, второй вход для pVHL, присутствует только в 18 инвариантах. Другими входами являются t_98, всегда присутствующий, приводящий к образованию HIF-1α и pVHL, t_192, продуцирующий p53 и t_216, представляющий другие метаболические пути, генерирующие пируват. Последний также присутствует в каждом инварианте, обеспечивающем образование пирувата, необходимого для прохождения цикла Кребса.

Кластер C9

C9 является самым большим кластером в нашей модели и включает 144 Т-инварианта. Для него характерна полная отмена пути ЭПО, который проходит через образование комплекса Shc-Grb-Sos и последующий мапк-зависимый каскад фосфорилирования. Переход t_127, отражающий влияние ЭПО на выработку кислорода, отсутствует. Вместо него рассматриваются t_35 и t_36, которые присутствуют в 72 Т-инвариантах.В кластере C9 самыми большими Т-инвариантами являются Inv_278 и Inv_279 (74 перехода), а самыми короткими являются Inv_101, Inv_105, Inv_144 и Inv_148 с 65 переходами в каждом.

Кластер C10

С10, состоящий из 52 Т-инвариантов, характеризуется наличием гликолиза между многими переходами, сгруппированными в кластере. Это также кластер, содержащий наиболее заполненный Т-инвариант из всех вычисленных 393 нетривиальных Т-инвариантов. Это Inv_245, включающий 101 переход и покрывающий почти половину всей модели.Кластер C10 также включает Inv_125, самый короткий инвариант этой модели, состоящий из 85 переходов из-за отсутствия цикла Кребса. Еще одно отличие от трех других основных кластеров состоит в том, что здесь присутствуют оба пути ЭПО, в частности, путь Jak относится к 4 Т-инвариантам, а Shc-Grb-Sos наблюдается во всем кластере. Vegf_path2, по-видимому, более распространен в этом кластере, поскольку присутствует в 36 T-инвариантах, тогда как два других присутствуют по 12 раз каждый. На этот раз они присутствуют даже в том же инварианте, что и для Inv_60, Inv_129, Inv_172 и Inv_215, причем как t_13 и t_15, так и Inv_142, Inv_185 и Inv_228 с t_14 и t_15 и всеми последующими сигналами, появляющимися одновременно.Несмотря на то, что гликолиз присутствует во всех кластерных инвариантах, цикл Кребса проявляется только в 11 случаях. p53-зависимая деградация HIF-1α происходит в 11 случаях, а зависимая от фосфорилирования — в 13. Был добавлен входной переход по отношению к другим основным кластерам, проанализированным до сих пор (например, t_69_eating), без которого гликолиз никогда не мог бы иметь место.

Кластер C11

C11 состоит из 64 Т-инвариантов. Здесь описана только часть пути ЭПО, с тем основным отличием, что цикл Кребса полностью отменен, в то время как включена регуляция пролилгидроксилазы типа 2 (PHD2) с помощью оксалацетата.Взаимодействие HIF-1α с Nur77 и транскрипция VEGF с помощью Sp1 также присутствуют. t_80 (превращение пирувата в оксалатацетат) отсутствует в первых 42 кластерных Т-инвариантах. Взаимодействие Nur77 с HIF-1α присутствует только в 8 Т-инвариантах, в частности, от Inv_87 до Inv_94. Транскрипционная активность Sp1 проявляется в двойном количестве, включая те же 8 только что упомянутых инвариантов. Транскрипция VEGF через активность Sp1 зависит от фосфорилирования aPKCζ2, которое, однако, не проявляется в кластере.Когда VEGF синтезируется, он впоследствии стабилизируется с помощью Hur, за которым следует t_178, и Hur воссоздается, чтобы обеспечить другие функции. Действительно, это одно из немногих мест без перехода ввода, но с токеном, который снова идет вперед и назад. По сравнению с другими кластерами, C11 также показывает на один переход меньше в крупном узле регуляции PHD, в частности, t_81, который показывает превращение пирувата под действием pyrDH в ацетил-Кофермент А, необходимый для цикла Кребса. Четыре кластера от C-8 до C12 очень похожи друг на друга, как видно из дерева расстояний на рисунке 4.Все они содержат транскрипционную активность HIF-1α и сигнальные пути, вызванные вариантами деградации EPO, VEGF и HIF-1α. Они включают эффекты других продуктов транскрипционной активности, таких как металлопротеиназа и киназа пируватдегидрогеназы, которые регулируют состояние активации PyrDH. Все они включают часть глюкозного метаболизма, но не само образование гликогена. Остальные пять кластеров от С12 до С16 имеют меньшее количество Т-инвариантов и меньшее количество переходов в каждом инварианте.Они не включают транскрипционную активность, а образуются только VEGF и гликолитическими путями. Информативность этих кластеров оказалась малоинформативной и их анализ не проводился. То же самое относится и к кластерам, состоящим из 1–3 Т-инвариантов. Наконец, некоторые переходы отсутствуют в кластерах и не перечислены в Т-инвариантах, поскольку тривиальные инварианты были исключены из кластерного анализа. Эти переходы показаны в таблице 1 с их соответствующим биологическим значением.

Анализ MCTS

Другой способ группировки инвариантов — по количеству присутствующих в них одиночных переходов. Анализ максимального общего набора переходов (MCTS) обеспечивает декомпозицию PN на непересекающиеся подсети, разделяющие части одних и тех же Т-инвариантов [29]. В биохимической сети MCTS можно интерпретировать как подмножества ферментов, работающих вместе в устойчивых условиях, рассчитанных на основе поддержки Т-инварианта. Расчет MCTS не учитывает стехиометрические отношения, описывая исключительно наборы реакций, представленных максимальным числом Т-инвариантов, которые являются общими для разных сигнальных путей [48]. Всего было идентифицировано 40 нетривиальных MCTS, результаты и связанные с ними биологические средства показаны в таблице 2. Некоторые переходы не относятся к нетривиальным MCTS, поскольку их возникновение не имеет сходства с другими переходами и они создают отдельные MCTS (в частности, : t_69, t_82, t_91, t_94, t_98, t_114, t_116, t_120, t_121, t_122, t_179, t_202, t_209, t_212, t_216, t_225 и t_229). MCTS определяют переходы, которые всегда происходят вместе, но не обязательно связаны между собой, таким образом, представляя разрозненные строительные блоки, составляющие сеть.С учетом обоих анализов в PInA [29] была автоматически построена таблица, показывающая корреляцию между кластерами и MCTS. Переходы (t) или MCTS (M) сравнивают, чтобы оценить, сколько кластеров T-инвариантов покрывают выбранные M или t (если переход еще не является частью MCTS, как указано выше). Чем более охвачен переход или набор, тем более важным он может считаться для поведения сети. Недавно был представлен метод укрупнения сети, основанный на абстрактных зависимых наборах переходов (ADT) [49]. Он сформулирован без требования предварительного вычисления Т-инвариантов и является инструментом, обычно используемым для разложения больших биохимических сетей на более мелкие подсети. Из-за ручной разработки нашей модели мы предпочли поддерживать логическую иерархию, основанную на метаболических путях, чтобы поддерживать сеть, сосредоточенную на pVHL и ее взаимодействии. Результаты расчета MCTS показывают, что набор, наиболее покрытый T-инвариантами кластера, — это M20 с 358 T-инвариантами, покрывающими все переходы в наборе, что указывает на то, что этот MCTS соответствует большему количеству T-инвариантов, чем другие.Все наборы переходов являются важным связующим звеном с остальными, так как токены чаще проходят через эти переходы. Переход, не присутствующий ни в одном наборе, но наиболее покрываемый Т-инвариантами, — это t_98, который также является наиболее часто встречающимся переходом, см. рис. 5. 10 наиболее часто встречающихся переходов перечислены в таблице 3.

