Вхл 2019 2018 википедия: ВХЛ в сезоне 2018/2019 — Вики

📖Локомотив Ярославль (ВХЛ) — Википедия

Локомотив
ГородЯрославль, Россия
ЛигаВХЛ
КонференцияЗападный
Основан2011
Сложенный2013
Домашняя аренаАрена 2000 (9070 мест)
Цвета     
Главный тренерПетр Воробьев
Филиалы)Локомотив Ярославль (КХЛ)
Локо Ярославль (MHL)

Локомотив был хоккей на льду команда в Ярославль, Россия. Они играли в ВХЛ, второй уровень российского хоккея. Это был фермерский клуб Локомотив Ярославль из Континентальная хоккейная лига. Он был основан в 2011 после всей команды КХЛ вместе с ее тренерским штабом погиб в авиакатастрофе и состоял из MHL футболисты Локо Ярославль. Когда франшиза снова присоединилась к КХЛ в его 2012–13 сезонбыло решено оставить в составе ВХЛ структура.

В 2013, Локомотив Ярославль решили не допускать свою команду к участию в ВХЛ за 2013–14 сезон. Поэтому клуб ВХЛ «Локомотив» расформировали.

внешняя ссылка

  • Официальный сайт
  • Профиль команды на eurohockey.com
  • v
  • т
  • е
Высшая хоккейная лига
Конференция 1Конференция 2

Дивизион А

Динамо МО
Динамо Санкт-Петербург
Хумо Ташкент
Химик
КРС-БСУ
ORG Пекин
СКА-Нева
Цен Тоу Цзилинь
Звезда Чехов

Дивизион B

Барс Казань
Буран Воронеж
Дизель Пенза
Лада Тольятти
ХК Ростов
Торпедо-Горький Нижний Новгород
ХК Рязань
ХК Тамбов
ЦСК ВВС Самара

Дивизион C

Челмет Челябинск
Горняк Шахтер Учалы
Ижсталь Ижевск
Молот-Прикамье Пермь
Нефтяник Альметьевск
Торос Нефтекамск
Южный Урал Орск
Зауральский курган

 

Дивизион D

Металлург Новокузнецк
Кочевник Нур-Султан
Рубин Тюмень
Сарыарка Караганды
Сокол Красноярск
Торпедо Усть-Каменогорск
ХК Югра
Ермак Ангарск

 

Бывшие команды
  • Ариада Волжск
  • Динамо Балашиха
  • ХК Донбасс
  • ХК Кубань
  • ХК Липецк
  • Кристалл Саратов
  • Крылья Советов
  • Локомотив Ярославль
  • ХК Саров
  • Спутник Нижний Тагил
  • ТДК Тверь
  • Титан Клин
  • Юность Минск
  • Звезда-ВДВ Дмитров
VL сезоны
  • 1992–93
  • 1993–94
  • 1994–95
  • 1995–96
  • 1996–97
  • 1997–98
  • 1998–99
  • 1999–2000
  • 2000–01
  • 2001–02
  • 2002–03
  • 2003–04
  • 2004–05
  • 2005–06
  • 2006–07
  • 2007–08
  • 2008–09
  • 2009–10
ВХЛ сезоны
  • 2010–11
  • 2011–12
  • 2012–13
  • 2013–14
  • 2014–15
  • 2015–16
  • 2016–17
  • 2017–18
  • 2018–19
  • 2019–20
  • 2020–21
Статьи по Теме
  • Российская Суперлига (высший уровень, 1996–2008 гг.)
  • Континентальная хоккейная лига (высший уровень, с 2008 г.)
  • Кубок Братины (трофей победителю)
Этот европейский хоккей на льду командная статья — это заглушка. Вы можете помочь Википедии расширяя это.
  • v
  • т
  • е

ХК Югра Ханты-Мансийск — расписание игр, матчей. Турнирная таблица. Когда играет Югра

03.09    СентябрьЮгра — Металлург4:3
05.09    СентябрьЮгра — Омские Крылья2:1
07.09    СентябрьЮгра — Ермак2:1
09.09  17:00    СентябрьЮгра — Сокол-:-
15.09  17:00    СентябрьЮгра — Рубин-:-
18.09    СентябрьЮгра — Звезда-:-
27.09    СентябрьНефтяник — Югра-:-
29.09    СентябрьИжсталь — Югра-:-
01.10    ОктябрьМолот — Югра-:-
03.10    ОктябрьТорос — Югра-:-
08.10    ОктябрьЮгра — ХК Рязань-:-
10.10    ОктябрьЮгра — Динамо Спб-:-
12.10    ОктябрьЮгра — СКА-Нева-:-
14.10    ОктябрьЮгра — Химик-:-
19.10    ОктябрьЮжный Урал — Югра-:-
21.10    ОктябрьЧелмет — Югра-:-
23.10    ОктябрьЗауралье — Югра-:-
25.10    ОктябрьГорняк-УГМК — Югра-:-
01.11    НоябрьЮгра — Дизель-:-
03.11    НоябрьЮгра — Барс-:-
05.11    НоябрьЮгра — ЦСК ВВС-:-
07.11    НоябрьЮгра — Лада-:-
14.11    НоябрьРубин — Югра-:-
21.11    НоябрьАКМ — Югра-:-
23.11    НоябрьХК Тамбов — Югра-:-
25.11    НоябрьРостов — Югра-:-
27.11    НоябрьБуран — Югра
-:-
01.12    ДекабрьЮгра — АКМ-:-
03.12    ДекабрьЮгра — ХК Тамбов-:-
05.12    ДекабрьЮгра — Ростов-:-
07.12    ДекабрьЮгра — Буран-:-
11.12    ДекабрьЛада — Югра-:-
13.12    ДекабрьЦСК ВВС — Югра-:-
15.12    Декабрь
Барс — Югра-:-
17.12    ДекабрьДизель — Югра-:-
23.12    ДекабрьЮгра — Горняк-УГМК-:-
25.12    ДекабрьЮгра — Зауралье-:-
27.12    ДекабрьЮгра — Челмет-:-
29.12    ДекабрьЮгра — Южный Урал-:-
10.01.2022    ЯнварьСКА-Нева — Югра-:-
12.01.2022    ЯнварьДинамо Спб — Югра-:-
14.01.2022    ЯнварьХимик — Югра-:-
16.01.2022    ЯнварьХК Рязань — Югра-:-
20.01.2022    ЯнварьЮгра — Торос-:-
22.01.2022    ЯнварьЮгра — Молот-:-
24.01.2022    ЯнварьЮгра — Ижсталь-:-
26.01.2022    ЯнварьЮгра — Нефтяник-:-
01.02.2022    ФевральЗвезда — Югра-:-
10.02.2022    ФевральСокол — Югра-:-
12.02.2022    ФевральЕрмак — Югра-:-
15.02.2022    ФевральОмские Крылья — Югра-:-
17.02.2022    ФевральМеталлург — Югра-:-
Позже

Дмитрий Шевченко (спортсмен, хоккей, Казахстан, Россия): новости, биография, статистика спортсмена

Дмитрий Шевченко (спортсмен, хоккей, Казахстан, Россия): новости, биография, статистика спортсмена | Vesti.kz GLbxenZ156nYo5YAwvEI9BJh2UIZJxYWyKVmVuTq Войти через социальную сеть

Пожалуйста, подождите… Укажите email Укажите имя или псевдоним Укажите пароль Для регистрации на сайте Вы должны принять Правила сообщества Для редактирования профиля необходимо авторизоваться на сайте Укажите корректный Email material_dobavlen_v_izbrannoe Добавить в избранное Убрать из избранного Пароли не совпадают Задайте пароль для входа на сайт Хороший пароль должен содержать строчные, заглавные латинские буквы и цифры. Рекомендуется добавлять знаки препинания и задавать длину пароля не менее 8 символов Спасибо за Ваш голос! Добавить +1 Убрать +1 Выберите вариант ответа

Место

Вход на сайт

Войти через социальную сеть:

>

Гражданство
Вид спорта
Хоккей
Амплуа
Спортсмен
Действующий
Да
Команды
Казахстан нп 95
Дата рождения
15 декабря 1995 (25 лет)
Пол
мужской
Рост, см
195
Вес, кг
101

Тренерский штаб команды «Металлург»

Биография

Родился 16 марта 1975 г.
Играл в «Динамо» (Рига) в качестве центрального нападающего.
В 18 лет переехал в Германию, где начал свою карьеру в Frankfurt Lions. Играл за эту команду 5 лет.
В 1999 году Воробьев продолжил карьеру в Krefeld Pinguine более двух лет, а в 2001 году начал играть за действующего чемпиона Германии Адлера Мангейма.
Вернулся в Россию в 2003 году и подписал контракт с «Ладой Тольятти». В 2006 году Воробьев был в составе Магнитогорского «Металлурга» и завершил сезон 2006/07 в Химике Мытищи.
Вернулся в Германию на заре карьеры игрока. Здесь он провел 3 игры с Frankfurt Lions.
В 2010 году в возрасте 35 лет Воробьев завершил карьеру.
В чемпионате Германии сыграл 445 игр и набрал 300 очков (127 + 173), а в чемпионате России провел 231 игру и набрал 92 очка (34 + 58).
Принимал участие в составе юношеской и юношеской сборных России в чемпионате Европы по хоккею среди юниоров (1993) и чемпионате мира по хоккею до 20 лет (1995).
После ухода на пенсию некоторое время выполнял административную работу в сборной России.
В сезоне 2011–12 гг. Дебютировал в качестве тренера молодежной команды «Локо» (Ярославль). В декабре 2011 года Воробьев стал тренером «Локомотива ВХЛ».
В мае 2012 года назначен старшим тренером хоккейного клуба «Металлург Магнитогорск».
В сезоне 2013/14 выиграл Кубок Гагарина в качестве старшего тренера Магнитогорского «Металлурга».
В октябре был назначен главным тренером команды после ухода Майкла Кинана.
В апреле 2016 года в составе «Металлурга» вновь выиграл Кубок Гагарина.
В следующем году «Металлург» во главе с Воробьевым снова вышел в плей-офф, но проиграл СКА 5 игр.
С 2016 года Илья Воробьев постоянно входил в тренерский штаб сборной России, которую возглавляет Олег Знарок.
В апреле 2018 года назначен заместителем главного тренера сборной России. В июне его повысили до должности главного тренера. Также возглавлял тренерский штаб СКА.
В сентябре 2019 года он снова возглавил тренер Магнитогорского «Металлурга», сменив Йозефа Яндача.

Якоб Лилья — Jakob Lilja

Шведский профессиональный хоккейный форвард (1993 г.р.)

Якоб Лиля (родился 23 июля 1993) является шведский профессиональный хоккей на льду вперед в настоящее время играет за Барыс Нур-Султан из Континентальной хоккейной лиги (КХЛ).

Игровая карьера

Лилия дебютировала в Elitserien (ныне SHL), играя за Rögle BK в сезоне 2012–13 Elitserien .

В сезоне 2018–19 Лилья забила 12 голов и сделала 25 передач, набрав 37 очков в 52 играх за « Юргорденс» . Возглавив клуб и заняв 8-е место в ВХЛ по передачам и 10-е место по очкам, он добавил 8 очков в 19 играх плей-офф, чтобы помочь выйти в финал ВХЛ.

Проведя 222 матча в высшем дивизионе SHL, Лилия заинтересовалась клубами НХЛ как незадействованный свободный агент. Позже он согласился продолжить карьеру в Северной Америке в Columbus Blue Jackets , подписав однолетний контракт начального уровня 15 июня 2019 года.

В своем первом сезоне в Северной Америке в 2019–2020 годах Лилья попал в состав «Блю Джекетс» на открытии после тренировочного лагеря и 4 октября 2019 года дебютировал в НХЛ против « Торонто Мэйпл Лифс» . Учитывая роль на четвертой строчке, Лилья появилась в 37 игр в регулярном чемпионате, в которых забиты 2 гола и 5 очков. Он разделил сезон с филиалом АХЛ, Cleveland Monsters , набрав 13 очков в 25 соревнованиях.

Получив разрешение от «Блю Джекетс» найти новую команду во время перерыва в сезоне НХЛ из -за пандемии COVID-19 , Лиля поехала играть в Казахстан после того, как он подписал годовой контракт с Барысом Нур-Султаном. КХЛ 24 июня 2020 года.

Дело о нападении

5 марта 2015 года Лиля, играя за Рёгле БК в Аллсвенскане , проверила сзади в шею игрока « Мальме Редхокс » Йенса Олссона , за что получил дисквалификацию на 10 игр. Позже инцидент был подан в суд по обвинению в нападении, где 10 июля 2018 года Верховный суд Швеции после того, как дело впервые было рассмотрено нижестоящим окружным судом Мальмё, приговорил Лилю к одному месяцу условно.

Статистика карьеры

Рекомендации

Заметки

Внешние ссылки

<img src=»//en.wikipedia.org/wiki/Special:CentralAutoLogin/start?type=1×1″ alt=»» title=»»>

PROTAC: большие возможности для научных кругов и промышленности

AHR

Арилуглеводородный рецептор (AHR) — это активируемый лигандом фактор транскрипции, который принадлежит к семейству bHLH / PAS (основная спираль-петля-спираль / Per-Arnt-Sim) хемосенсоров. 106,107 Он опосредует многие из токсических и канцерогенных эффектов канцерогенов окружающей среды, включая хлоракне, истощение, тератогенность, иммунотоксичность, развитие опухолей и канцерогенность. AHR связывает свой лиганд, как полициклический ароматический углеводород, и инициирует ферменты, метаболизирующие ксенобиотики, такие как цитохром P450, с последующим образованием аддуктов ДНК.Хотя физиологическим расстройствам, связанным с AHR, уделяется много внимания, роль AHR в этих патологических процессах еще предстоит четко изучить из-за отсутствия мощных химических зондов. 108

Группа Кима недавно обнаружила, что апигенин, натуральный продукт, содержащийся во фруктах, растениях и меде, напрямую взаимодействует с AHR (рис. 5). Затем они предположили, что PROTAC на основе апигенина могут быть полезными молекулярными зондами для изучения биологии AHR. 108 Для создания PROTAC, нацеленных на AHR, они сначала выбрали положение на апигенине для присоединения лиганда VHL.После модификации свободных гидроксильных групп ацетильными группами было обнаружено, что все апигенины сохраняют способность ингибировать AHR после ацетилирования. Они связали пентапептидный фрагмент, полученный из фактора, вызывающего гипоксию (HIF) -1α, лиганда VHL, с апигенином или бензилированным апигенином. Api-Protac-II эффективно индуцировал деградацию AHR, в то время как деградация не наблюдалась с Api-Protac-I. Они также исследовали деградацию AHR, слитого с усиленным зеленым флуоресцентным белком (eGFP). Их результаты показали, что Api-Protac-II можно использовать в качестве зонда для изучения биологии AHR.