P-инвариантный анализ

Хотя сеть не покрыта P-инвариантами, она имеет 130 P-инвариантов. 47 из них являются тривиальными P-инвариантами, состоящими из одного места, соединенного двойными дугами, чтобы имитировать функцию дуги активатора.Другой объект, представленный двойными дугами, представляет собой ферментативную активность, катализирующую реакцию и немедленно возвращающуюся к устойчивому состоянию. P-инварианты показывают места или наборы мест, где номера токенов всегда остаются одинаковыми и не выходят за пределы подсети, индуцированной P-инвариантом в исходной маркировке. Другими словами, они не растут и не уменьшаются. Остальные P-инварианты в основном расположены в путях передачи сигнала, например, в ситуациях, когда белок отключается от своей функции, а затем возвращается после второго механизма реактивации.Этот сценарий присутствует в p_41, p_42 и p_45, расположенных в инварианте P_58. Важно отметить, что АТФ и АДФ, а также НАД и НАДН моделируются как Р-инварианты. P_90, P_91 и t_97 способны трансформировать АТФ и АДФ. В более общем случае все переходы с потреблением энергии считаются обратными переходами инвариантов. Инварианты, не связанные с передачей сигнала, представляют собой места, расположенные в системе Hur, где Hur отстранен от своей функции с помощью pVHL. Это хорошее приближение для последовательных модификаций, которые мгновенно активируют белки.После этого Hur может вернуться и стабилизировать VEGF, чтобы повысить его транскрипционную активность.

Эксперименты с нокаутом In Silico

Описанные ранее кластеризация и анализ MCTS для Т-инвариантов позволили нам выявить наиболее распространенные переходы и понять, какие переходы можно истощать в наших экспериментах с нокаутом, чтобы получить наиболее важный биологический эффект. Были проведены эксперименты по отключению, стирая выбранные переходы или токены и наблюдая, какие переходы или MCTS становятся инактивированными.Принимая во внимание наши результаты и данные литературы, мы решили исключить следующие элементы пути: (i) pVHL, (ii) только HIF1α и с Sp1, (iii) t_98, (iv) PHD2, (v) MCTS1, (vi) t_97 и (vii) GSK3β. Далее мы опишем влияние каждого сценария нокаута на нашу модель.

(i) нокаут pVHL.

Деградация HIF-1α не полностью истощена из-за наличия как p53-, так и GSK3β-зависимых альтернативных путей деградации. Все другие процессы, обычно ингибируемые pVHL, происходят неконтролируемым образом, включая создание VEGF за счет транскрипционной активности Sp1 и усиление регуляции матрикса из-за отсутствия поперечного связывания фибронектина.В результате Hur постоянно активируется, а nur77 может стимулировать синтез проопиомеланокортина, предшественника адренокортикотропного гормона. Card9 увеличивает высвобождение фактора некроза опухоли и NF-kB, если он не ингибируется pVHL. Вместо этого Jade1 не может выживать достаточно долго, чтобы ингибировать β-катенин, генерируя сигнал пролиферации с помощью Wnt. Молочная кислота также не вырабатывается из-за того, что продукция фермента ЛДГ зависит от транскрипционной активности HIF-1α.

(ii) нокаут HIF-1α.

VEGF все еще вырабатывается благодаря Sp1, поэтому кислород все еще вырабатывается, хотя и в меньшей пропорции. Если HIF-1α и Sp1 нокаутированы одновременно, кислород быстро потребляется, и метаболизм вскоре не может продолжаться. Молочная кислота не вырабатывается из-за того, что продукция фермента ЛДГ зависит от транскрипционной активности HIF-1α. Гликолиз и гликоген вырабатываются нормально, и метаболизм не ингибируется отрицательной регуляцией PyrDH и образованием молочной кислоты. Поскольку pVHL присутствует, активируются другие супрессорные активности, за исключением протеасомной деградации HIF-1α из-за отсутствия субстрата.

(iii) Двойной нокаут HIF-1α и pVHL.

Это создает ситуацию, когда метаболизм нормальный, но регенерация кислорода менее продуктивна, и только Sp1 действует на транскрипцию. Из-за отсутствия pVHL все процессы, стимулирующие пролиферацию, активны, что приводит к несбалансированному потреблению ресурсов. Наша модель показывает, что это состояние совместимо с ростом и размножением клеток, но образование новых кровеносных сосудов происходит значительно медленнее, а глюкозный метаболизм в основном основан на реакции гликолиза. Аналогичное снижение активности относится как к регуляции пути плотных контактов, так и к клеточному внешнему матриксу (ECM). Нельзя исключить, что некоторые наблюдаемые эффекты могут быть смягчены активностью как HIF-2α, так и HIF-3α in vivo.

(iv) Выбивной PHD2.

Белок участвует в опосредованной pVHL и зависимой от кислорода деградации HIF-1α. Кроме того, PHD2 участвует в гидроксилировании субъединицы Rpb1 РНК-полимеразы II, что делает возможным ее транслокацию в области ядра с меньшей концентрацией хроматина.Когда он нокаутирован, деградация HIF-1α может продолжаться альтернативными путями, как показано в эксперименте с нокаутом pVHL, и активность РНК-полимеразы II выше, даже если rpb7 все еще может быть инактивирован pVHL.

(v) Выбивание MCTS1.

MCTS1 объединяет некоторые реакции, участвующие в пути р53-зависимой деградации HIF-1α (таблица 2). Чтобы выполнить это отключение, мы стерли необходимый маркер в mdm2, сделав предварительное условие недостаточным для включения переходов MCTS. p53 не деградирует и может продолжать свой проапоптотический сигнал.С другой стороны, механизм деградации HIF-1α также отключается, что приводит к повышенной транскрипционной активности HIF-1α.

(vi) t_97 нокаут.

Это переход АТФазы, позволяющий модели имитировать потребление кислорода для синтеза АТФ. Если этот переход неактивен, кислород накапливается бесконечно, и АТФ не регенерируется после нескольких шагов моделирования. Вначале АТФ образуется на первом этапе гликолиза, но затем снова расходуется. В какой-то момент в этих реакциях нет доступного АТФ, чтобы позволить системе восстановить баланс потребляемого АТФ.После нескольких шагов моделирования кислород достигает высокого уровня из-за более медленного потребления в процессе регулирования PHD2. Биологически это означает, что обмен веществ останавливается, и клетка не способна создавать энергию для выживания. В модели нет накопления, кроме глюкозы. Некоторые процессы создания кислорода также заблокированы из-за отсутствия АТФ, например. т_15, т_41 и т_57.

(vii) Выбивание GSK3β.

Этот фермент участвует в отрицательной регуляции гликогенсинтетазы (GS) и инактивируется при фосфорилировании.Когда GSK3β нокаутирован, гликоген непрерывно вырабатывается за счет того, что фермент остается в активном состоянии. В реальном организме существуют альтернативные формы GSK3β, способные инактивировать ГС, поэтому эффект будет менее резким. GSK3β также участвует в деградации HIF-1α, вызывая его фосфорилирование и последующее убиквитинирование. Он также участвует в деградации β-катенина, где отвечает за первичное фосфорилирование. В случае нокаута, даже если Jade1 может быть стабилизирован с помощью pVHL, эффект будет аналогичен нокауту Jade1, где β-catenin свободен для продолжения пролиферации, стимулируя транскрипционную активность.