Рис. 5

Представитель PROTAC AHR.

ALK

Киназа анапластической лимфомы (ALK) представляет собой тирозинкиназу подсемейства киназ инсулиновых рецепторов (IR). 109 Онкогенная активация ALK тесно связана с возникновением и развитием многих видов рака человека, включая диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), анапластическую крупноклеточную неходжкинскую лимфому (ALCL), плоскоклеточный рак пищевода (ESCC), воспалительная миофибробластическая опухоль (IMT), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), почечно-клеточный рак (RCC), нейробластома, рак щитовидной железы, рак яичников, рак толстой кишки и рак груди. 110,111,112,113,114,115 ALK активируется в основном посредством трех различных механизмов, и хромосомные транслокации являются наиболее распространенными генетическими изменениями. Идентифицировано около 30 различных типов слитого белка ALK, и среди них слитые формы NPM-ALK, EML4-ALK, KIF5B-ALK и TGF-ALK обычно обнаруживаются при различных типах рака, включая ALCL, NSCLC и DLBCL. 116 Замещающие мутации являются вторым механизмом активации ALK, а точечные мутации в киназном домене (F1174L и R1275Q) наиболее часто наблюдаются при нейробластоме. 117 Амплификация и сверхэкспрессия гена — третий механизм активации ALK, о котором также сообщалось при многих типах рака человека. 118,119 На сегодняшний день пять ингибиторов ALK, включая алектиниб, бригатиниб, церитиниб, кризотиниб и лорлатиниб, были одобрены FDA для лечения ALK-положительного НМРЛ. 120 Несмотря на первоначальный ответ на эти ингибиторы, лекарственная устойчивость наблюдается в течение 1-2 лет у большинства пациентов. 120,121 Таким образом, срочно необходимы новые терапевтические подходы для преодоления лекарственной устойчивости.

В 2018 году группа Натанаэля С. Грея разработала два ALK PROTAC (TL13–12 и TL13–112). Эти два PROTAC были конъюгированы с ингибиторами ALK (церитинибом и TAE684) и помалидомидом с помощью лайкеров полиэтиленгликоля (PEG) разной длины (фиг. 6). 122 Эти PROTAC индуцировали мощный нокдаун ALK в клетках NSCLC h4122 (EML4-ALK), клетках ALCL Karpas 299 (NPM-ALK), клетках ALCL SU-DHL-1 (NPM-ALK) и клетках NB (F1174L / R1275Q ALK), который в то же время поддерживал подавление передачи сигналов нижестоящего уровня ALK.Кроме того, эти PROTAC способствовали деградации других киназ (FAK, Aurora A, FER и RSK1) с помощью анализа протеомного профилирования.

Рис. 6

Типичные PROTAC-ы ALK.

В том же году Jian Jin и его коллеги сообщили о двух нацеленных на ALK PROTAC, MS4077 и MS4078, посредством соединения церитиниба и помалидомида с двумя отдельными линкерами (рис. 6). 123 Помимо разложения NPM-ALK и EML4-ALK, MS4077 и MS4078 могут ингибировать фосфорилирование ALK и STAT3 в зависимости от концентрации и времени как в SU-DHL-1 (клетки ALCL, содержащие NPM-ALK), так и в NCI- клетки h3228 (клетки NSCLC, несущие EML4-ALK).Кроме того, MS4077 и MS4078 показали сильную антипролиферативную активность в клетках SU-DHL-1. Кроме того, MS4078 продемонстрировал хорошую экспозицию в плазме в фармакокинетическом исследовании на мышах, и тестируемые мыши хорошо переносили дозу 50 mpk (мг / кг).

Впоследствии Jong Yeon Hwang и его коллеги сообщили о TD-004, который состоит из церитиниба и лиганда VHL E3 (рис. 6). 40 TD-004 продемонстрировал превосходную деградацию ALK и ингибирование роста клеток SU-DHL-1 и h4122.Кроме того, TD-004 резко уменьшил размер опухоли в модели мыши с ксенотрансплантатом h4122 in vivo.

AR

Нарушение рецептора андрогенов является основной движущей силой рака простаты. 124 Лекарствами первой линии для лечения рака простаты были конкурирующие антагонисты, такие как энзалутамид, которые могли ингибировать транскрипционную активность AR. Однако после длительного воздействия этих антагонистов у большинства пациентов в конечном итоге разовьется лекарственная устойчивость. 125

Полученный из энзалутамида, PROTAC, нацеленный на AR, названный ARCC-4, был описан Крюсом и его коллегами в 2018 году 126 (рис.7). ARCC-4 является высокоэффективным деструктором с низкой наномолярной активностью разложения, и его DC 50 (полумаксимальные концентрации разложения) составляли 5 нМ. Более того, ARCC-4 продемонстрировал ингибирующее действие на пролиферацию опухолевых клеток простаты и способность разрушать клинически значимый мутантный рецептор андрогенов. Кроме того, для параллельного сравнения энзалутамида и ARCC-4 использовались различные клеточные модели лекарственной устойчивости рака простаты.Например, ARCC может снизить уровень AR (~ 3,5 раза при 10 мкМ) в клетках LNCaP, сконструированных для сверхэкспрессии мутантного AR-F876L (LNCaP / F876L), в то время как AR в клетках, обработанных энзалутамидом, значительно увеличился (~ 17,5- сложить при 10 мкМ). Другие точечные мутации AR у пациентов, получавших терапию, направленную на AR, также эффективно деградировали, включая H874Y, M896V, T877A, L702H. Следовательно, ARCC-4 продемонстрировал лучшие антипролиферативные эффекты в среде мутанта AR, в то время как энзалутамид оказался неэффективным.

Фиг.7

Типичные PROTACs, разрушающие лекарственно-устойчивый AR.

Arvinas разработал другой PROTAC, нацеленный на AR (ARV-110), который продемонстрировал высокую эффективность разрушения как мутантов AR, так и AR после перорального введения (фиг. 7). ARV-110 может разрушать 95–98% AR в различных клеточных линиях, обычно используемых в исследованиях рака простаты. АРВ-110 продемонстрировал сопоставимую эффективность при более низких дозах по сравнению с энзалутамидом в моделях AR дикого типа. При оценке на моделях приобретенной и внутренней резистентности n рост опухоли блокировался на 70% и 100%, соответственно, после лечения АРВ-110.АРВ-110 вошел в фазу 1 клинических испытаний, и предварительные данные показали удовлетворительную безопасность и переносимость у пациентов. Таким образом, АРВ-110 будет многообещающей стратегией лечения пациентов с метастатическим устойчивым к кастрации раком простаты (CRPC), которые получали стандартную терапию.

BCL2

BCL2 является ключевым членом семейства BCL2 и регулирует гибель клеток (апоптоз), индуцируя (проапоптоз) или ингибируя (антиапоптоз). BCL2 классифицируется как онкоген из-за его важной роли как антиапоптотических белков. 127 При нарушении регуляции BCL2 могут возникать различные виды рака, включая рак легких и лимфомы. Пирс Бломбери и его коллеги обнаружили появление новой мутации, устойчивой к венетоклаксу (BCL2 F104I) в фолликулярной лимфоме. Более того, было трудно нацеливаться на BCL2 из-за межбелкового взаимодействия (PPI) с Bcl-xl. Таким образом, PROTAC открывают перспективы для разработки новых ингибиторов BCL2, преодолевающих ИПП и лекарственную устойчивость.

О первом ухудшении состояния BCL2 сообщили Чжан и его коллеги в 2019 году.сконструированные PROTAC для опосредованных α-спиралью мишеней PPI для деградации BCL2 128 (рис. 8). Наиболее эффективный и селективный PROTAC, C5, разрушал BCL2 с DC 50 3,0 мкМ и демонстрировал ингибирование клеточной пролиферации, обусловленное эффективностью деградации.

Рис. 8

Представитель PROTAC, нацеленный на BCL2.

Несмотря на разработку деструкторов BCL2, не было никаких документов об эффективных PROTAC, разрушающих лекарственно-устойчивый BCL2. 129,130 ​​

BCL6

Транскрипционный фактор B-клеточной лимфомы 6 (BCL6) является членом семейства bric-a-brac, tramtrack, wide complex / poxvirus zinc finger (BTB / POZ).Он взаимодействует с тремя корепрессорами (т.е. BCoR, SMRT и NCoR) и имеет домены BTB, RD2 и цинковые пальцы. 131 BCL6 необходим для образования В-клеток зародышевого центра и дифференцировки Т-лимфоцитов. 132,133 Кроме того, было обнаружено, что он участвует в дифференцировке и пролиферации диффузных больших B-клеточных лимфом (DLBCL) и рака фолликулярной лимфомы посредством ряда генетических изменений. 134,135 Таким образом, BCL6 рассматривается как эффективная терапевтическая мишень для терапии аутоиммунных заболеваний и рака. 136 Хотя в настоящее время сообщается, что беспорядочные связи 137 и пептидомиметические ингибиторы BCL6 на основе 138 показали привлекательный эффект in vitro, они не оправдали ожиданий своих доклинических данных. Необходим мощный и селективный инструмент для понимания BCL6 при заболеваниях человека.

В 2018 году AstraZeneca впервые сообщила о мощном и избирательном нацеленном на BCL6 PROTAC, PROTAC 9 , путем конъюгирования сконструированного лиганда BCL6 и лиганда CRBN талидомида (рис.9). 139 PROTAC 9 показал дозозависимую деградацию BCL6 во всех субклеточных фракциях, но эта деградация не была полной. Кроме того, PROTAC9 не вызывал фенотипический ответ в клетках OCI-Ly1 и SUDHL4 в течение 16-дневного исследования.

Рис. 9

Типичный PROTAC BCL6.

BCR-ABL

Слитый ген BCR-ABL является основной причиной хронической миелогенной лимфомы (ХМЛ). 140 При хромосомной транслокации гена ABL с хромосомы 9 на ген BCR на хромосоме 22 образуется BCR-ABL.BCR-ABL приводил к нарушению пролиферации клеток CML у пациентов за счет активации нижестоящей передачи сигналов. 141 В настоящее время основное внимание уделяется открытию новых лекарств против тирозинкиназы ABL BCR-ABL для лечения ХМЛ, которые по-прежнему являются АТФ-конкурентными ингибиторами. Поэтому ученые разработали несколько ингибиторов тирозинкиназы BCR-ABL, и FDA одобрило их для лечения ХМЛ. В то же время точечные мутации в тирозинкиназном домене BCR-ABL наблюдались у ряда пациентов во время введения ингибиторов киназ и в конечном итоге развивали лекарственную устойчивость.таким образом, было идентифицировано три поколения ингибиторов для борьбы с растущей лекарственной устойчивостью, включая TKI первого поколения, иматиниб; 142 TKI второго поколения, дазатиниб 143 и нилотиниб; 144 и TKI третьего поколения, понатиниб. 145

Первый разлагатель BCR-ABL был разработан Crews и соавторами в 2015 году. На основе босутиниба и дазатиниба был сконструирован BCR-ABL PROTAC, который индуцировал деградацию c-ABL и BCR-ABL в присутствии любого из них. CRBN или VHL E3 убиквитинлигаза 146 (рис.10). После оценки полученный из дазатиниба PROTAC (DAS-VHL) опосредовал четкое (> 65%) снижение c-ABL при 1 мкМ. Дазатиниб-CRBN (DAS-CRBN) PROTAC вызывал деградацию как c-ABL (> 85% при 1 мкМ), так и BCR-ABL (> 60% при 1 мкМ). Деградер BCR-ABL, производный дазатиниба, вызывал ингибирование роста клеток против K562, управляемого BCR-ABL, с полумаксимальной ответной концентрацией (EC 50 ) 4,4 нМ. Эти деструкторы пролили свет на разработку PROTAC для лечения лекарственно-устойчивого заболевания, связанного с BCR-ABL.

Рис. 10

Типичные PROTAC, нацеленные на лекарственно-устойчивый BCR-ABL.

В 2017 году Найто и его коллеги сообщили о втором BCR-ABL PROTAC, полученном из дазатиниба 147 (рис.10). Впоследствии этой группой был разработан новый мощный разрушитель BCR-ABL, названный DAS-IAP. DAS-IAP обнаружил сравнимую активность в ингибировании роста клеток CML и устойчивый антипролиферативный эффект, даже когда лекарство было удалено после краткосрочного лечения. Эти результаты показали, что деструкторы BCR-ABL демонстрируют более длительное ингибирование роста клеток CML, чем ингибиторы киназы ABL.

BET

Рак простаты, который является вторым по величине раковым заболеванием среди мужчин во всем мире, поразил ряд людей. Обычно депривация андрогенов для достижения окончательной ремиссии является наиболее часто используемой стратегией лечения рака простаты. Тем не менее сопротивление кастрации появилось. Для этих CRPC блокаторы передачи сигналов AR были основным лечением с плохим прогнозом. 148 Однако вторичная резистентность неизменно появлялась, хотя CRPC лечили лекарствами, нацеленными на передачу сигналов AR. 149 Недавно было доказано, что ингибирование бромодомена и экстратерминального (BET) семейства белков может нарушать нормальный рост в доклинических моделях CRPC. 150 Имеется много отчетов о разрушителях BET 151 152 153 154 155 156 , и мы сосредоточимся на достижениях BET PROTAC, которые помогли преодолеть лекарственную устойчивость.

В 2016 году ARV-771 был проиллюстрирован Крюсом и сотрудниками с DC 50 <5 нМ в клетках 22Rv1 (рис. 11) в качестве разрушителя пан-BET.ARV-771 вызывал деградацию c-MYC с IC 50 <1 нМ и апоптоз клеток через расщепление PARP. 152 Для оценки эффективности ARV-771 in vivo на модели опухоли VCaP была выбрана модель опухоли VCaP, которая представляет клиническую картину сверхэкспрессии AR после терапии с депривацией андрогенов. После лечения АРВ-771 ингибирование роста опухоли индуцировалось на 60% без значительной потери массы тела. напротив, в группе, получавшей энзалутамид, не наблюдалось ингибирования роста опухоли.В то время как ARV-771 показал более высокую эффективность и преимущества в аспекте лечения CRPC по сравнению с энзалутамидом.

Рис. 11

Типичные PROTAC, нацеленные на лекарственно-устойчивый BET.

В 2015 году группа Брэднера сообщила о другом известном деградиторе BET 151 (рис. 11). Конъюгация JQ1 и помалидомида дала dBET1. Обработка клеток MV4-11 с помощью dBET1 привела к значительной потере BRD4 (> 85%), которая была достигнута при таких низких концентрациях, как 100 нМ после 18 часов обработки, а dBET1 продемонстрировал сильное и превосходное ингибирование пролиферации клеток MV4-11. через 24 часа по сравнению с JQ1.Более того, dBET1 был способен разрушать BRD4 и ингибировать рост опухоли in vivo на мышиной модели ксенотрансплантата задних конечностей с человеческими клетками лейкемии MV4-11, не влияя на вес животного и нормальный общий анализ крови после обработки деградатором. Наблюдалось более значительное подавление MYC по сравнению с группой носителя в иссеченных опухолях.

Для пациентов с тройным отрицательным раком молочной железы (TNBC) химиотерапия обычно дает высокий ответ. 153 Однако остаточные опухоли вызывают высокие показатели метастазирования из-за амплификации локусов MCL1, что было одним из наиболее распространенных генетических изменений в химиорезистентных опухолях.Таким образом, ученые доказали, что MCL1 представляет собой слияние как внутренних, так и приобретенных факторов резистентности у пациентов с TNBC. Резистентность ограничивает эффективность множества противоопухолевых средств. В 2018 году группа Ванга сообщила, что BETd-246, полученный из их ингибитора BET (BETi-211), разрушает белки BET для лечения TNBC (рис.11). BETd-246 индуцировал деградацию BRD2, BRD3 и BRD4 дозозависимым образом. После обработки в течение 1 или 3 часов 30–100 нмоль / л BETd-246 или 10–30 нмоль / л BETd-246, соответственно, белки BRD2-4 были почти полностью истощены.BETd-246 ингибировал рост клеток TNBC с IC 50 <10 нмоль / т и приводил к быстрому и зависящему от времени подавлению белка MCL1 в тестируемых линиях клеток TNBC. При обработке модели TNBC, полученной с использованием ксенотрансплантата (PDX) пациента, с помощью BETd-246 в дозе 5 mpk, внутривенно три раза в неделю в течение 3 недель, наблюдалась эффективная противоопухолевая активность, аналогичная ингибирующим эффектам BETi-211. по 50 mpk, ежедневно, после перорального приема, 5 дней в неделю в течение 3 недель. Это открытие предлагает многообещающий подход к нацеливанию MCL1 на TNBC для преодоления клинической резистентности.

BRD9 и BRD7

BRD9 представляет собой бромодомен-содержащую субъединицу BAF (BRG- / BRM-ассоциированный фактор) 157 , а ее близкий гомолог BRD7 является субъединицей PBAF (полибромассоциированный BAF). 158 BAF и PBAF — это два варианта комплекса SWI / SNF, которые регулируют экспрессию генов, репликацию ДНК и репарацию ДНК. 159 Сверхэкспрессия BRD9 обнаруживается при нескольких формах рака, включая рак шейки матки. 160

В 2017 году группа Браднера разработала и охарактеризовала первый деградатор BRD9, который показал очевидную деградацию BRD9 при 50 нМ 161 (рис.12). Антипролиферативный эффект dBRD9 был немного лучше, чем у ингибитора в линии клеток MOLM-13 человека AML.

Рис. 12

Типичные PROTAC-ы, нацеленные на BRD9 / 7.

В 2019 году Чиулли с соавторами описали деструктор путем конъюгирования лигандов VHL и BRD9. сообщенный деградатор может ухудшить BRD9 и BRD 7 со значениями DC 50 1,8 и 4,5 нМ соответственно 162 (рис. 12). Две клеточные линии, EOL-1 (острый миелоидный эозинофильный лейкоз) и A-204 (злокачественная рабдоидная опухоль), которые чувствительны к ингибированию / деградации BRD9 и зависят от активного комплекса BAF, были отобраны для изучения влияния BRD7, индуцированного деградерами. / 9 деградация жизнеспособности раковых клеток. Метаболически активные клетки называются теми клетками, в которых присутствует клеточный АТФ.Деградер dBRD9 на основе CRBN продемонстрировал цитотоксические эффекты в обеих клеточных линиях со значениями EC 50 , равными 5 нМ (EOL-1) и 90 нМ (A-402), и оказался эквивалентным VZ185 со значениями EC 50 , равными 3 и 40 нМ соответственно.

BTK

Рецептор B-клеток (BCR) является важным регулятором передачи сигналов B-клеток при адгезии, выживании и росте. Для пути BCR незаменим BTK, поскольку он работает как проксимальная сигнальная молекула мембраны для активации и пролиферации В-клеток. 163 В настоящее время ибрутиниб одобрен для лечения MCL и активированного B-клеточного (ABC) -DLBCL путем ковалентного связывания. 164 Однако у пациентов с MCL развилась лекарственная устойчивость после лечения ибрутинибом из-за миссенс-мутации BTK в C481S. 165 Ибрутиниб также потерял эффективность ингибирования роста опухолевых клеток DLBCL в результате мутанта BTK C481S.

В 2018 и 2019 годах Рао и его коллеги впервые сообщили о двух группах новых деструкторов BTK для подавления лекарственно-устойчивого BTK 166 167 (рис.13). Сначала мощный разрушитель P13I продемонстрировал высокую эффективность деградации как дикого типа, так и устойчивого к ибрутинибу C481S BTK, с DC 50 при 9,2 и 30 нМ соответственно. Кроме того, P13I обеспечивает немного лучшее ингибирование роста со значениями GI 50 (концентрация ингибирования роста 50%) 1,5 нМ по сравнению с ибрутинибом в клетках ВТК дикого типа. Более того, P13I эффективно подавлял самофосфорилирование мутанта C481S BTK при низкой концентрации, тогда как ибрутиниб не действовал.Следовательно, P13I может значительно ингибировать рост клеток HBL-1, экспрессирующих мутант BTK C481S со значениями GI 50 приблизительно 28 нМ. При этом ибрутиниб терял ингибирующую эффективность в отношении мутантных клеток ВТК. После этого были созданы еще более оптимизированные BTK PROTAC с большим улучшением растворимости в воде. Среди второго поколения L18I был типичным деструктором, который обладал способностью деградировать различные мутанты C481 BTK со значениями DC 50 ниже 50 нМ. Более того, L18I может обеспечить быструю регрессию опухоли в моделях ксенотрансплантатов мышей, инокулированных клетками C481S BTK HBL-1 с дозой 30 или 100 mpk, и опухоль уменьшилась на 36% и 63% соответственно.Напротив, мыши, которым вводили ибрутиниб, имели серьезную опухолевую нагрузку. Приведенные выше результаты предполагают, что нацеленные на BTK деструкторы PROTAC обладают большим потенциалом ингибирования функций BTK, особенно для лимфом, устойчивых к ибрутинибу.

Рис. 13

Типичные PROTAC, нацеленные на лекарственно-устойчивый BTK.

Практически в то же время группа Crews сообщила о другом BTK PROTAC, MT-802, производном от ибрутиниба 168 (рис. 13). Для BTK дикого типа MT-802 эффективно вызывал деградацию BTK с DC 50 , равным 14.6 нМ, с максимальной деградацией при 250 нМ. MT-802 сохранил ту же эффективность против C481S BTK с DC 50 14,9 нМ. Кроме того, MT-802 был способен снижать фосфорилирование BTK в клетках, выделенных от пациентов с CLL с мутацией C481S, в то время как ибрутиниб не мог.

В 2018 году Натанаэль С. Грей разработал мультикиназный деструктор, который сочетал в себе очень неразборчивый ингибитор киназы с цереблон-связывающим лигандом, и этот мультикиназный деструктор мог разлагать несколько киназ, включая BTK 169 (рис.13). В 2019 году был выпущен более конкретный деградировщик BTK под названием DD-04-015, который эффективно и выборочно разрушал BTK. Обработка DD-04-015 в течение 4 ч привела к эффективному разложению при 100 нМ. Кроме того, DD-04-015 проявлял аналогичный эффект пролиферации клеток по сравнению с RN486 в клетках TMD8 после 3 дней лечения. При дальнейшей оптимизации был разработан свинец DD-03-171 со способностью разлагать C481S-BTK. DD-03-171 продемонстрировал более сильное ингибирование антипролиферации клеток лимфомы мантийных клеток (MCL) in vitro с IC 50 , равным 5.1 нМ и эффективные противораковые эффекты на PDX in viv o .

Pfizer также раскрыл PROTAC, нацеленные на BTK в 2018 году, полученные из ранее описанного ковалентного фенилпиразола для связывания BTK и помалидомида для связывания CRBN 170 (рис. 13). Самый мощный разрушитель BTK приводил к эффективной дегадации BTK с DC 50 5,9 ± 0,5 нМ после 24 часов обработки в клетках Ramos. При оценке in vivo эффективная деградация BTK также наблюдалась в легких и селезенке у крыс, обработанных разрушителем BTK.Применение BTK PROTAC к мутантам BTK в отчете не раскрывается.

CDK4 / 6

В 2019 году Берджесс и его коллеги сообщили о своей работе по разработке двойных деградеров CDK4 / 6 171 (рис. 14). Разработанные PROTAC могут разлагать CDK4 / 6 со значениями DC 50 в диапазоне от 20 до 50 нМ и подавлять рост клеток на допустимом уровне. Однако их соединения не показали эффективности в клетках, сверхэкспрессирующих CDK4 / 6.

Рис. 14

Типичные PROTAC, нацеленные на CDK4 / 6.

В 2019 году Грей и его коллеги варьировали линкеры бифункциональных молекул, чтобы найти двойные деструкторы CDK4 / 6 (BSJ-03-204) и селективные деструкторы CDK4 и CDK6 (BSJ-04-132 или BSJ-03-123, соответственно). 172 173 (рис.14). Эти деструкторы могут разлагать целевые белки при 100 нМ и проявлять лучшие антипролиферативные эффекты по сравнению с ингибиторами CDK4 / 6. Более того, в клетках Granta-519 наблюдалась сверхэкспрессия циклина D1. разрушитель BSJ-02-162 или BSJ-03-204 может приводить к заметной деградации CDK4 / 6 и индуцировать остановку клеточного цикла G1 одновременно.

О наиболее мощном деструкторе сообщили Рао и его коллеги, который был получен из помалидомида и палбоциклиба, и продемонстрировал специфическую и замечательную эффективность в отношении деградации CDK6 с DC 50 , равным 2,1 нМ 174 (рис. 14). Более того, PROTACs все еще удерживали сильную деградацию и пролиферацию за счет ингибирования гематопоэтических раковых клеток с амплифицированными копиями / мутированными формами CDK6.

Хотя сообщалось о нескольких PROTAC, нацеленных на CDK4 / 6, но как разработать PROTAC, применяемые для клеток, устойчивых к ингибиторам CDK, до сих пор остается сложной задачей. 175,176

CDK8

Циклинзависимая киназа 8 (CDK8) является членом семейства циклинзависимых киназ, которое играет важную роль в обеспечении фазового перехода клеточного цикла, инициировании синтеза ДНК и регуляции транскрипции клеток во время пролиферации клеток и дифференцировка, особенно в онкогенных сигнальных путях, включая сигнальный путь TGF-β, путь Wnt-β-катенина, путь p53, а также сывороточную и гипоксическую ответную сеть. 177 178 179 Исследование показало, что сверхэкспрессия гена CDK8 нарушает пролиферацию, дифференциацию и апоптоз клеток, что может ускорить рост и деление раковых клеток, таких как рак шейки матки, колоректальный рак, рак желудка, злокачественная меланома и т. Д. 180 Хотя ингибиторы CDK8 используются и постепенно привлекают все большее внимание, их эффективность в лечении различных видов рака еще не подтверждена. 181 Следовательно, разработка PROTAC для деградации белка CDK8 стала новой стратегией преодоления этих недостатков.

Натанаэль С. Грей и его коллеги впервые синтезировали серию соединений на основе кортистатина А. Результаты показали, что разработанные производные имели немного сниженную биологическую активность по отношению к CDK8 in vitro и клеточные анализы.Затем на основе этого каркаса они разработали JH-XI-10-02 ( 24 ), 182 , мощный разрушитель CDK8 (рис. 15). Они наблюдали значительную деградацию CDK8 после обработки 24 в концентрации 1 мкМ в течение 24 часов в клетках Jurkat. Затем они подтвердили механизм, с помощью которого деградация опосредована через CRBN, используя отрицательный контроль в клетках Molt14, нокаутированных по CRBN. Разработка деструкторов CDK8 не только предоставила инструмент для регулирования уровней белка CDK8 in vivo, но также предложила эффективную стратегию лечения рака с помощью деструкторов CDK8.

Рис. 15

Химическая структура заявленного CDK8 PROTAC.