Обсуждение

Мы начали с базовой модели реакции на гипоксию [12] и расширили исходную сеть функциональными данными, полученными из литературы, чтобы представить полное описание пути взаимодействия pVHL в соответствии с текущими знаниями. Синдром ВХЛ характеризуется образованием опухолей и кист, поражающих различные отделы и ткани организма. Действительно, pVHL является опухолевым супрессором, функции которого связаны с ингибированием пролиферации и выживания, роста и стабильности внеклеточного матрикса и микротрубочек, а также клеточной полярности и миграции.База данных IntAct сообщает о более чем 200 предполагаемых взаимодействующих с pVHL, и для большинства из них детали взаимодействия и функции остаются в значительной степени неизвестными. Мы решили смоделировать взаимодействия pVHL в достоверном клеточном контексте, при этом активность многих белков происходит одновременно. Основная идея состояла в том, чтобы создать новое вручную составленное описание PN всего пути заболевания VHL, включая глюкозный метаболизм и сигнальные пути. Модель спроектирована как стандартная PN и состоит из 238 переходов и 323 мест, соединенных 801 ребром.Биологически реалистичная модель PN должна быть покрыта T-инвариантами, что означает, что каждый переход в модели должен быть включен в T-инвариант, и каждый инвариант должен иметь биологическое значение [31]–[47]. Мы использовали Т-инвариантный анализ для проверки надежности модели. Всего было вычислено 393 Т-инварианта плюс 10 тривиальных инвариантов, которые были исключены из анализа. Они были сгруппированы в 44 кластера, а с помощью Т-инвариантов переходы были сгруппированы в 40 MCTS. Полученная модель связна, покрыта Т-инвариантами, каждый из которых имеет биологический смысл.Анализ MCTS использовался для определения наиболее частых критических переходов, происходящих в модели. Это конкретное подмножество в дальнейшем использовалось для планирования экспериментов по выбиванию in silico , а также для проверки модели и анализа ожидаемого биологического поведения. Затем модель была использована для выполнения in silico экспериментов по отключению определенных переходов во время качественного сетевого анализа. Наши результаты показали, что модель способна представлять важные переходы, отражающие реальные биологические результаты, т.е.е. переходы с участием таких соединений, как кислород или АТФ, правильно инактивируются при определенных обстоятельствах, как и ожидалось из библиографических данных. Биологические энергетические реакции (например, образование АТФ из АДФ) моделировались как P-инварианты. Хотя сеть намеренно не покрыта P-инвариантами, P-инвариантный анализ использовался для проверки всех смоделированных переходов с потреблением энергии. Балансы АТФ и НАДН казались постоянными во время моделирования, с нерелевантными P-инвариантами, расположенными в системе Hur.Это приближение было использовано для проверки Hur-зависимой регуляции VEGF с результатами в соответствии с [50]. Специфический нокаут pVHL предполагает, что одного этого белка недостаточно для полной инактивации HIF-1α. Действительно, другие параллельные пути деградации HIF-1α способствуют своего рода резервной регуляции клеточного цикла. Напротив, оказалось, что простой делеции pVHL достаточно, чтобы усилить все другие ее ингибирующие функции, проявляя сходные эффекты с патологическими симптомами VHL. Действительно, дестабилизация ВКМ увеличивает миграцию клеток в другие области, способствуя возникновению метастазов в случае опухолевых клеток. Кроме того, зависимое от pVHL ингибирование образования плотных контактов с помощью aPKCζII участвует в более легком отслоении клеток. Взаимодействия Nur77 можно считать хорошим примером патологических эффектов. Является стимулятором выработки проопиомеланокортина, предшественника адренокортикотропного гормона. При чрезмерном высвобождении он способствует перепроизводству адренергических нейротрансмиттеров надпочечниками. Приближается к клиническому состоянию, известному как синдром Кушинга. Известно, что в долгосрочной перспективе дерегуляция Nur77 вызывает опухоли гипофиза и надпочечников [51], [52].Это происходит при феохромоцитоме, которая является одним из основных проявлений болезни ВХЛ. Мы предполагаем, что непрерывная транскрипция VEGF, даже в ситуациях, когда HIF-1α (но не Sp1) нокаутирован, может быть объяснением клинических исследований, в которых препараты, направленные на VEGF, оказались эффективными при лечении рака почки, как сообщалось в [53]. ]. Хотя мы использовали только подтвержденные литературные данные, Nur77 может быть вовлечен в другие системы регуляции, которые не учитывались в нашей модели. Переходы для стабилизации фибронектина pVHL показывают поведение, которое согласуется с биохимическими экспериментами, иллюстрируя полную отмену стабилизации ECM и повышенное действие матриксной металлопротеиназы.Хотя результаты обнадеживают, представленная модель нуждается в дальнейших улучшениях, поскольку стандартные PN не обеспечивают ни полного контроля перехода, ни модуляции ферментативной активности. Тем не менее, благодаря ручному курированию нашу модель можно использовать для планирования новых экспериментов in vitro и in vivo . Результаты достаточно убедительны, чтобы предложить нашу модель в качестве комплексной модели пути для моделирования основных функций pVHL.

Мутация гена VHL типа 2B снижает дозировку HIF in vitro и in vivo

Изменения гена VHL у пациентов с почечно-клеточным раком: новые очаговые мутации или мутации-основатели и неравновесное сцепление

Дефицит VHL вызывает энхансерную активацию онкогенов при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме в 2012 г. по всему миру (1).Поскольку большинство зПКР являются радиохимиорезистентными, у пациентов с метастатическим зПКР показатель общей пятилетней выживаемости составляет 8% (2). Хотя таргетная терапия, ингибирующая ангиогенез и пути mTOR, может привести к начальному контролю над опухолью, у большинства пациентов резистентность развивается менее чем через год (3, 4). Таким образом, необходимо лучшее понимание молекулярных зависимостей и уязвимостей ccRCC для разработки новых терапевтических стратегий для пациентов, которым не удается стандартное лечение.

Потеря опухолевого супрессора фон Хиппеля-Линдау ( VHL ) является определяющим признаком скПКР (5, 6). В сочетании с инактивацией дополнительных опухолевых супрессоров ( Pbrm1, Bap1, Trp53, Rb1 и/или Cdkn2a ) и/или активацией онкогенов ( Myc ) потеря Vhl вызывает спонтанное образование ccRCC в моделях мышей ( 7–11). VHL кодирует убиквитинлигазу E3 (12, 13), которая нацелена на деградацию HIF1α ( HIF1A ) и HIF2α ( EPAS1 ) (14, 15). Потеря VHL при скПКР приводит к конститутивной активации HIF1/2α и последующей трансактивации (16, 17) нижестоящих генов, регулирующих ангиогенез, гликолиз (18), липогенез (19, 20), клеточный цикл (21) и антиапоптоз (22). ).