CDK 9

Циклинзависимая киназа 9 (CDK9) является членом семейства циклинзависимых протеинкиназ (CDK), которые могут образовывать субъединицу комплекса положительного фактора элонгации транскрипции b (P-TEFb) с циклином T и играет решающую роль в удлинении транскрипции ряда онкогенов. 183,184,185 Он повсеместно экспрессируется во всех тканях и при различных злокачественных новообразованиях. 186 Доклинические исследования показали, что избирательное воздействие на CDK9 может иметь терапевтический потенциал при лечении рака и других заболеваний человека. 187 188 Однако CDK9 демонстрирует высокий уровень консервативной последовательности по сравнению с другими членами семейства CDK, что затрудняет разработку селективных ингибиторов CDK9. 189 Из-за разной формы поверхности и разного распределения остатков лизина на поверхности CDK это дало бы уникальную возможность разработать PROTAC, избирательно нацеленный на CDK9, который требует должным образом экспонированной поверхности остатков лизина для убиквитинирования и деградации протеасом. 190

В 2017 году Сандип Рана и его коллеги разработали первый селективный деструктор CDK9 путем конъюгирования аналога аминопиразола и лиганда CRBN талидомида 191 (рис.16). В клетках HCT116 вестерн-блоттинг показал, что разрушитель CDK9 может снижать приблизительно 56 и 65% белка CDK9 при 10 и 20 мкМ, соответственно, при сохранении других членов семейства CDK.

Рис. 16

Типичные PROTAC-файлы CDK9.

В 2018 году группа Натанаэля С. Грея разработала селективный деструктор CDK9, THAL-SNS-032, который состоял из ингибитора мультицелевой киназы CDK SNS-032 и производного талидомида 192 (рис.16). THAL-SNS-032 индуцировал быструю деградацию CDK9 с 99% D max при 250 нМ в клетках MOLT 4 после 6 часов обработки, но не влиял на уровни других мишеней SNS-032. Кроме того, THAL-SNS-032 показал более длительный фармакодинамический эффект, чем ингибиторы.

В отличие от PROTAC, нацеленных на CDK9 на основе аминопиразола и аминотиазола, из двух вышеупомянутых групп, 191,192 Zhiyu Li и его коллеги произвели деградер CDK9 27 путем конъюгации природного продукта вогонина с помалидомидом 193 .16). PROTAC 27 селективно деградировал CDK9 и показал более сильную активность ингибирования пролиферации клеток (IC 50 = 17 ± 1,9 мкМ), чем вогонин (IC 50 = 30 ± 3,5 мкМ) в клетках MCF7. Кроме того, 27 был намного менее активен в отношении клеточных линий с низкими уровнями экспрессии CDK9, таких как L02 (IC 50 > 100 мкМ).

CK2

Казеинкиназа 2 (CK2) — это вездесущая и конститутивно активная серин / треониновая протеинкиназа с различными видами функций. 194 Избыточная экспрессия CK2 имеет отношение к возникновению рака. 195

В 2018 году Gou и его коллеги сообщили, что PROTAC нацелены на CK2 путем конъюгирования ингибитора CK2 (CX-4945) и помалидомида 196 (рис.17). Среди описанных деструкторов соединение 28 показало деградацию СК2 в зависимости от дозы и времени. Когда CK2 расщеплялся, наблюдалось пониженное фосфорилирование Akt и повышенная регуляция p53. Удивительно, но деструктор 28 продемонстрировал цитотоксичность, аналогичную CX-4945 с ингибитором CK2, хотя механизм был совершенно другим.PROTAC, нацеленные на белки CK2, по-видимому, являются потенциальной стратегией лечения рака.

Рис. 17

Представитель PROTAC, нацеленный на CK2.

c-Met

c-Met представляет собой трансмембранную RTK и рецептор фактора роста гепатоцитов (HGF), который также известен как фактор рассеяния (SF). c-Met и HGF играют причинную роль в выживании, росте, ангиогенезе и метастазировании раковых клеток. После связывания с HGF / SF c-Met димеризуется, и трансфосфорилирование происходит в киназном домене (Y1234 и Y1235) и C-концевом стыковочном домене (Y1313, Y1349, Y1356 и Y1365). 197 Док-домен распознает многие последующие клеточные эффекторы, включая Src, Gab1, Crk, Grb2, SHC и PI3K, которые играют важную роль в биологии рака. Ингибиторы киназы c-Met были разработаны в течение последних 20 лет, но их клинические испытания не принесли результатов. Это предполагает, что независимая от киназы функция может управлять онкогенезом и деградацией и может быть потенциальным преимуществом перед ингибированием.

Таким образом, группа Crews разработала PROTAC, нацеленный на c-Met, на основе беспорядочного ингибитора форетиниба 47,103,198 (рис.18). И VHL, и CRBN PROTAC могут вызывать разложение c-Met в зависимости от дозы и времени. Быстрый клиренс c-Met с помощью VHL PROTAC на основе форетиниба наблюдался в течение 6 часов, что обеспечивало преимущество перед RNAi. Для РНКи обычно требуются реагенты для трансфекции или давление экзогенного отбора, которое может влиять на другие биологические процессы. Поскольку RTK также разрушаются HSP90, они обнаружили, что VHL PROTAC на основе форетиниба и ингибитор HSP90 17-AAG оказывают аддитивное действие на деградацию c-Met.Они также подтвердили, что VHL PROTAC на основе форетиниба индуцировал интернализацию c-Met с поверхности клетки с помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии. У c-Met с делецией экзона 14 отсутствует сайт рекрутирования соседнего мембранного домена (Y1003) для его эндогенной лигазы E3, и, таким образом, естественного «выключателя» для индуцированной HGF передачи сигналов больше нет. VHL PROTAC на основе форетиниба может вызывать деградацию c-Met с делецией экзона 14, несмотря на то, что не разрушается естественным механизмом, что является еще одним примером того, что деградация может иметь преимущество перед ингибированием.

Рис. 18

Типичные PROTAC-файлы c-Met.

DHODH

Дигидрооротатдегидрогеназа (DHODH) представляет собой флавинмононуклеотидный (FMN) фермент в митохондриях, который катализирует окисление дигидрооротата до оротата с коферментом Q в качестве кофактора в биосинтезе пиримидина de novo. Он обеспечивает строительные блоки для дальнейшего синтеза РНК, ДНК, гликопротеинов и фосфолипидов. 199 Ингибирование активности ДГОДГ было предложено в качестве многообещающей терапевтической стратегии при вирусных инфекциях, раке, артрите и подавлении иммунитета.Например, бреквинар, сильный ингибитор ДГОДГ, привлекал большое внимание в предыдущих исследованиях, но потерпел неудачу в клинических исследованиях из-за его побочных эффектов и плохой растворимости.

Группа Neamati разработала зонды PROTAC на основе бреквинара, чтобы лучше понять терапевтическую значимость DHODH при раке 200 (рис. 19). Зонд 32 содержал решающую карбоновую кислоту и сохранял отличную эффективность в ферментативном анализе (IC 50 = 0,093 мкМ). Напротив, метиловый эфир 31 не ингибировал активность DHODH (IC 50 > 200 мкМ).Однако 32 не подавлял рост клеток DHODH-чувствительных клеток HCT-116. Напротив, 31 был более активен в клетках HCT-116, что может быть результатом превосходной клеточной проницаемости. Более того, 31 препятствовал образованию новой колонии лучше, чем бреквинар, что предполагает более глубокое биологическое свойство 31 . К сожалению, никакой деградации белка не наблюдали как для 31 , так и для 32 из-за возможной существенно различающейся системы убиквитинирования белка в митохондриях.

Рис. 19

Типичные PROTACs DHODH.

EGFR и HER2

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) представляет собой гликопротеин с тирозинкиназной активностью, который является основным членом семейства онкогенов эритробластоза B (ErbB). 201 Семейство EGFR включает четыре подтипа: EGFR (ErbB1, HER1), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3) и ErbB4 (HER4). 202 EGFR участвует в пролиферации опухолевых клеток, ангиогенезе, опухолевой инвазии, метастазировании и ингибировании апоптоза.Сверхэкспрессия EGFR играет важную роль в прогрессировании злокачественных опухолей, таких как глиобластома, NSCLC, рак головы и шеи, рак груди, колоректальный рак, рак яичников, рак простаты, рак поджелудочной железы и так далее. 201,203,204 Таргетная терапия EGFR привела к разработке многих превосходных ингибиторов EGFR с высокой селективностью и небольшим количеством побочных эффектов. 49 146 205 Тем не менее, лекарственная устойчивость и низкий уровень клинического ответа все еще вызваны новыми мутациями при длительном клиническом приеме лекарств. 62,63,206

9046 Дикий тип6 90 Lap545

Крейг М. Крюс и его коллеги, мутантный дезинтегратор EG, использовали мутантный дезинтегратор EG, описанный на основе мутантного ингибитора EG. гефитиниб, ингибитор второго поколения афатиниб и лиганд VHL (рис.20 и 21). Они обнаружили, что все деструкторы способны вызывать деградацию EGFR. 198 Например, соединение 33 индуцировало деградацию EGFR с DC 50 = 39,2 нМ и D max = 97,6% в клеточной линии OVCAR8. Соединение 33 имело более высокую антипролиферативную эффективность с IC 50 = 102 нМ в клетках SKBr3. Более того, результаты показали, что соединение 33 также может разрушать мутантную форму EGFR с инсерцией экзона 20 в линии клеток HeLa.Селективный гефитиниб с мутантным EGFR был использован для замены боеголовки для разработки соединения 34 , которое позволило деградацию EGFR с делецией экзона 19 (DC 50 = 11,7 нМ и D max = 98,9%) в Клеточная линия HCC827 и мутация активирующей точки L858R (DC 50 = 22,3 нМ и D max = 96,6%) в клеточной линии h4255. Когда ингибитор второго поколения афатиниб был использован для разработки соединения 35 , он мог разрушить устойчивый к гефитинибу двойной мутантный (L858R / T790M) EGFR с DC 50 = 215.8 нМ и D max = 79,1% в клеточной линии h2975.

Рис. 20

Эффективность EGFR PROTAC в различных клеточных линиях. 198

Рис.21

Типичные PROTAC для EGFR и HER2.

Учитывая, что лапатиниб также является эффективным связующим для других RTK, они оценили потенциальную способность соединения 33 к разложению в направлении HER2. Они обнаружили, что соединение 33 способно индуцировать деградацию HER2 при 25 нМ, но оно не показало селективности между EGFR и HER2.Основываясь на результатах, они разработали новые соединения с различными линкерами и протестировали активность разложения и селективность по отношению к HER2. Наконец, эти соединения только избирательно разрушали EGFR и не влияли на HER2.

Кроме того, был выдан патент на конструкцию деструкторов EGFR. В патенте они обнаружили, что соединение 36 обладает хорошей активностью по разложению EGFR. Очевидно, что деградацию EGFR можно наблюдать с соединением 36 при 100 нМ. Соединение 36 также обладало хорошей антипролиферативной активностью против мутанта L858R и мутанта L858R / T790M с IC 50 300 нМ в клетках Ba / F3.

eIF4E

Эукариотический фактор инициации трансляции 4E (eIF4E) представляет собой кэп-связывающий белок, который специфически распознает кэп m7GpppX на 5′-конце кодирующей мРНК, что влияет на инициацию эукариотической трансляции. 207,208,209

Связывание eIF4E с кэпом мРНК приводит к задействованию трансляционного аппарата, а затем инициирует синтез белка в стартовом кодоне транскрипта. eIF4E оказывает большое влияние на пролиферацию, дифференцировку и метастазирование клеток. 210 Исследования показали, что eIF4E сверхэкспрессируется во многих злокачественных клеточных линиях и первичных опухолях у животных и людей, включая, среди прочего, рак груди, рак легких и неходжкинские лимфомы. 211 Сообщалось, что ингибирование функции eIF4E может замедлять рост опухоли и вызывать апоптоз. 212 Таким образом, разработка новых деструкторов eIF4E — это новая стратегия лечения многих видов рака. 213 214

Аманда Л. Гарнер и соавторы впервые разработали новые PROTAC для деградации eIF4E (рис.22). Они создали небольшую библиотеку производных GxP (GMP или GDP), конъюгированных с леналидомидом и лигандом VHL. 215 Предыдущий отчет показал, что GxP (GMP или GDP) был хорошим ингибитором eIF4E, поэтому он был выбран в качестве каркаса Bn7GxP. Чтобы проверить способность соединений к разложению, они разработали in vitro конкурентный тест. В этом анализе лизаты клеток HEK293 инкубировали с агарозной смолой m7GxP (GMP или GDP), чтобы обеспечить аффинную очистку eIF4E.

Фиг.22

Представитель PROTAC для eIF4E.

В тестах биохимической характеристики они обнаружили, что все конъюгаты GDP были активными, в то время как производные GMP не обладали способностью к разложению. В частности, соединение 37 было способно значительно разлагать eIF4E при 50 мкМ, а eIF4E полностью разрушался, когда концентрация соединения увеличивалась до 500 мкМ. Однако, когда клетки MDA-MB231 и K562 обрабатывали этими соединениями, не наблюдалось внутриклеточной деградации eIF4E, несмотря на концентрации соединения до 500 мкМ.Они предполагают, что основной причиной была низкая клеточная проницаемость, как это наблюдалось с другими аналогами кэпа.

ER

ER является регулятором экспрессии генов и многих биологических процессов в качестве ядерного рецептора, включая ERα и ERβ. Восемьдесят процентов всех вновь диагностированных случаев рака груди являются ERα-положительными, 194 , поскольку ERα считается основным регулятором, который преобразует передачу сигналов эстрогена в женских половых путях и молочных железах. 216 Текущий стандарт лечения — фулвестрант, который действует путем избирательного разрушения рецептора эстрогена при метастатическом раке молочной железы ER +.Хотя фулвестрант реализовал терапевтическое вмешательство за счет деградации ER, до 50% ER остается по сравнению с исходными уровнями после шести месяцев лечения фулвестрантом. Следовательно, лекарственная устойчивость возникла для различных видов рака молочной железы ER +, хотя одобренные методы лечения оказались успешными в этой популяции пациентов.

В 2018 году АРВ-471 был задокументирован Арвинасом как средство разложения ER для лечения метастатического рака молочной железы ER + в качестве пероральной терапии (рис. 22). ARV-471 вызывал очевидную деградацию ER на уровне 11 нМ в различных линиях клеток рака молочной железы.ARV-471 продемонстрировал 99% ингибирующий эффект на рост опухоли при 10 mpk и 106% эффект при 30 mpk (ниже) в PDX из модели пациента с мутантным ESR1 после перорального введения. Между тем, фулвестрант продемонстрировал менее сильное ингибирование роста опухоли. Эти данные показывают, что ARV-471 значительно ингибирует рост опухоли по сравнению с фулвестрантом. Как выпущено Arvinas, ARV-471 обладал многообещающей активностью и эффективностью как в качестве отдельного агента, так и в качестве комбинированной терапии с ингибиторами CDK4 / 6 за счет разрушения ER.Исследование фазы 1 в третьем квартале было начато в 2019 году компанией Arvinas для женщин с местнораспространенным или метастатическим ER + положительным / HER2-отрицательным раком молочной железы.

В 2018 году Ван и его коллеги раскрыли мощный разрушитель ER под названием ERD-308 217 (рис. 23). ERD-308 индуцировал эффективную деградацию ER в линиях клеток рака молочной железы MCF7 и T47D ER + с DC 50 0,17 и 0,43 нМ соответственно. По сравнению с фулвестрантом деструктор вызывал более полную деградацию мишени и демонстрировал более сильное ингибирование роста клеток в клетках MCF-7.Эти данные демонстрируют новый вид деструкторов ER для лечения распространенного и метастатического рака груди ER +.

Рис. 23

Типичные PROTACs, нацеленные на лекарственно-устойчивый ER.

ERK1 и ERK2

ERK1 и ERK2 являются тесно связанными серин / треониновыми киназами и участвуют в каскаде передачи сигнала Ras-Raf-MEK-ERK, который участвует во многих биологических процессах, включая клеточную адгезию, развитие клеточного цикла, миграцию клеток, выживаемость клеток, дифференциация, метаболизм, пролиферация и транскрипция путем катализирования фосфорилирования сотен цитоплазматических и ядерных субстратов. 218 219 Этот сигнальный путь участвует во многих формах рака. Деградация уровней ERK1 и ERK2 может быть выгодным подходом по сравнению с ингибированием, поскольку значительная часть передачи сигналов с помощью ERK1 и ERK2 возникает из-за межбелковых взаимодействий в дополнение к каталитической активности.

Группа Хайтмана предположила, что PROTAC обладают высокой молекулярной массой, которая ограничивает их клеточную проницаемость, и другими лекарственными свойствами 62 (рис. 24).Они разработали два меньших предшественника, которые могли внутриклеточно формировать молекулу PROTAC, нацеленную на ERK1 и ERK2, с помощью биоортогональной комбинации щелчков на основе ковалентного ингибитора и талидомида, меченного тетразином. Деградация ERK1 и ERK2 была завершена через 16 часов в присутствии зонда 40 (10 мкМ) и Tz-талидомида 39 (10 мкМ). Когда ERK-CLIPTAC был приготовлен перед добавлением к клеткам, не было деградации ERK1 или ERK2. Эти результаты указали на отсутствие клеточной проницаемости молекулы PROTAC и подтвердили, что деградация произошла в результате образования щелчка PROTAC из двух меньших молекул-предшественников после их проникновения в клетки.

Рис. 24

Типичные PROTAC для ERK1 и ERK2.

ERRα

Являясь членом суперсемейства орфанных ядерных рецепторов, рецепторы, связанные с эстрогенами (ERR), играют важную роль в поддержании гомеостаза в организме, включая раннее развитие, регулируемое ERRβ, и метаболический баланс, связанный с ERRα и ERRγ. 220 221 222 ERRα имеет относительно высокую гомологию с рецептором эстрогена α (ERα) и отвечает за регулирование метаболизма и энергетического гомеостаза за счет взаимодействия с несколькими транскрипционными кофакторами, такими как белки коактиватора 1 рецептора γ, активируемого пролифератором пероксисом (т.е., PGC-1α и PGC-1β), корепрессор взаимодействующего с рецептором белка 140 (RIP-140) и т. д. 223,224,225

В 2015 году Крюс и его коллеги сообщили о первом PROTAC (PROTAC_ERRα), вызывающем деградацию ERRα. 205 (рис.25). Разработанный деструктор показал дозозависимое снижение уровней ERRα в клетках MCF-7. DC 50 составлял около ~ 100 нМ, а D max составлял 86%. Кроме того, они оценили эффективность ERRα PROTAC in vivo.После лечения деградерами наблюдалось значительное снижение уровней ERRα в сердце и почках и опухолях MDA-MB-231 примерно на 44%, 44% и 39% соответственно по сравнению с введением равного объема ингибиторов ERRα. PROTAC_ERRα PROTAC сохранял свою активность деградации in vivo, распределяясь в тканях и снижая уровни ERRα при взаимодействии с мишенью.

Рис. 25

Типичные PROTAC, нацеленные на ERRα.

В 2019 году группа Ding разработала серию производных (E) -3- (4 — ((2,4-бис (трифторметил) бензил) окси) -3-метоксифенил) -2-цианоакриламида для выявления новых деструкторы эстроген-связанных рецепторов α (ERRα) 226 (рис.25). Репрезентативный деструктор, 43 , был способен специфически расщеплять белок ERRα на> 80% от 30 нМ, который до сих пор считался одним из наиболее селективных и мощных деструкторов ERRα.

FAK

Киназа фокальной адгезии (FAK или PTK2) широко экспрессируется у разных видов и имеет более 90% гомологии в аминокислотной последовательности. 227 Он проявляет киназозависимую функцию фермента и независимую от киназы функцию каркаса, оба из которых имеют решающее значение в развитии рака (например,g., инвазия, метастазирование и ангиогенез), ранний эмбрион, репродукция и т. д. 228,229,230,231 За исключением киназного домена, 232 FAK содержит три других функциональных домена: полоса 4.1, N-концевой домен эзрина, радиксина, моэзина (FERM), богатые пролином области (PRI-III) и нацеливание фокальной адгезии ( FAT) С-концевой домен. 233,234 Домен FERM играет важную роль в клеточной регуляции. 235 236 237 Домены PR и FAT в основном участвуют в различных межбелковых взаимодействиях, 238 , все из которых обеспечивают передачу сигналов, не зависящих от киназы FAK, и участвуют в образовании больших сигнальных комплексов. 239,240 Однако текущий набор инструментов в области медицинской химии ограничивает разработку химических соединений для ингибирования FAK и игнорирует функции каркаса FAK. Хотя в доклинических исследованиях была доказана эффективность некоторых ингибиторов FAK, клинических успехов пока не наблюдается. 239,241,242 Кроме того, устойчивость к лекарствам может вызывать традиционные ингибиторы киназ, поскольку они могут действовать только на домен киназы. Следовательно, новые стратегии устранения как ферментативных функций FAK, так и функций каркаса очень важны для заболеваний, связанных с FAK.

В 2018 году группа Craig M. Crews сообщила о первом наномолярном FAK-нацеливании PROTAC, 44 , на основе дефактиниба и убиквитинлигазы VHL E3 100 (рис.26). Соединение 44 показало лучшую селективность белка и сильную деградацию белка. Его DC 50 составлял 3 нМ, а D max составлял 99% в бессывороточных обработанных клетках PC3 через 24 часа. Кроме того, 44 значительно нарушает миграцию клеток и приводит к уменьшению заживления ран после обработки 50 нМ и 250 нМ после 24 часов лечения тройными отрицательными клетками рака молочной железы человека (MDA-MB-231).В тесте на инвазию клеток Transwell 44 снижал инвазии клеток MDA-MB-231 на целых 65% при концентрации 100 нМ в течение 24 часов. Кроме того, 44 также превосходит дефактиниб в отношении активации FAK и последующей передачи сигналов. Однако это не повлияло на пролиферацию клеток.

Рис. 26

Представитель ПРОТАКОВ ФАК.

В 2019 году группа Питера Эттмайера разработала два высокоселективных и функциональных PROTAC, нацеленных на FAK (BI-3663 и BI-0319), используя лиганды CRBN и VHL 243 (рис.26). BI-3663 (на основе CRBN) расщепил FAK с DC 50 30 нМ в панели из 11 клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы человека. Несмотря на эффективную деградацию FAK, эти соединения по-прежнему не влияли на пролиферацию клеток ни в одной из протестированных клеточных линий.

Недавно группа Yu Rao разработала FAK-нацеленные PROTAC с ингибиторами FAK (PF562271 или VS6063) и лигандом CRBN 244 (рис. 26). FC-11 (FAK PROTAC на основе PF562271) показал пикомолярную деградацию FAK в тестируемых клеточных линиях (DC 50 в тестируемых клеточных линиях составляли 40 пМ в Ramos, 80 пМ в PA1, 310 пМ в TM3, 330 пМ в MDA. -MB-436 и 370 пМ в клеточных линиях LNCaP).Однако, как и другие сообщенные FAK PROTAC, 100 243 FC-11 не влияли на пролиферацию клеток в тестируемых клеточных линиях в большей степени, чем PF562271. Следовательно, требуется больше работы для изучения биологии, связанной с FAK.

FLT-3

FMS-подобная тирозинкиназа 3 (FLT3), принадлежит к семейству RTK типа III, играет важную роль в пролиферации, дифференцировке и апоптозе клеток. 245 246 Около 30% впервые диагностированных пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) обнаруживают мутации FLT3; в основном к ним относятся мутации внутренней тандемной дупликации (ITD) в 20-25% случаев AML и точечные мутации (e.g., D835) в тирозинкиназном домене (TKD) в ~ 5–10% случаев. 247 248 249 Мутации как FLT3-ITD, так и TKD приводят к постоянной активации FTL3 и потере аутоингибиторной функции на FLT3, что в конечном итоге способствует активации нисходящих сигнальных путей STAT, PI3K / Akt и MAPK / ERK. 250,251,252 В последние годы много усилий было вложено в разработку низкомолекулярных ингибиторов FLT3. Хизартиниб (AC220), гильтеритиниб, MLN-518, сунитиниб и понатиниб изучаются в ходе клинических испытаний. 253 254 255 256 257 Хотя эти ингибиторы FLT3 демонстрируют сильную активность против AML в клинических испытаниях, приобретенная лекарственная устойчивость и рецидивы все еще остаются проблемами для терапии, нацеленной на FLT3.

В 2018 году Натанаэль С. Грей и его коллеги синтезировали два FLT3-специфичных PROTAC, TL13-117 и TL13-149, на основе исследования мультикиназного разрушителя TL12-186. Эти специфические нацеленные на FLT3 PROTAC были синтезированы путем конъюгирования клинического кандидата хизартиниба и лиганда CRBN помалидомида с линкером ПЭГ (рис.27). 169 В ячейках MOLM-14 TL13-117 и TL13-149 вызвали наиболее эффективное разрушение FLT3 в диапазоне от 10 до 100 нМ соответственно. Однако у квизартиниба IC 50 примерно в пять раз ниже, чем у TL13-117 и TL13-149 в обеих клетках MOLM-14 и MV4-11, что указывает на то, что индуцированная TL13-117 и TL13-149 деградация FLT3 немного улучшает их антипролиферативные эффекты.

Рис. 27

Типичные PROTAC-файлы FLT3.

В том же году Craig M.Группа Crews разработала FLT3 PROTAC, комбинируя хизартиниб и лиганд VHL E3 с оптимизированным линкером (фиг. 27). 258 Этот PROTAC показал низкие наномолярные концентрации деградации FLT3-ITD в клетках MV4-11 и MOLM-14, а активность ингибирования роста клеток была в> 3,5 раза более сильной, чем у хизартиниба с субнаномолярным IC 50 (0,6 ± 0,08 нМ) в отличие от ранее описанных FLT3 PROTAC, которые не дали преимущества. 169 Кроме того, FLT3 PROTAC был способен индуцировать деградацию FLT3 ITD в опухолях ксенотрансплантата MV4-11 в дозе 30 mpk (уровни лекарственного средства в плазме поддерживались на уровне> 5 нМ во время лечения).

HDAC6

Гистоновые деацетилазы (HDAC) представляют собой класс протеаз, основной функцией которых является изменение структуры хромосом и регулирование экспрессии генов. 259 HDAC6 принадлежит к семейству HDAC типа II, которое обладает уникальными структурными и биологическими свойствами. 260 261 262 HDAC6 имеет два функциональных домена деацетилирования и один мотив цинкового пальца, которые необходимы HDAC6 для проявления его биологической активности. Все большее количество исследований показало, что HDAC6 тесно связан с возникновением и развитием опухолей. 259 263 264 Ингибиторы HDAC6 могут подавлять пролиферацию раковых клеток, способствовать апоптозу и иметь хорошие эффекты при различных злокачественных опухолях, таких как множественная миелома (MM), неходжкинская лимфома (NHL) и другие злокачественные опухоли. 262 265 Однако большинство ингибиторов HDAC6 плохо селективны и действуют на различные изоформы HDAC, особенно на HDAC1 и HDAC3. Хотя они обладают очевидным антидифференциальным и антипролиферативным действием, также очевидны побочные эффекты, включая миелосупрессию, потерю массы тела, утомляемость и аритмию и т. Д., что ограничивает их серьезное использование. 264 266 267

В 2018 году Тан и его коллеги спроектировали и разработали первый деструктор для цинк-зависимых HDAC путем конъюгирования неселективных ингибиторов HDAC с убиквитинлигазой E3 268 (рис.28). В этой работе они обнаружили, что разложение типичного соединения 51 происходило при 41 нМ и достигало максимального эффекта в диапазоне от 123 до 370 нМ в клетках MCF-7. DC 50 и D max были 34 и 70 нМ.5% соответственно. Эффект крючка не наблюдался при более высоких концентрациях. Они также обнаружили, что максимальный эффект деградации HDAC6 наблюдался на уровне 80 нМ, когда они использовали соединение 51 для обработки линии клеток MM.1S в течение 6 часов.

Рис. 28

Типичные PROTAC-файлы HDAC6.