Большинство сообщений, изучающих активацию транскрипции VHL/HIF, сосредоточены на промоторах, связанных с HIF (23-28). Однако недавние данные свидетельствуют о новой роли дистальных энхансерных элементов в контроле транскрипции VHL/HIF (29, 30). Например, дистальные энхансеры, связанные с HIF2α, активируют протоонкогены MYC (31) и CCND1 (21) и совпадают с аллелями генетического риска ccRCC. Тем не менее, такие исследования сосредоточены на индивидуальных энхансерах, и большинство дистальных элементов в ccRCC остаются в значительной степени неизученными.

Очерчивание глобального регуляторного ландшафта ccRCC cis может также выявить главные регуляторы, участвующие в тканеспецифических патологических процессах. По сравнению с промоторами, которые в значительной степени инвариантны к типу клеток, дистальные энхансеры интегрируют множественные сигналы, зависящие от клона и контекста, удовлетворяя специализированные потребности различных типов клеток и заболеваний (32, 33). При раке такие главные регуляторы часто располагаются рядом с «суперэнхансерами» или «усилителями растяжения», отмеченными длинными участками сигналов h4K27ac (34, 35).Например, специфические для подтипа геномные изменения, такие как EGFRvIII при глиобластоме (36) и EWS-FLI при саркоме Юинга (37), индуцируют энхансеры de novo , вызывая реактивацию основных регуляторов развития, необходимых для самообновления и клонирования. спецификация (36). Хотя было показано, что инактивация VHL модулирует уровни белков различных модификаторов гистонов (например, KDM5C/JARID1C, ссылка 38; HDAC1, ссылка 39; JMJD1A, ссылка 40; JMJD2B, ссылка 40; JMJD2C, ссылка41), влияние этих белковых изменений на специфические эпигеномные локусы остается неясным. Кроме того, предыдущие исследования по профилированию модификаций гистонов при скПКР также были ограничены небольшими размерами выборки (2 случая; ссылка 42), зависимостью от систем in vitro , а также отсутствием интерактомных данных дальнего действия и тестирования функциональных энхансеров для точного определения родственные энхансерные мишени.

В этом исследовании мы создали наиболее полную коллекцию профилей гистонов зПКР на сегодняшний день, аннотируя точное геномное расположение измененных промоторов, энхансеров и суперэнхансеров при зПКР.Используя изогенные клеточные линии с диким типом VHL или без него, мы дополнительно продемонстрировали, что помимо его четко определенной роли в восприятии кислорода, VHL также защищает ландшафт хроматина; его потеря индуцирует рост опухолеспецифических энхансеров вокруг характерных генов ccRCC, таких как ангиогенные и метаболические мишени, посредством стабилизации гетеродимеров HIF2α/HIF1β ( ARNT ) и рекрутирования гистон-ацетилтрансферазы p300 ( EP300 ). Одной важной мишенью эпигенетической активации является ZNF395 , главный регулятор онкогенеза ccRCC.Взятые в совокупности, наши результаты раскрывают эпигенетическую структуру, с помощью которой основная специфическая для ccRCC драйверная мутация, VHL , индуцирует энхансеров de novo , способствуя онкогенной транскрипции.

Результаты

Специфические модификации гистонов могут различать различные категории функциональных регуляторных элементов — h4K4me3 обычно ассоциируется с промоторами, h4K4me1 с энхансерами и h4K27ac с активными элементами (33, 43). Интегрируя сигналы от трех гистоновых меток и аннотированных сайтов начала транскрипции (TSS) GENCODE v19, мы определили активные промоторы как области TSS h4K27ac ⁺ / h4K4me3 ⁺ / ± 2,0 т.п.н. области не перекрываются с промоторами. Сосредоточившись на эпигеномных событиях, характерных для соматических раковых клеток, мы получили клеточные линии пяти первичных опухолей и, в сочетании с коммерческими линиями, исключили пики, не обнаруженные ни в одной из клеточных линий, чтобы уменьшить смешанные эффекты стромальных клеток.В среднем мы наблюдали 80% перекрытие пиков ChIP-seq между первичными опухолями и соответствующими линиями (дополнительная рис. S1B). Используя эти критерии, мы идентифицировали 17 497 предполагаемых промоторов и 66 448 предполагаемых энхансеров (рис. 1А), что сопоставимо с предыдущими исследованиями других типов опухолей (43–45). Количество определенных промоторов и энхансеров достигло насыщения после 4 и 16 образцов, соответственно, что позволяет предположить, что размер выборки 20 (10 пар опухоль/нормальный) является достаточно мощным, чтобы обнаружить большинство цис -регуляторных элементов в ccRCC (дополнительная рис. .S1C и S1D). Анализ основных компонентов (PCA) с использованием первых двух компонентов глобальной интенсивности h4K27ac на промоторах или энхансерах (составляющих 83% и 64% общей дисперсии соответственно; дополнительные рис. S1E и S1F) успешно разделил нормальные и опухолевые образцы, что указывает на то, что геном- широкие первазивные изменения в цис -регуляторных элементах являются отличительной особенностью ccRCC (Fig. 1B).

Опухоли ccRCC с дефицитом VHL демонстрируют аберрантный цис -регуляторный ландшафт. A, Предполагаемые активные промоторы определяются совместным присутствием h4K4me3, h4K27ac и близостью к TSS в пределах 2 т.п.о. Предполагаемые активные энхансеры определяются наличием h4K4me1, h4K27ac и эксклюзивностью промоторов. Анализ PCA B, с использованием всех 17 497 промоторов и 66 448 энхансеров классифицирует норму и опухоль на отдельные кластеры. Идентификаторы пациентов: 1-12364284; 2-17621953; 3-20431713; 4-40

2; 5-57398667; 6-70528835; 7-74575859; 8-77972083; 9-86049102; 10-75416923. C, Тепловые карты показывают уровни h4K27ac измененных промоторов и энхансеров в парной ткани пациента (пациент 40

2; желтый высокий, черный низкий). D, Уровни h4K27ac, доступность хроматина (FAIRE-seq), метилирование ДНК полученных промоторов и энхансеров и экспрессия гена ближайшей днРНК ccRCC сравнивают в нормальных и опухолевых тканях. ***, P < 0,001, двусторонний тест t . E, Показаны следы секвенирования ChIP-seq гистонов (h4K27ac, h4K4me1 и h4K4me3) и секвенирования РНК (RNA-seq) в локусе CCND1 в паре опухоль-нормальный пациент 40

2. Профили ChIP-seq гистонов нормальной ткани почки взрослого человека из дорожной карты Epigenome отображаются над нормальной тканью, созданной с помощью Nano-ChIP-seq, для сравнения.Клеточная линия была получена из опухолевой ткани, и ее гистоновый профиль показан под соответствующей первичной тканью. Известно, что этот энхансер взаимодействует с промотором CCND1 из предыдущего исследования (21) и расположен близко к SNP rs7105934 восприимчивости к RCC (49).

Мы провели дифференциальный анализ для выявления измененных промоторов и энхансеров. Чтобы определить приобретенные или потерянные области, мы применили кратную разницу h4K27ac RPKM ≥ 2, абсолютную разницу ≥ 0,5 и для большей строгости отсутствие изменений в обратном направлении в оставшихся парах опухоль/нормальный (см.S1G для распределения измененных элементов по количеству пациентов). На пороге ≥5/10 пациентов 80% измененных областей достигли статистической значимости ( q -значение <0,1, парный тест t , с поправкой Бенджамини-Хохберга; дополнительная рис. S1H), и при этом же пороговое значение, увеличение доли образцов, отвечающих статистической значимости, достигло седловой точки (дополнительный рис. S1I). Применяя эти критерии, мы получили высоконадежный и полный набор из 4719 приобретенных промоторов, 592 потерянных промоторов, 4906 полученных энхансеров и 5654 потерянных энхансеров (рис.1А и С; Дополнительная таблица S4). Репрезентативные регионы представлены на дополнительном рисунке S2.

Подтверждая надежность этих данных, полученные промоторы и энхансеры демонстрировали повышенную доступность хроматина, измеренную более высокими сигналами FAIRE-seq (46) в опухолевых тканях, чем в нормальных тканях, соответственно ( P < 0,0001), а также снижали метилирование ДНК на основе данных из Атласа генома рака (TCGA; ссылка 47), что согласуется с взаимными отношениями между активными регуляторными областями и метилированием ДНК (рис.1Д). Интересно, что мы также отметили повышенную экспрессию длинных некодирующих РНК (48), прилегающих к приобретенным промоторам и энхансерам, в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями ( P < 0,0001 соответственно). Наконец, мы подтвердили, что многие из наших цис -регуляторных элементов включали области, ранее вовлеченные в скПКР; например, мы наблюдали усиление сигналов h4K27ac и обогащение h4K4me1 в дистальном энхансере CCND1 , перекрывающемся с локусом восприимчивости к RCC (rs7105934; refs. 21 и 49; Рис. 1Е). Наша способность заново открывать этот важный усилитель в нашем беспристрастном профилировании поддерживает надежность наших данных.

Опухолеспецифические энхансеры связаны с признаками скПКР

Для идентификации генов, модулируемых опухолеспецифическими регуляторными элементами, мы распределили энхансеры, используя три подхода. В первом подходе использовались предопределенные правила линейной близости, включающие набор высоконадежных генов (алгоритм GREAT; ссылка 50; дополнительная таблица S5). Анализ пути MSigDB с использованием генов, назначенных GREAT, показал, что полученные энхансеры демонстрируют очень значимую специфичную для ПКР сигнатуру по сравнению с полученными промоторами (значение энхансера q = 3.2 × 10 ⁻²⁶ ; промотор q — значение = 1,5 × 10 ^-1 , биномиальный FDR; Рис. 2А). Хотя полученные промоторы были вовлечены в общие процессы рака (например, клеточный цикл, транскрипцию и метаболизм РНК; полный список путей промоторов см. в дополнительной таблице S6), полученные энхансеры были обогащены специфическими для заболевания особенностями ccRCC, включая сетевую активность HIF1α. , проангиогенные пути (активация тромбоцитов и передача сигналов PDGFRβ) и SLC-опосредованный трансмембранный транспорт (фиг.2А; Дополнительная таблица S7 для полного списка путей энхансера). Примечательно, что сетевая активность HIF1α неизменно фигурирует в качестве одного из пяти основных путей, даже с нарушениями пороговых значений пациентов, используемых для определения полученных энхансеров (≥3–8 пациентов; дополнительная таблица S8).

Enhancer является сигнатурой ccRCC. A, Обогащенные пути, связанные с полученными промоторами и энхансерами, выявленные с помощью GREAT (ранжированы по биномиальному значению FDR q ). Красные столбцы относятся к специфическим для скПКР путям. B, Энхансеры De novo приобретаются в опухолевой ткани ccRCC выше VEGFA . Capture-C подтвердил взаимодействие этого энхансера VEGFA (E) с его промотором (P) в клетках 786-O. Дуги представляют значительные взаимодействия, обнаруженные с помощью r3Cseq (q <0,05). Сигналы h4K27ac этого энхансера после вычитания входных данных сильно коррелируют с экспрессией гена VEGFA (корреляция Спирмена). C, Подобно ( B ), энхансер опухоли de novo взаимодействует с промотором SLC2A1/GLUT1 .

Отдельные гены, связанные с приобретенными энхансерами, включали хорошо известные гипоксические мишени ( VEGFA , рис. 2B; CXCR4 ) и метаболические гены, участвующие в гликолизе, потреблении глутамина и накоплении липидов ( GLUT1/SLC2A1 , рис. 2C). ; HK2, PFKFB3, PLIN2 , дополнительный рисунок S3A) и SLC38A1 (дополнительный рисунок S3B; ссылка 51). Присутствие энхансеров вокруг метаболических ферментов и транспортеров в значительной степени согласуется с метаболическим контекстом ccRCC, который включает повышенный гликолиз и глутаминолиз (19, 52-55). Действительно, анализ генной онтологии (GO) полученных энхансеров сильно отразил характерные метаболические изменения, связанные с ccRCC, включая активность трансмембранного транспортера монокарбоновой кислоты (биномиальное значение FDR q = 1,6 × 10 ^-10 ; дополнительная рис. S3C).

Мы также использовали второй метод назначения гена-энхансера, основанный на корреляции между сигналами h4K27ac и экспрессией генов в пределах одного и того же топологически ассоциированного домена (TAD; ссылка 34). Используя q -значение <0.05 на основе корреляции Спирмена мы назначили 2311 полученных энхансеров 2186 мишеням, кодирующим белок (дополнительная таблица S9). Обнадеживает, что сигналы h4K27ac многих полученных энхансеров сильно коррелируют с экспрессией генов их предполагаемых генов-мишеней. Например, уровни h4K27ac энхансера VEGFA показали высокую корреляцию с экспрессией гена VEGFA ( r = 0,83, корреляция Спирмена), тогда как сигналы h4K27ac энхансера SLC2A1 сильно коррелировали с экспрессией гена SLC2A1 9041 ( r = 0,83, корреляция Спирмена). г = 0.72, корреляция Спирмена; рис. 2Б; Дополнительный рис. S3D). Подобно подходу GREAT, корреляционный подход TAD также выделял гипоксию (Krieg_Hypoxia_not_via_KDM3A, значение FDR q = 7 × 10 ⁻¹²⁰ ) и метаболизм (Chen_Metabolic_Syndrome_Network, значение FDR q = 2 × 410 94 94 ). ) как высокообогащенные пути (дополнительная таблица S10).

В-третьих, для независимой проверки подходов GREAT и TAD в конкретном контексте ccRCC мы экспериментально исследовали интерактом опухолеспецифических энхансеров ccRCC, выполнив анализы Capture-C (56).По сравнению с другими методами захвата хроматина Capture-C предлагает как высокое разрешение (до разрешения в один килобайт), так и высокую пропускную способность опроса определяемых пользователем областей (обычный рабочий диапазон 10–500 областей). Мы разработали зонды против подмножества из 56 полученных энхансеров и исследовали их взаимодействие с генами, кодирующими белок, в клетках 786-O. Каждая пара ген-энхансер, обнаруженная с помощью Capture-C, была дополнительно отфильтрована по корреляциям между экспрессией гена и уровнями h4K27ac (значение q < 0. 05). 56 полученных энхансеров были соединены с 36 генами, кодирующими белок (дополнительная таблица S11), из них 58% были предсказаны GREAT, а 80% — корреляциями генов в пределах TAD. Среднее расстояние взаимодействий, обнаруженных Capture-C, составляло 16 КБ, а 83% взаимодействий приходилось на окно размером 100 КБ (дополнительный рисунок S3E). В качестве наглядного примера Capture-C подтвердил взаимодействие между энхансером VEGFA и TSS VEGFA на расстоянии ~100 т.п.н. (рис. 2B), а также взаимодействие между энхансером SLC2A1 и его промотором (рис.2С). Взятые в совокупности, эти данные подчеркивают специфическую для заболевания природу энхансерных элементов (33) и важную роль нарушения функции энхансера в модулировании патологии ccRCC.