В 2019 году они сообщили о новом поколении многофункциональных деструкторов HDAC6 путем связывания селективного ингибитора HDAC6 nexturastat A с лигандом CRBN, который может иметь синергетический эффект для антипролиферации MM 269 (рис.28). В этой работе они обнаружили, что соединение 52 снижало уровень HDAC6 при концентрации всего 3 нМ и достигало максимального эффекта примерно при 30 нМ. Он показал DC 50 при приблизительно 1,6 нМ в клеточной линии MM.1S, что было в ~ 5-6 раз выше, чем у соединения 51 . В то же время они обнаружили, что соединение 52 имеет хорошую селективность в отношении HDAC6 и демонстрирует меньшую деградацию HDAC1, HDAC3 и HDAC4.

В 2019 году Рао и его коллеги сообщили о разработке мощных инструментов PROTAC для избирательной деградации белка HDAC6 (рис.28). Они также выбрали nexturastat A (Nex A) в качестве связующего HDAC6, но они модифицировали молекулу PROTAC на алкильную цепь вместо бензольного кольца в соединении 52. 270 В этом исследовании типичное соединение 53 было наиболее предпочтительным. мощный деструктор, который может значительно снизить уровень белка HDAC6 при концентрации 100 нМ в клетках HeLa. Они также оценили потенциал деградации в различных клеточных линиях и обнаружили, что соединение 53 последовательно индуцировало значительную деградацию HDAC6 во всех клеточных линиях, но показало лучшую чувствительность в клеточной линии MM MM.1С. Более того, они обнаружили, что соединение 53 имело хорошую селективность в отношении HDAC6 и не имело эффектов разложения в отношении HDAC1, HDAC2 или HDAC4 даже при 10 мкМ. Соединение 53 имело DC 50 3,8 нМ против HDAC6, а GI 50 составляло 1,21 мкМ в клетках MM.1S. Процесс разложения также был хорошо проиллюстрирован визуализацией на основе флуоресценции.

MCL1

Миелоидноклеточный лейкоз 1 (MCL1) — это белок, способствующий выживанию, сверхэкспрессируемый при различных формах рака, таких как лимфома, лейкемия, рак груди и ММ. 271 MCL1 может сочетаться с проапоптотическими факторами Bim, Bak и Bax посредством PPI и подавлять их проапоптотические функции. 272 Таким образом, MCL1 считается критическим фактором выживания при раке человека. Принимая во внимание, что ингибирование традиционными небольшими молекулами зависит от занятия кармана при определенной концентрации и в течение достаточного времени, PPI сложно нацелить из-за их неглубоких участков связывания. Поскольку PROTAC могут вызывать деградацию белка без необходимости в высокой аффинности связывания, PROTAC обладают большим потенциалом для решения этой проблемы.

В 2019 году Дерксен и его сотрудники разработали dMCL1-2 и подтвердили образование тройного комплекса 273 (рис.29). Они доказали, что по сравнению с контролями ДМСО, dMCL1-2 может вызывать заметное снижение уровней MCL1 при 100 нМ в клетках OPM2, инициируя убиквитинирование MCL1.

Рис. 29

Типичные PROTAC, нацеленные на MCL1.

Как упоминалось выше, MCL1 взаимодействовал с BCL2. Таким образом, Чжан и его коллеги также осознали деградацию MCL1 с помощью PROTAC C1 со значением 0 DC 50 .7 мкМ и одновременно достигнута деградация BCL2 128 (рис. 29).

MDM2

p53, супрессор опухолей, играет ключевую роль в регуляции многих клеточных процессов и предотвращении развития рака. 274 Однако мутации или делеции р53 встречаются примерно в 50% случаев рака человека, что приводит к инактивации функции супрессора опухоли р53. 275 Мышиная двойная минута 2 (MDM2) является отрицательным эндогенным клеточным регулятором р53. Как лигаза E3, она может связываться с p53 и убиквитинировать его, что в конечном итоге приводит к эффективной деградации p53. 276 Действительно, MDM2 сверхэкспрессируется при некоторых злокачественных опухолях человеческого p53 дикого типа. Чтобы восстановить опухолевую супрессорную функцию p53, нарушение взаимодействий MDM2-p53 стало многообещающей терапевтической стратегией для рака человека дикого типа p53. Однако ингибирование p53 приводит к сверхэкспрессии и накоплению MDM2, что может привести к проблемам с токсичностью. Кроме того, несмотря на значительный прогресс в разработке ингибиторов MDM2, лекарственная устойчивость стала существенным ограничением. Таким образом, стратегия PROTAC стала очень желательным методом модуляции уровней MDM2.

В 2018 году группа Shaomeng Wang опубликовала первый мощный деструктор MDM2, MD-224, привязав спирооксиндоловый ингибитор MDM2 MI-1061 к лиганду CRBN леналидомид 61 (рис.30). MD-224 эффективно индуцировал деградацию MDM2 в субнаномолярных концентрациях в клетках лейкемии человека. Он достиг значения IC 50 1,5 нМ для ингибирования роста клеток RS4; 11 и других линий лейкозных клеток. Кроме того, MD-224 также продемонстрировал полную и стойкую регрессию опухоли in vivo, превзойдя ингибитор MI-1061.

Рис. 30

Химическая структура указанного ингибитора MDM2 и PROTAC.

В 2019 году группа Weiping Tang сообщила о втором деструкторе MDM2, деструкторе 32, через соединение лиганда MDM2 (нутлин) и лиганда CRBN E3 (леналидомид) (рис. 30). 277 Degrader 57 индуцировал эффективную деградацию MDM2 со значением DC 50 , равным 23 нМ в RS4; 11 лейкозных клетках. Он также подавлял пролиферацию лейкозных клеток с IC 50 3,2 нМ, что было почти в 1000 раз сильнее, чем ингибитор MDM2.

p38α и p38δ

Киназы p38 MAPK активируются различными клеточными стрессами и воспалительными цитокинами. 278 279 Они состоят из четырех членов (p38α, p38β, p38γ и p38δ), но сообщалось о редких изоформ-селективных химических пробах. 47 p38 MAPKs активируются посредством двойного фосфорилирования их мотива Thr-Gly-Tyr в их петле активации и последующих характерных глобальных конформационных изменений. Среди изоформ p38α является наиболее изученной изоформой, поэтому для нее было разработано множество ингибиторов, но они показали ограниченную эффективность и безопасность.Напротив, p38δ недостаточно изучен для лечения рака и диабета, и его функциональное ингибирование, по-видимому, трудноизлечимо.

Группа Crews разработала p38α- и p38δ-селективные PROTAC на основе форетиниба и различных лигандов E3-лигазы (VHL) 47 (рис. 31). SJFα разлагал p38α с DC 50 7,16 нМ и D max 97,4%, в то время как он был менее эффективным против p38β, p38γ и p38δ. SJFδ ухудшил p38δ с DC 50 46,17 нМ и D max из 99.4%, при этом не разрушая p38α, p38β или p38γ. Затем они использовали анализ тройного комплекса in vitro, чтобы продемонстрировать селективность. Было обнаружено, что SJFα способствует только тройному комплексу VHL: PROTAC: p38α, тогда как в присутствии SJFδ такие тройные виды не обнаруживаются. Однако и SJFα, и SJFδ могут участвовать в тройных комплексах VHL: PROTAC: p38δ с одинаковой эффективностью. Таким образом, они использовали поверхностный плазмонный резонанс (SPR) для изучения кинетики сборки бинарных и тройных комплексов.Комплекс SJFδ показал увеличенный период полураспада ( t 1/2 = 38 с) по сравнению с комплексом SJFα ( t 1/2 = 8 с), что указывает на то, что p38δ: SJFδ: VHL является более благоприятный тройной комплекс по сравнению с p38α: SJFδ: VHL, который соответствует результатам деградации. Моделирование молекулярной динамики (МД) комплексов p38δ: SJFδ: VHL и p38δ: SJFα: VHL показало, как длина и ориентация линкера для рекрутирования VHL на разных PROTACs могут приводить к различным тройным интерфейсам для достижения селективной деградации.

Рис. 31

Типичные PROTAC для p38α и p38δ.

PARP1

Поли (АДФ-рибоза) полимеразы (PARP) относятся к ДНК-зависимым ядерным ферментам, которые играют роль переноса отрицательно заряженных фрагментов АДФ-рибозы от клеточного NAD + на различные белковые субстраты. 280 PARP1 — самый распространенный ядерный фермент семейства PARP. Он обладает функциями восстановления повреждений ДНК из-за репликации, воздействия экзогенных токсинов, ионизирующего излучения, ультрафиолетового излучения, факторов окружающей среды, химиотерапии, клеточных метаболитов, лучевой терапии и т. Д.и играет роль в остановке гибели клеток. 281 Из-за ключевой роли PARP1 в ответе на повреждение ДНК он считается мощной терапевтической мишенью для лечения рака. В настоящее время ряд ингибиторов PARP1, таких как олапариб, нирапариб и инипариб, находятся на разных стадиях клинических испытаний. 282 Однако цитотоксичность и лекарственная устойчивость являются самыми большими препятствиями для их использования у пациентов. Таким образом, по-прежнему существует острая необходимость в других терапевтических методах с новыми механизмами действия.

В 2018 году группа Yu Rao опубликовала первый PROTAC, нацеленный на PARP1 (соединение 60 ), соединив ингибитор PARP1 нирапариб и лиганд MDM2 нутлин-3 283 (рис.32). После широкого скрининга деградации в нескольких линиях клеток тройного отрицательного рака молочной железы (TNBC) было обнаружено, что соединение 60 может избирательно индуцировать значительную деградацию PARP1 и апоптоз клеток в клетках MDA-MB-231. Кроме того, соединение 3 в пять раз сильнее ингибиторов PARP1 (нирапариб, олапариб и велипариб) с точки зрения антипролиферативной активности и не проявляет цитотоксичности в нормальных клетках.

Рис. 32

Типичный PROTAC PARP1.

PI3K

Фосфоинозитид-3-киназы (P13Ks) представляют собой внутриклеточные фосфатидилинозитолкиназы, входящие в сигнальный путь PI3K / Akt / mTOR, которые участвуют в регуляции пролиферации, апоптоза и дифференцировки клеток. 284 285 286 Недавние исследования показали, что избыточная экспрессия P13K-зависимого сигнального пути является основным признаком туморогенеза. По разным структурам и функциям PI3K обычно подразделяются на три класса, среди которых PI3K класса I считаются наиболее тесно связанными с развитием опухоли и наиболее часто изучаемым ферментом. 287 288 289 290 PI3K класса I можно разделить на IA (PI3Kα, PI3Kβ и PI3Kδ) и IB (PI3Kγ). Хотя многие ингибиторы PI3K уже разработаны, их лекарственные свойства серьезно ограничены из-за плохой селективности и побочных эффектов. 291 292 293 Более того, высокая частота мутаций гена PIK3CA, который кодирует PI3Kα в солидных опухолях, затрудняет разработку ингибиторов PI3Kα. 294,295 Таким образом, разработка новых агентов расщепления белка, нацеленных на белок PI3K, стала отличной стратегией.

Цзян и его коллеги разработали и синтезировали серию потенциальных PROTAC на основе CRBN и ZSTK474 для деградации PI3K 296 (рис. 33).Типичное соединение 61 индуцировало заметную деградацию PI3K при 10 мкМ, и фосфорилирование Akt, S6K и GSK-3β в сигнальном пути PI3K / Akt / mTOR также могло быть подавлено в клетках HepG2. Однако ферментативная активность репрезентативного соединения 61 против PI3Kα оказалась хуже, чем у контрольного ZSTK474.

Рис. 33

Представитель PROTAC PI3K.

Пирин

Пирин является железосвязывающим членом суперсемейства белков купина и, как сообщается, является регулятором фактора транскрипции. 297 Он взаимодействует с BCL3, протоонкопротеином, связываясь с путем NFκB через комплекс пирин / p65 / ДНК. Было высказано предположение, что человеческий пирин играет роль регулятора фактора транскрипции, чувствительного к окислительно-восстановительным процессам, под контролем фактора транскрипции NRF2 через изменения клеточного окислительного стресса. Нокдаун пирина через миРНК может подавлять миграцию и пролиферацию раковых клеток. 298,299

Джонс и его коллеги сообщили о высокоаффинном химическом зонде пирина CCT251236 с помощью фенотипического скрининга для разработки нацеленных на пирин PROTAC 300 (рис.34). Их PROTAC первого поколения обладали хорошим сродством к пирину и комплексу CRBN-DDB1, но не наблюдалось заметной деградации пирина или воздействия на раковые клетки. Они выдвинули гипотезу, что физико-химические свойства были основной причиной отказа PROTAC первого поколения. Они снизили количество tPSA и HBD при сохранении приемлемого Log D 7,4, чтобы сбалансировать проницаемость и растворимость в PROTAC второго поколения, что дало обнадеживающие результаты. Однако талидомидный лиганд, нацеленный на CRBN, в PROTAC быстро разлагается при 37 ° C и pH 7.4 фосфатный буфер. Таким образом, они были нацелены на дальнейшую оптимизацию проницаемости в третьем поколении, чтобы быстрее приводить к более высоким свободным внутриклеточным концентрациям. При лечении PROTAC CCT367766 третьего поколения, нацеленного на пирин, можно было наблюдать почти полную деградацию пирина при обработке всего лишь 50 нМ и всего 2 часа воздействия. Масс-спектрометрия всего протеома показала хорошую селективность PROTAC CCT367766.

Рис. 34

Представитель PROTAC пирина.