Опухолевые суперэнхансеры Идентификация

HIF2α обогащен энхансерами VHL -чувствительных опухолей. A, Анализ мотивов полученных энхансеров с использованием HOMER выявил значительное обогащение семейства AP1, семейства ETS, NF-κB и HIF1α/2α (гипергеометрический тест). Потерянные энхансеры использовали в качестве фона при поиске мотивов для идентификации опухолеспецифических факторов транскрипции. B, Экспрессия белков предполагаемых факторов транскрипции, обогащенная полученными энхансерами, в 9 линиях опухолевых клеток (T; 4 коммерческих клеточных линии и 5 клеточных линиях, полученных от пациентов) и 2 нормальных клеточных линиях (N). ACHN представляет собой папиллярную клеточную линию ПКР. C, ChIP-seq подтвердили обогащение факторов транскрипции (TF) в приобретенных энхансерах по сравнению с утраченными энхансерами. D, Экспрессия белков факторов транскрипции показана в клетках 786-O и 12364284 с VHL дикого типа и без него. E, Связывание фактора транскрипции в VHL -чувствительных полученных энхансерах показывает обогащение HIF2α и HIF1β в энхансерах с истощением h4K27ac (красный) по сравнению с областями с обогащением h4K27ac (черный) после восстановления VHL .Данные F, ChIP-seq показывают распределение экзогенного связывания HIF1α и эндогенного HIF2α с измененными промоторами и энхансерами в клетках 786-O, которые были генетически сконструированы для сверхэкспрессии HIF1α. G, ChIP-seq показывает распределение эндогенного связывания HIF1α и HIF2α с измененными промоторами и энхансерами в клетках 40

2. H, Связывание фактора транскрипции в VHL-чувствительных энхансерах показывает более высокое обогащение HIF2α, чем HIF1α в энхансерах с истощением h4K27ac после восстановления VHL (красный) по сравнению с областями с обогащением h4K27ac после восстановления VHL (черный). I, Пример чувствительного к VHL энхансера вблизи UBR4 , связывающего только HIF2α, но не связывающего HIF1α. J, Пример VHL-чувствительного суперэнхансера, близкого к CMIP , связывающего только HIF2α, но не связывающего HIF1α.

Для дальнейшего изучения занятости хроматином этих факторов мы создали профили связывания ChIP-seq клеток c-Jun, ETS1 и NF-κB и повторно исследовали профили связывания HIF2α, HIF1α и HIF1β из предыдущей литературы (21, 30), все выполнено в ячейках 786-O.Следует отметить, что клетки 786-O утратили эндогенную экспрессию HIF1α из-за геномной делеции, HIF1α ChIP-seq была выполнена на клетках 786-O, подвергшихся генетическим манипуляциям для повторной экспрессии белка HIF1α (30). Результаты ChIP-seq показали, что все шесть транскрипционных факторов проявляли повышенную занятость в приобретенных энхансерах по сравнению с потерянными энхансерами, подтверждая предсказания HOMER (Fig. 5C).

Чтобы определить, какие из этих транскрипционных факторов могут напрямую зависеть от VHL , мы затем сравнили экспрессию их белков в VHL -мутантных изогенных клеточных линиях с восстановлением дикого типа — VHL и без него.Как показано на рис. 5D, восстановление VHL последовательно подавляло экспрессию HIF2α как в 786-O, так и в 12364284 клеточных линиях, но уровни белка других факторов демонстрировали противоположные тенденции между двумя клеточными линиями, подразумевая, что среди шести исследованных факторов белок HIF2α экспрессия была наиболее зависимой от VHL. Действительно, подтверждая важную роль HIF2α в VHL-зависимом ремоделировании энхансера, только HIF2α и HIF1β были значительно обогащены энхансерами, демонстрирующими VHL-зависимое истощение h4K27ac (фиг. 5Е). Более того, среди всех известных мотивов в базе данных HOMER HIF2α был наиболее обогащенным мотивом в VHL-чувствительных энхансерах, демонстрирующих истощение h4K27ac ( P = 1 × 10 ^-11 ; дополнительная таблица S16).

Напротив, HIF1α не был обогащен энхансерами, демонстрирующими истощение h4K27ac (фиг. 5E). Несмотря на общие с HIF2α многие сайты связывания, HIF1α преимущественно локализуется в проксимальных областях промотора, тогда как HIF2α часто занимает интроны и межгенные области в клетках 786-O (дополнительная рис.S8B), что согласуется с промоторной оккупацией HIF1α и энхансер-центрической оккупацией HIF2α (рис. 5F). Полученные энхансеры демонстрировали занятость HIF2α в два раза больше, чем опухолеспецифические промоторы ( P < 1 × 10 ^-16 , тест пропорций) в клетках 786-O, что позволяет предположить, что HIF2α может играть большую роль в регуляции энхансеров, чем промоторы.

Чтобы распространить эти данные о характере занятости HIF1α и HIF2α на систему, которая экспрессирует эндогенные уровни обоих факторов, мы затем выполнили HIF1α и HIF2α ChIP-seq в 40

2 клетках ccRCC, которые обильно коэкспрессируют обе субъединицы HIFα (рис. 5Б). Подобно 786-O, в клетках 40

2 HIF1α демонстрировал преимущественную занятость в проксимальных областях промотора, тогда как большая часть HIF2α была обнаружена в дистальных областях (интроны и дистальные межгенные области; дополнительная рис. S8C). Более высокая доля сайтов связывания HIF1α, перекрывающихся с полученными промоторами, чем HIF2α (68% HIF1α против 41% HIF2α, P = 0,002, тест пропорций; рис. 5G). И наоборот, более высокая доля сайтов связывания HIF2α, перекрывающихся с полученными энхансерами, чем у HIF1α (29% HIF1α против51% HIF2α, P < 2,2 × 10 91 243 -16 91 244 , тест пропорций). Преимущественная занятость HIF2α в энхансерах была дополнительно подтверждена его более высоким обогащением в энхансерах, демонстрирующих истощение h4K27ac после восстановления VHL , чем HIF1α (фиг. 5H). Конкретные примеры чувствительных к VHL энхансеров, связанных исключительно с HIF2α, но не с HIF1α, включают энхансер вблизи UBR4 (фиг. 5I) и суперэнхансер вблизи CMIP (фиг. 5J). Таким образом, даже в клетках ccRCC, коэкспрессирующих HIF1α/HIF2α, эти результаты свидетельствуют о том, что HIF2α играет большую роль в VHL-опосредованном ремоделировании энхансера, чем HIF1α.

Энхансеры, связанные с HIF2α–HIF1β, модулируют экспрессию генов О-клетки с нокдауном, опосредованным

Наши данные свидетельствуют о том, что механически потеря VHL стабилизирует оккупацию HIF2α в опухолеспецифических энхансерах, которые, в свою очередь, привлекают гистон-ацетилтрансферазу p300 (28, 82) для поддержания ацетилирования h4K27, повышая экспрессию генов, специфичных для ccRCC, таких как ZNF395 (Инжир.7И). Восстановление VHL дикого типа приводило к кодеплеции меток h4K27ac и h4K4me1 и, таким образом, к отмене идентичности активного энхансера в ассоциированных с опухолью энхансерах. По сравнению с HIF1α, ориентированным на промотор, HIF2α преимущественно обнаруживается в энхансерах, что указывает на ключевое различие между HIF1α и HIF2α. Мы также обнаружили, что нокдаун HIF2α siRNA специфически ослабляет активность HIF2α-связанных энхансеров/суперэнхансеров. Интересно, что большинство взаимодействий промотор-энхансер оставались в значительной степени неизменными в результате статуса VHL , предполагая, что эти связи промотор-энхансер в значительной степени стабильны и сформированы заранее.Это согласуется с недавним сообщением, демонстрирующим, что взаимодействия промотора и энхансера остаются в значительной степени неизменными между нормоксией и гипоксией (29). Наше исследование, демонстрирующее влияние VHL на ремоделирование хроматина, также предполагает, что другие раковые гены с высокой мутационной пенетрантностью в зависимости от типа опухоли, такие как BRAF при меланоме (83) и APC при раке толстой кишки (84), также могут модифицировать клеточные эпигеномы, чтобы вызывать обширные, но специфичные для заболевания клеточные изменения, несмотря на то, что эти гены не являются классическими модификаторами хроматина.

Помимо VHL , мутации в других генах, таких как PBRM1, SETD2, ARID1A, SMARCA4, JARID1C и KDM6A/UTX , были зарегистрированы при ccRCC (47, 85), и они, вероятно, усиливают VHL 1. Основные транскрипционные эффекты (86), способствующие гетерогенности фенотипов заболевания (87) и моделей прогрессирования (88). На примере клеток 786-О по крайней мере две другие мутации в этих клетках могут оказывать прямое влияние на хроматин — MLL3 (стр.A3902G) и мутации TP53 с приобретением функции (p.R248W). MLL3 , гистон 3 лизин 4 метилтрансфераза, непосредственно отвечает за формирование энхансерной метки h4K4me1 (89, 90) и играет критическую роль в регуляции энхансера (91). Мутанты TP53 с приобретением функции также аберрантно связываются с хроматином, особенно рядом с метилтрансферазами MLL1 и MLL2 , потенциально способствуя росту опухоли посредством дерегуляции хроматина (92). Помимо мутаций, также известно, что структурные варианты изменяют энхансеры посредством захвата энхансера (93) или увеличения числа копий (94) при других видах рака.Учитывая множество драйверных и свидетельских мутаций при ccRCC, маловероятно, что только VHL может объяснить все эпигеномные изменения, наблюдаемые в этом типе опухоли. Тем не менее, путем интеграции данных по нескольким клеточным линиям скПКР наши данные позволяют предположить, что инактивация VHL , вероятно, составляет почти треть (32%) всех полученных энхансерных областей, подтверждая его роль в качестве доминирующего фактора эпигенетических аномалий при скПКР, несмотря на наличие других генетических изменений.

Наши эпигенетические карты содержат источник как хорошо проверенных, так и неохарактеризованных мишеней, которые могут способствовать онкогенезу скПКР. Мы обнаружили значительное увеличение энхансеров вокруг хорошо охарактеризованных мишеней, связанных с гипоксией (ссылка 95; VEGFA, CXCR4 , ссылка 96; HK2 ), мембранных переносчиков, опосредованных SLC ( SLC2A1, SLC2A2, SLC38A1 , ссылка 97). ), семейство SLC16A (98) и адипогенез ( PLIN2 , ссылки 51, 99). Новые мишени, обнаруженные в этом исследовании, включают SMPDL3A , который может быть еще одним важным онкогеном, специфичным для ccRCC, учитывая его роль в метаболизме липидов и холестерина (61, 100).Гены, связанные с потерянными суперэнхансерами, которые можно было идентифицировать только с парами нормальная-опухоль, связаны с потенциальными опухолевыми супрессорами ( EHF, MAL, GCOM1 и HOXB9 ), которые требуют дальнейшего изучения.

Одним из важных результатов этого эпигеномного исследования является онкогенная потребность в ZNF395 при скПКР. ZNF395 также известен как HDBP2 (101) или фактор связывания папилломавируса (PBF; ссылка 102). ZNF395 необходим для дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в адипоциты путем взаимодействия с PPARγ2 для стимуляции адипогенеза (103).Было показано, что ZNF395 связывается с промоторами гена Хантингтона (101) и генов, индуцированных интерфероном, и вызывает активацию генов, связанных с раком ( MACC1, PEG10, CALCOCO1 и MEF2C ; ссылка 104). и проангиогенные хемокины, включая IL6 и IL8 в условиях гипоксии (105). В будущих исследованиях еще предстоит выяснить точный механизм, способствующий туморогенной роли ZNF395 .

Ландшафты энхансеров, описанные в этом исследовании, имеют последствия не только для ccRCC.Плохо перфузируемое ядро ​​опухоли делает гипоксию характерной чертой практически всех солидных опухолей (106). Клетки MCF7 в условиях гипоксии (но не нормоксии) имеют сходные профили h4K27ac с 786-O (29). Хотя ZNF395 высоко экспрессируется при ccRCC, его низкая базальная экспрессия может усиливаться при гипоксии при других типах рака, включая глиобластому и рак кожи (104, 105). Нацеливание на ZNF395 или его нижележащие эффекторы в будущих исследованиях может иметь терапевтическое значение как для ccRCC, так и для других гипоксических солидных злокачественных новообразований.Прямое нацеливание на ZNF395 с использованием противораковой вакцины на основе пептидов проходит испытания фазы I у пациентов с саркомой (107–109), что открывает возможность использования иммунотерапии для нацеливания на внеклеточные фрагменты основных ядерных регуляторов. Наше исследование предполагает, что проведение аналогичного исследования при скПКР может иметь смысл. Более того, учитывая недавний прогресс в нацеливании на факторы транскрипции с использованием различных методов, включая малые молекулы и сшитые пептиды (110–112), ингибиторы ZNF395 могут стать важным терапевтическим шагом в лечении скПКР.

Методы

Информация для пациентов

Свежезамороженные нормальные опухолевые ткани были получены из случаев нефрэктомии с одобрения комитетов по этике проведения исследований в учреждениях и с согласия пациентов в соответствии с протоколом 2010/735/B институционального наблюдательного совета. Нормальные ткани брали из участков, удаленных от опухоли. Подробную информацию о пациенте см. в дополнительной таблице S1.

Клеточные линии

Коммерческие клеточные линии (786-O, A-498, HK2 и PCS-400) были приобретены в ATCC.Линии клеток поддерживали в RPMI (Invitrogen) с 10% FBS, за исключением первичных эпителиальных клеток проксимальных канальцев почек, PCS-400, которые содержали в базальной среде для эпителиальных клеток почек (ATCC). Аутентификация клеточной линии была выполнена с помощью анализа коротких тандемных повторов (STR) (Институт рака Сингапура) в 2015 году по общедоступным профилям STR. Анализ на микоплазму проводили с использованием набора для ПЦР MycoSensor (Stratagene).