PRC2 (EED-target)

Репрессивный комплекс 2 Polycomb (PRC2) включает три основных субъединицы: развитие эмбриональной эктодермы (EED), энхансер гомолога zeste 1 (EZh2) или EZh3 и супрессор гомолога zeste 12 (SUZ12). 301 PRC2 обладает активностью гистон-метилтрансферазы (HMT), которая устанавливает и поддерживает моно- или три-метилирование лизина 27 гистона 3 (h4K27). Сложная сеть белок-белковых взаимодействий между EED, EZh3 и SUZ12 необходима для каталитической активности PRC2. 302,303,304 Сообщалось, что PRC2 ведет себя как онкоген, так и как супрессор онкогенеза при различных типах рака. EZh3, EED и SUZ12 обычно имеют повышенную регуляцию, а также подвержены мутациям при некоторых видах рака, таких как рак молочной железы, колоректального рака и рака простаты. 302,305 Таким образом, нацеливание на PRC2 для лечения рака стало эффективной стратегией. В настоящее время эффективное ингибирование каталитической активности PRC2 достигается за счет воздействия как на EED, так и на EZh3. Несмотря на клинические разработки нескольких ингибиторов EZh3 (например, UNC1999, GSK126, EPZ-6438, CPI-1205 и DS-3201b) и EED (например, EED226, A-395 и MAK683), лекарственная устойчивость наблюдается и сохраняется ограничение для этого класса молекул. Следовательно, необходимы новые подходы для преодоления наблюдаемого сопротивления.

Группа Lindsey I. James впервые сообщила о химическом деструкторе PRC2, UNC6852, который содержал лиганд, производный от EED226, и лиганд VHL (фиг. 35). 306 UNC6852 сильно разложил EED и EZh3 со значениями DC 50 0,79 ± 0,14 мкМ и 0,3 ± 0,19 мкМ, соответственно, в то время как SUZ12 показал меньшую деградацию. Кроме того, UNC6852 блокировал гистон-метилтрансферазную активность EZh3 и ингибировал пролиферацию клеток DB (линия клеток DLBCL, несущая мутант EZh3 Y641N) с EC 50 из 3.4 ± 0,77 мкМ после 9 дней лечения, что было аналогично ингибиторам EED226 и UNC1999

Рис. 35

Представитель PROTAC PRC2.

RIPK2

Серин-треонинкиназа RIPK2 является важным медиатором врожденного иммунитета для передачи сигналов NOD1 и NOD2. 307 NOD1 и NOD2 представляют собой цитозольные рецепторы для производных бактериального пептидогликана, таких как мурамилдипептид (MDP), которые связаны с активированным RIPK2 и привлекают киназы, такие как TAK1, IKKα, IKKβ и IKKγ, для активации NF-κB и MAPK.Это приводит к экспрессии различных воспалительных белков и антибактериальных белков, активации аутофагии и презентации антигена. Сигнальный путь NOD-RIP2 особенно важен для воспаления кишечника и иммунитета слизистой оболочки дыхательной системы, который регулируется убиквитинизацией.

Группа Crews разработала молекулу PROTAC, нацеленную на RIPK2, PROTAC_RIPK2 ( 63 ), которая дала D max > 95% при концентрациях более 10 нМ и DC 50 = 1.4 нМ 205 ​​ (рис.36). Затем они рассмотрели один из аспектов действия PROTAC: субстехиометрический катализ, при котором одна молекула PROTAC способна индуцировать убиквитинирование и деградацию множества молекул целевого белка. Чтобы определить каталитическую природу PROTAC_RIPK2, они определили абсолютное количество RIPK2 с помощью жидкостного сцинтилляционного анализа в реакциях, содержащих 0,50, 1,0 и 2,0 моль PROTAC, что привело к 1,7, 3,4 и 4,0 пмоль модифицированного RIPK2, соответственно, что соответствует стехиометрии 3.3, 3.4 и 2.0. Эти данные свидетельствуют о каталитическом способе разложения PROTAC. Однако они думали, что каталитическая способность была недооценена для клеточной среды и полиубиквитинирования. Протеомное исследование клеточной количественной экспрессии также выявило высокую специфичность в отношении деградации мишеней.

Рис. 36

Представитель PROTAC RIPK2.

Rpn13

Rpn13 связан с регуляторным компонентом 19S протеасомы и захватывает убиквитинированные белки в качестве субстрата для деградации через протеасому 20S. 308 Затем убиквитиновые фрагменты удаляются из захваченного субстрата с помощью деубиквитинирующего фермента UCh47 на протеасоме 19S, который затем разворачивается ААА-АТФазами для дальнейшей опосредованной 20S протеасомой деградации. Ингибирование протеасом является эффективной стратегией лечения множественной миеломы (ММ), но нацеливание на различные компоненты убиквитин-протеасомной системы остается неуловимым. Экспрессия Rpn13 выше в клетках ММ и играет важную роль в росте и выживании клеток ММ.И РНК-интерференция, и ингибиторы подтвердили, что Rpn13 был лекарственной мишенью для ММ. 309

Чаухан и его коллеги разработали деструктор, WL-40, связав ковалентный ингибитор Rpn13 RA190 с лигандом CRBN 309 (рис. 37). Ковалентное связывание RA190 с Rpn13 может блокировать распознавание полиубиквитинилированных белков для последующей деградации протеасомой. В клетках, обработанных WL40, уровни Rpn13 были максимально (95%) снижены через 16 часов. Важно отметить, что в отличие от бортезомиба, который может избирательно ингибировать протеасомные активности 20S и, следовательно, приводить к агрегации полиубиквитинированных белков с более низким молекулярным весом, WL40 блокирует только протеасому 19S и предотвращает деубиквитилирование субстратов, что приводит к образованию полиубиквитинированных белков с более высокой молекулярной массой.Кроме того, WL-40 запускал мощную анти-MM активность в присутствии цитопротекторного микроокружения опухоли BM, преодолевал устойчивость к бортезомибу и был активен в контексте мутантного p53. WL40 индуцировал стрессовую реакцию ER / UPR и передачу апоптотических сигналов p53 / p21 быстрее, чем RA190. Кроме того, исследование in vivo показало, что WL40 значительно ингибировал рост опухоли с половиной эквимолярной дозы RA190.

Рис.37

Представитель PROTAC Rpn13.

SGK3

Сыворотка / глюкокортикоид-индуцируемая протеинкиназа (SGK) является ключевой сигнальной молекулой PI3K, которая играет важную роль в регуляции пролиферации, выживания, инвазии и метастазирования клеток. 310 SGK-3, изоформа семейства SGK, играет важную роль в пролиферации и выживании клеток, особенно при раке груди, раке печени, колоректальном раке и раке простаты. 311,312 Недавние исследования показали, что SGK-3 сверхэкспрессируется в клетках рака груди и что его ингибитор может значительно ингибировать пролиферацию клеток рака груди. Однако известные в настоящее время ингибиторы SGK-3 имеют низкие значения IC 50 и селективность. 313 ​​ Таким образом, кажется, что оптимизация и определение характеристик PROTAC, специфичного для SGK3, особенно привлекательны.

Дарио Р. Алесси и его сотрудники впервые разработали PROTAC-конъюгат ингибитора 308-R SGK со связывающим лигандом VH032 VHL, нацеленный на деградацию SGK3 314 (фиг. 38). Соединение 65 индуцировало 50% -ную деградацию эндогенного SGK3 при 0,3 мкМ в течение 2 часов, а максимальная деградация 80% наблюдалась в течение 8 часов в клетках HEK293. В отличие от ингибитора, разложитель обладал хорошей селективностью, которая не разрушала близкородственные изоформы SGK1 и SGK2. Деградатор также может подавлять пролиферацию линий злокачественных клеток ZR-75-1 и CAMA-1 по сравнению с ингибитором PI3K (GDC0941).

Рис. 38

Представитель PROTAC SGK-3.

Smad3

Smad3 является важным переносчиком в сигнальном пути трансформирующего фактора роста β (TGF-β), который отвечает за прямой перенос сигнала TGF-β из внеклеточного пространства в ядро ​​и регуляцию экспрессии гены-мишени. 315,316 Известно, что уровень экспрессии и функциональное состояние Smad3 влияет на процесс передачи сигнала, включая рост, пролиферацию, развитие, дифференцировку, миграцию и апоптоз клеток. 316,317,318 Было подтверждено, что сверхэкспрессия Smad3 связана с фиброзом печени и фиброзом почек, особенно при различных заболеваниях почек, таких как обструктивная нефропатия, диабетическая нефропатия и гипертоническая нефропатия. Следовательно, стратегия конструирования новой химерной молекулы, нацеленной на протеолиз (PROTAC), которая может предотвращать фиброз почек за счет нацеливания на убиквитинирование и деградацию основного интрацитоплазматического Smad3, имеет большое значение.

Ван и его коллеги провели скрининг низкомолекулярных лигандов, которые связываются с Smad3, а затем использовали молекулу для синтеза целевого соединения 319 (рис.39). Они наблюдали небольшую деградацию после обработки 1 мкг 66 в лизатах клеток ACHN.

Рис. 39

Представитель PROTAC Smad3.

STAT3

STAT3 принадлежит к семейству STAT, которое состоит из семи членов, включая STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B и STAT6. Они разделяют консервативный домен Src-homology 2 (Sh3), который отвечает за гомодимеризацию посредством фосфорилированного Tyr 705 и последующей трансактивации. Следовательно, ингибиторы, нацеленные на домен Sh3 для нарушения гомодимеризации PPI, были ограничены гомологичной селективностью.С другой стороны, только частичная транскрипционная активность STAT3 может быть подавлена, потому что мономерный STAT3 все еще остается активным. Хотя эмбриональная летальность наблюдается у мышей с нулевым STAT3, первичные мышиные фибробласты растут почти со скоростью у мышей с нулевым STAT3 как фибробласты дикого типа, что указывает на то, что STAT3 является незаменимым в нормальных клетках. 320 Однако, как транскрипционный фактор, STAT3 играет решающую роль в онкогенезе, регулируя гены, связанные с выживанием, пролиферацией, инвазией и метастазированием клеток.STAT3 был предложен в качестве особенно привлекательной мишени для потенциальной терапии рака.

Учитывая, что разработка эффективных и селективных ингибиторов STAT3 остается сложной задачей, совсем недавно группа Ванга разработала мощные и специфические деструкторы PROTAC, нацеленные на STAT3, которые продемонстрировали большой терапевтический потенциал in vivo для AML и анапластической крупноклеточной лимфомы (ALCL) 321 ( Рис.40). Сначала они провели оптимизацию на основе своего предыдущего ингибитора домена Sh3 STAT3 CJ-887 и получили лиганд, названный SI-109, с высоким сродством к STAT3 и хорошей проницаемостью для клеток.Сокристаллическая структура STAT3 с SI-109 была решена и руководствовалась разработкой PROTAC путем привязки SI-109 и аналога леналидомида. Деструктор SD-36 продемонстрировал высокую активность в клетках AML и ALCL. Он ухудшил> 90% STAT3 в клетках AML в течение 4 часов и> 50% STAT3 в ячейках ALCL. Серия экспериментов по спасению подтвердила, что SD-36 является настоящим PROTAC, а не молекулярным клеем. Что еще более важно, SD-36 показал превосходную селективность, поскольку другие члены семейства STAT не могли быть разрушены или связаны.Некоторые мутации STAT3, такие как D661Y, K658R и Y705F, также эффективно разрушались SD-36. SD-36 истощал как мономерный, так и димерный STAT3 в клетках AML в концентрации 1 мкМ после обработки в течение 5 часов; таким образом, транскрипционная активность STAT3 была сильно и специфически ингибирована. Например, все его нижестоящие гены, такие как BCL3, HCK, HGF, JAK3, PIM1, SOCS3 и VEGFA, были подавлены. SD-36 индуцировал апоптоз за счет активации каспазы-3/7 и расщепления PARP; при этом уровень STAT3 в митохондриях также был снижен.SD-36 эффективно индуцировал деградацию опухолей ксенотрансплантата STAT3 и достиг полной и длительной регрессии опухоли у мышей. После анализа других тканей мыши, таких как печень, селезенка, сердце и почки, было обнаружено, что SD-36 вызывает глубокое истощение STAT3 в этих тканях, но его безопасность оказалась хорошей.

Рис. 40

Представитель PROTAC STAT3.

TBK1

TANK-связывающая киназа 1 (TBK1) является серин / треониновой киназой и неканоническим членом семейства IKK с множеством клеточных функций в области врожденного иммунитета, туморогенеза и развития. 322 Что еще более интересно, некоторые эксперименты с РНКи показали синтетическую летальность K-Ras с TBK1. 323 Однако последующие отчеты поставили под сомнение эту гипотезу. 324

Вместо RNAi группа Crews разработала нацеленные на TBK PROTAC, которые можно использовать в качестве инструментов для исследования взаимосвязи между TBK1 и мутантами K-Ras 322 (рис. 41). В качестве отправной точки они выбрали кристаллическую структуру TBK1, связанного с ингибитором. После модификации на основе структуры с доступным соотношением структура-активность (SAR) ингибитор использовали в качестве нацеливающего на белок фрагмента VHL PROTAC.Систематический обзор длины линкера показал, что PROTAC с линкерами менее 12 атомов не демонстрируют заметной активности деградации из-за стерических конфликтов в тройном комплексе. Представитель PROTAC 67 с линкером из 15 атомов показал высокую эффективность клеточной деградации (DC 50 = 12 нМ) и максимальную деградацию ( D max = 96%). Они дополнительно модифицировали фрагмент, нацеленный на белок, и лиганд VHL, чтобы изучить больше SAR. Была протестирована способность PROTAC 67 деградировать неканоническую киназу IkB IKKε, близкий гомолог TBK1.Хотя ингибитор проявлял плохую селективность в отношении TBK1 по сравнению с IKKε (значения IC 50 1,3 нМ против 8,7 нМ), PROTAC 67 не влиял на уровень IKKε. Они предположили, что селективность является результатом дифференциального представления их поверхностных лизинов VHL и его реакционноспособного компонента тиоэфира убиквитина E2, что приводит к различной эффективности переноса убиквитина. Кроме того, различие в образовании и стабильности тройного комплекса может способствовать селективности.Наконец, оценивали эффект пролиферации клеток PROTAC 67 как в линиях мутантных клеток K-Ras (h33, A549 и h2792), так и в линиях клеток K-Ras дикого типа (h3110 и HCC827). Результаты показали, что в этих клетках не было значительной разницы, что указывало на то, что TBK1 не был синтетически летальным для мутанта K-Ras.

Рис.41

Представитель PROTAC TBK1.