Создание опухолевых клеточных линий из первичных опухолей

Опухолевые клетки отделяли от первичных опухолей с помощью коллагеназы, высевали и поддерживали в RPMI с 10% FBS.При слиянии от 80% до 90% клетки пассировали в соотношении 1:3. Культивируемые клетки считали успешно иммортализованными после 60 пассажей. Правильное спаривание опухолевых тканей и клеточных линий было достигнуто путем сравнения процентной идентичности однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) на основе направленного секвенирования. Все пары опухолевых клеточных линий показали идентичность > 90%, тогда как перетасовка пар показала идентичность < 80%. Опухоли и клеточные линии из 12364284 и 40

2 показали одинаковые мутации VHL , но ткань 86049102 (названная 86049102T) является мутантной VHL , тогда как родственная клеточная линия 86049102 (названная 86049102L-type2HL-2HL-wild-9002L) представляет собой

Стабильный

Комбинированная делеция Vhl и Kif3a ускоряет образование почечной кисты

Abstract

Считается, что подмножество семейных и спорадических светлоклеточных почечно-клеточных карцином (ccRCC) развивается из кистозных предшественников.Потеря функции гена-супрессора опухоли фон Хиппеля-Линдау ( VHL ) предрасполагает клетки почечного эпителия к потере первичной реснички в ответ на специфические сигналы. Поскольку первичная ресничка подавляет образование почечной кисты, потеря реснички может быть инициирующим событием в формировании скПКР. Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали последствия индуцируемой специфичной для почечного эпителия делеции Vhl вместе с удалением первичной реснички посредством делеции члена семейства кинезинов 3A ( Kif3a ) гена.Мы разработали подход к визуализации на основе микрокомпьютерной томографии, позволяющий проводить количественный лонгитюдный мониторинг кистозной нагрузки, показывая, что комбинированная потеря Vhl и Kif3a сокращает латентный период образования кист, увеличивает количество кист на почку и увеличивает общее количество кистозных образований. груз. В отличие от результатов других кистозных моделей, в кистах Kif3a мутантных мышей не наблюдалось накопления индуцируемого гипоксией фактора 1- α (HIF1 α ), а делеции Hif1a и Kif3a не наблюдалось. повлиять на развитие или прогрессирование кисты.Двойная мутация Vhl/Kif3a также увеличивала частоту кист, которые демонстрировали многослойный эпителиальный рост, что коррелировало с повышенной частотой неправильно ориентированных делений кистозных эпителиальных клеток. Эти результаты опровергают участие HIF1 α в стимулировании роста почечных кист и предполагают, что образование простых и атипичных почечных кист, которые напоминают поражения, предшествующие ccRCC, значительно ускоряются при комбинированной потере Vhl и первичной реснички.

Болезнь Гиппеля-Линдау (ВГЛ) представляет собой аутосомно-доминантное генетическое заболевание, вызываемое наследованием мутантного аллеля гена ВГЛ . Пациенты с болезнью VHL имеют повышенный риск развития почечных кист и двустороннего, многоочагового солидного или кистозно-светлоклеточного почечно-клеточного рака (ccRCC), при которых аллель VHL дикого типа неизменно теряется из-за соматической мутации или молчания гена. ¹ В почках пациентов с заболеванием VHL развивается спектр VHL -дефицитных поражений, которые, вероятно, представляют собой поражения-предшественники солидных и кистозных ccRCC, включая небольшие очаги микро-ccRCC с солидным внешним видом, простые кисты, выстланные одним слоем пролиферирующие эпителиальные клетки и атипичные кисты, содержащие участки многослойного эпителиального роста, напоминающие очаги скПКР. ² Эти данные свидетельствуют о том, что зПКР образует посредством кист-зависимых и кист-независимых путей у пациентов с заболеванием VHL. ³ Ген VHL также биаллельно инактивирован в >90% спорадических случаев скПКР. ⁴ Хотя большинство зПКР имеют солидную морфологию, примерно 5% являются кистозными с небольшими узелковыми скоплениями светлоклеточных опухолевых клеток внутри и между стенками кист, ^5,6 что позволяет предположить, что спорадический зПКР также возникает через кисты- зависимый и цистнезависимый пути.

pVHL опосредует многочисленные биологические активности, в том числе нацеливание на α -субъединицы факторов транскрипции, индуцируемых гипоксией (HIF1 α , HIF2 α и HIF3 α ) для протеолитической стабилизации 4 и протеолитической деградации 7 7 ^{сеть. 8 Эта последняя функция pVHL важна для регуляции первичной реснички, структуры на основе микротрубочек, которая функционирует как сенсорная органелла для многочисленных химических и механических стимулов. 9 Генетические мутации, нарушающие сигнальные функции или структуру первичной реснички, вызывают поликистоз почек. 10 Опухоли ccRCC человека демонстрируют чрезвычайно низкую частоту реснитчатых клеток 11 , а потеря функции VHL в иммортализованных почечных эпителиальных клетках или клеточных линиях ccRC ухудшает образование первичных ресничек. 12–14 Однако делеция Vhl в почечных эпителиальных клетках почки мыши или в культивируемых первичных клетках не вызывает потери первичной реснички, но повышает чувствительность клеток к потере первичной реснички в ответ на стимуляцию фосфоинозитида 3 сигнальный путь -киназы (PI3K) и инактивация киназы гликогенсинтазы 3 β . 15,16 Мутантные кистозные эпителиальные клетки VHL в почках пациентов с заболеванием VHL часто лишены первичной реснички и демонстрируют гиперактивацию сигнального пути PI3K и повышенные уровни фосфорилированной, неактивной киназы гликогенсинтазы 3 β . 15,16 Считается, что потеря реснички является вторичным событием, которое происходит в некоторых мутантных клетках VHL и действует как триггер для инициации образования кист. Комбинированная делеция Vhl и Pten вместе в клетках почечного эпителия мышей, но не одного гена по отдельности, вызывает почечные эпителиальные кисты со сниженной частотой реснитчатых эпителиальных клеток, что подтверждает эту гипотезу. 15 Однако было невозможно сделать вывод, является ли образование кист результатом исключительно потери реснички, совместных эффектов потери реснички плюс потеря Vhl или совместных эффектов потери реснички плюс потеря Vhl плюс активация пути PI3K. Поскольку у мышей Vhl/Pten развились различные доброкачественные новообразования в половых путях, которые потребовали ранней эвтаназии, 17 также не было возможности определить возраст мышей, чтобы определить, способны ли мутантные кистозные поражения Vhl прогрессировать с образованием ccRCC.Здесь мы обращаемся к некоторым из этих ограничений, создавая мышиную модель, допускающую индуцибельную делецию Vhl вместе с генетической абляцией первичных ресничек посредством делеции Kif3a , которая кодирует белковый компонент kinesin-II моторного комплекса микротрубочек. 18}

Потеря функции pVHL вызывает стабилизацию HIF1 α и HIF2 α в эпителиальных клетках кистозных поражений у пациентов с болезнью VHL. ² Недавние исследования показывают, что HIF1 α может играть более общую роль в кистозных поражениях, возникающих при генетических состояниях, отличных от заболевания VHL.HIF1 α , но не HIF2 α , стабилизируется в клетках кистозного эпителия из-за микросредовой гипоксии в крысиной модели поликистозной болезни почек и в тканях человека с поликистозной болезнью почек. ¹⁹ На основании двух моделей образования кист in vitro было высказано предположение, что активация Hif1 α способствует образованию кист. ²⁰ Однако вопрос о том, способствует ли HIF1 α образованию или прогрессированию кистозных поражений, не проверялся на физиологически значимой кистозной модели.Мы проверили эту идею, удаляя Hif1a в модели образования кисты почки с делецией Kif3a .

Результаты. -Cre