TRIM 24

Адресный карман белка часто не имеет функционального значения при заболевании.Это верно для мультидоменного, содержащего бромодомен регулятора транскрипции TRIM24. Было высказано предположение, что TRIM24 является зависимым от многих видов рака, однако сильнодействующие и селективные лиганды для бромодомена TRIM24 не вызывают эффективных антипролиферативных ответов. 325

В 2018 году группа Брэднера разработала PROTAC, dTRIM24, для деградации TRIM24 путем привлечения убиквитинлигазы VHL E3 326 (рис.42). Деструктор вызвал сильную и селективную деградацию TRIM24 с максимальной деградацией при 5 мкМ.Используя dTRIM24 для исследования функции TRIM24, они охарактеризовали динамические последствия потери TRIM24 для всего генома на локализацию хроматина и контроль генов. Кроме того, они определили TRIM24 как новую зависимость при остром лейкозе. Попарное исследование деградации TRIM24 по сравнению с ингибированием бромодомена выявило усиленный антипролиферативный ответ от деградации. dTRIM24 предложил химический зонд нарождающейся зависимости от рака и открыл путь для многочисленных селективных, но неэффективных лигандов для белков, представляющих терапевтический интерес.

Рис. 42

Представитель PROTAC, нацеленный на TRIM 24.

Sans simulator roblox bruh

14 августа 2019 · Классический симулятор знакомств Newgrounds, только на этот раз он происходит в блочном мире Minecraft! Если вы думаете, что ваши социальные навыки бесполезны, подумайте еще раз.

Симулятор — это игра в Roblox, которая пытается имитировать реальное действие, ситуацию или объект в бесконечном прогрессе. Часто в симуляторах игроки либо щелкают, не касаются или удерживают повторно, либо подходят к определенному объекту, чтобы получить какой-то внутриигровой предмет, чтобы достичь максимума, который игрок может удерживать.

15 июня 2020 г. · Я стал супер-сайянским богом в аниме-боевом симуляторе Roblox. … Бру, я говорю тебе, я действительно могу превратить Супер Саянского бога. … Санс Андерфелл говорит: 15 июня 2020 г., 11 …

Fortnite на roblox name как играть в Strucid Battle Royale коды roblox wiki boku no roblox remastered коды коды для boku no roblox remastered 2019 unboxing simulator wiki Strucid промокоды 2019 Коды симулятора распаковки Strucid Battle Royale boku no. Только что взял мою полностью обновленную модель производительности 3.

ROE HACK ™ ¥ ï¸ ðŸŽ®CHEAT ROE Ring Of Elysium HACK PC ✅ Wallhack, Aimbot, Esp, Cham 12 01 2019😠L потерял мою учетную запись из-за проблемы входа в систему roblox 😠robloxapp 201 1513127 Как проверить свою учетную запись Roblox на Discord

Sans simulator roblox bruh. 75 результатов Sans Simulator 2 Player Edition борется за проезд, но не для того, чтобы так сильно шалить, как говорит Saiyan бог без андерфелла, июнь Dusttale sans fight scratch Dusttale

Bienvenue dans notre super collection des meilleurs Jeux Fortnite, à la frontière entre le FPS et le multijoueur de type «bac à sable»! Ici sur Silvergames.com, tu peux jouer à des Jeux com gratuits Fortnite Battle Royale, без оплаты и надписи.

Вы всегда можете вернуться за кодами Sans Fight Simulator, потому что мы еженедельно обновляем все последние купоны и специальные предложения. Посмотреть больше. Коды Roblox sans Fight Simulator Коды для Undertale Multiverse Battles Ultimate sans Battles коды Sans multiversal battles коды Коды Flygeil twitter

Repêchage junior de la KHL

Logo du repêchage de la KHL 2011

Le Repêchage junior de la KHL était anné rétéle Cours de laquelle chaque franchise de la Ligue continentale de hockey (KHL) systématiquement sélectionné les droits disponibles amateur hockey sur glace joueurs asyates aux critères d’éligibilité au repêchage (17–21 человек, pas de KHL VHL), MH Contra.Le repêchage junior de la KHL a eu lieu une fois par an, généralement dans les deux à trois mois suivant la final de la précédente saison. Подвеска le repêchage, les équipes sélectionnaient à tour de joueurs amateurs parmi junior, des ligues collégiales ou européennes.

Премьер-эссе в Европейском Союзе за 1 июнь 2009 г., за последний сезон КХЛ и за его замену в конце 2016 года. [1] Михаил Пашнин, выпускник ЦСКА Москвы, новый Премьер-министр joueur à être repêché lors du repêchage junior de la KHL.Премьер-юниор КХЛ составляет 85 побед, больше 188 побед в Бруийоне 2010 года, количество победителей в этом сезоне было увеличено. Cependant, le nombre de joueurs repêchés a diminué dans le Brouillon 2011, avec 134 joueurs repêchés. Максимальный номер прибыл в 2014 году, когда было получено 208 билетов на текущий момент. Всего, au Cours des 8 années, 1 241 joueurs ont été repêchés, soit une moyenne de 155 joueurs repêchés par an.

Доступные участники

Tout européen ou Nord Américain les joueurs âgés de 17 ans et de moins de 21 и n’ayant pas de contratactif avec une KHL, MHL or VHL équipe, étaient érêchage for le repêchage junior de la KHL de cette . [2]

Ordre de rédaction

Les équipes avec les trois pires records de saison régulière (ou une équipe impliquée dans un change avec une telle équipe où un choix au repêchage était inclus dans l’échange et, le cas échéant, une équipe de la KH). Cours de la saison) имеет право участвовать в лотерее, которая не ле, но является решающей для выбора троих премьер (ou quatre selon les circonstances).

Лист шашек для юниоров КХЛ

Voir également

Les Références

Afk Naruto погасить код

afk naruto погасить код 7bjg7rk4hb.грамм. 3. Обменяйте этот подарочный код на свитки призыва и другие эксклюзивные награды (действует до 13 августа 2021 г.) (Новинка) ZH97B9W2. 9233-2643-4249 КОПИРОВАТЬ КОД. 6. Авторские права © 2020. Приложение отправляет идентификатор пользователя и проверяет код подтверждения, получает идентификационные данные пользователя и использует любые выбранные подарочные коды. Если вы хотите использовать коды в Dragon Adventures, вам просто нужно нажать кнопку профиля и найти пункт меню «Коды» в верхней части окна. 133. Теперь нажмите на тот, на котором написано «Выкупить». Коды для Roblox — Anime Battle Simulator (август 2021 г.) ›Обзор лучших онлайн-курсов на сайте www.html? id = GTM-MQ5FZJQ «> Вам необходимо включить. Sandy Tracks — Wandering Balloon. Он нарушает закон или требования любого соответствующего регулирующего органа; коды активации второй годовщины! Это награды за вторую годовщину, есть еще 4 I думаю, но я их еще не знаю. Прочтите руководство по поиску и использованию кодов погашения, а также список всех известных в Ultimate Ninja World! Коды активации можно получить в особых событиях (например, в прошлогоднем рождественском мероприятии) и Опросы, проведенные онлайн-модераторами Наруто, которые обычно находятся здесь, в разделе «Новости» официальных форумов.9 февраля 2021 г. · Коды Dragon Blox Ultimate 2020. 24 августа 2021 г. · Награды за погашение кодов AFK Arena. о и погашать обновления поддержки управления версиями API. st4yw1th4m! — Кодовое вознаграждение: несколько бесплатных вращений при первом использовании. Как использовать коды погашения в Rise of Kingdoms. Afk naruto список кодов погашения. Подарочный код Naruto Idle Legend. Теперь нажмите на Профиль игрока. Это руководство содержит информацию о том, как играть в игру, использовать коды и другую полезную информацию. Откройте это меню, и вы найдете текстовое поле «внутренний код» внизу.Шаг 2: Как только вы нажмете на него, откроется экран с заголовком «Меню настроек». Промокоды событий roblox 2018, коды подарочных карт Roblox 2017 Неиспользованные коды фото 1 Bee Swarm Simulator Wiki Fandom Руководства по событиям Roblox Новости Последние изображения с Newsweek Com Коды Roblox Wings 2018 Розыгрыш Robux 2019 Сентябрь Промокоды Roblox 15 мая 2019 Бесплатные коды Robux для кодов погашения Roblox 10 сентября 2020 г. — Содержание. Коды простаивающих пустошей — август 2021 года. D! 28 июля 2021 г. · Как погасить коды в Anime Mania? Все, что вам нужно сделать, это зайти в Anime Mania и найти кнопку «Коды» в нижней части экрана.31 августа 2021 г. · Последнее обновление 31 августа 2021 г. HP: Чем больше у вас HP, тем больше урона вы можете получить. Если хотите, пройдите экскурсию по следующей ссылке: www. победа: погасите этот код и получите награду. Шаг 1: Войдите в игру. Подарочный код Наруто онлайн — поиск кодов купонов. ком / нс. 2020.. Окончательная погоня Автор: DragonRage. Мы также обновили списки кодов для большинства игр Roblox. Вот все новые коды Roblox Naruto War Tycoon, которые вы можете использовать, чтобы получить новые дзюцу для своих армий ниндзя и доминировать над своими противниками.Просто / Trade Hangout Roblox Wikia. Почти 2019 год! — Уровень повышен. ад. Заработайте Robux вместе с нами сегодня и купите себе новую одежду или что угодно в Roblox. ВОДА — обменяйте код на x2 Удачи. нажмите «выгода» вверху экрана. Получите все коды и сведения о Наруто: Ultimate Ninja для PlayStation 2. 7 января 2021 г. Используйте эти подарочные коды, чтобы получить множество наград. 31 августа 2021 г. · Эти коды Roblox Action Tower Defense активны и могут быть использованы для получения наград: Likes1000 — используйте этот код, чтобы обменять 500 монет и 50 драгоценных камней.Если вы уже использовали их, не волнуйтесь, награды останутся с вами. Полный список кодов Roblox Strucid для игр, ноябрь 2020 г. 7 января 2021 г. · Коды погашения — это специальные коды, которые разработчики AFK Arena выпускают для игроков, которые они могут использовать в игре. 28 июля 2021 г. · Коды (рабочие) ROD777: погасите этот код и получите 10 бесплатных розыгрышей. Код активации. Нажмите «Выполнить», когда ваш компьютер отобразит соответствующий запрос, чтобы начать процесс установки. Что касается отслеживания Couponxoo, онлайн-покупатели могут недавно получить экономию в среднем 24%, используя наши купоны для покупок в Naruto Redeem Code.Торговый Hangout Roblox Ask Robux Free больше не доступен, вот; Получить список кодов; Тонны кодов для разных руководств Переключить меню AFK Arena среди Fortnite Genshin Impact Pokemon Valorant Warframe World Tanks Промо-коды Бизнес-меню Переключить блог Хостинг Маркетинг SEO Сделки в социальных сетях Меню Переключить Amazon Razer О меню Переключить Рекламу с помощью. Стоимость баффа увеличения урона составляет 50 алмазов за 30 минут, поэтому, если вы посчитаете, 100 алмазов в час. Коды шкафчиков и жетоны VC THANKYOUMYTEAMCOMMUNITY Шанс на 3 жетона, 1500 MT или пакет базовой лиги.SL2 !: Используйте этот код, чтобы заработать 2000 денег в качестве бесплатного вознаграждения. Подарочные коды Trading Legend — август 2021 года. В большинстве игр Roblox вы также можете использовать коды. Код погашения кодов Naruto Slugfest — июнь 2021 года — Mejoress. Baca juga: Redeem Code Hokage Ultimate Storm terbaru 23 марта 2020 г. · Код погашения Naruto Slugfest: список кодов погашения. Вот список всех новых ответов Summoners, коды июль 2021A, которые можно использовать в игре, чтобы получить бесплатные преимущества качества без каких-либо уловок или методов модификации: a. Каковы новые коды Crisis S, а также как получить бесплатные предметы, такие как золото или множество наград? Вы на правильной странице! Кризисные коды S 2021.Их можно найти на нашей странице кодов аниме-мании! Если вы отчаянно нуждаетесь в драгоценных камнях, вам следует часто проверять коды. Бывший помощник генерального директора Мэрилина Мэнсона говорит, что «аура Эвана Рэйчел Вуд потемнела», когда с ним был Ким Новак, четверг, 18 февраля 2021 года, 20:51. Поделитесь этим… 143 говорят об этом. Фактически, эти коды выдаются игрокам в честь завершения определенного этапа в игре. 100 уровень разнообразия Deathrun BY: Punti_ 32. 2V8FS9M0. imbaaack — обменять на пропуски. Вам нужно будет перебросить своего персонажа, пока вы не получите способность с уровнем не ниже 4.является предметом жалобы; 4. Вот список последних кодов Roblox Naruto RPG Beyond в сентябре 2021 года, которые вы можете использовать, чтобы получить бесплатные награды, такие как вращения, попытки,. Вы должны набрать 1 500, 3000 или 6000, 12 000 или 15 000 баллов Microsoft Rewards. 17. HZ84F-HG82V-WPD76-37AYT-921DW Шанс получить до 3 Sos Автор: Avicii Код песни Roblox Автор: Zzgaming Малыш Йода Рэп Roblox Id Приложения Roblox в Google Play Приложения roblox в Google Play cyberspaceandtime com представьте драконов птиц код roblox и код id roblox и id для «Представьте драконов птиц», Топ-10 крупнейших блюзовых идентификаторов и получите бесплатную доставку N255899a Подарочная карта Roblox 25 Walmart Com Walmart Com Pubg Mobile Погашайте коды Май 2020 г. Последние новости Break Learn.Чтобы использовать коды в Unconventional, вам сначала нужно повысить уровень своего персонажа до 4. maghskm36u новый код 25 декабря; w5p484cekf новый код 24 декабря; t7vnu6r439 новый код последний код 25 ноября. Затем нажмите активировать код активации. Жизненные коды Роблокса Шиндо (Активные) ЯДУННО! — погасив код, вы получите 90 вращений. update2190 — обменять на пропуски. Номер кода погашения 1 — idle888. Шаг 3. GamePlayReview, опубликованный 5 января 2021 г., 751 просмотр. Разработчики раздают коды купонов AFK Dungeon, которые дадут вам бесплатное золото, бесплатные драгоценности и бесплатные имитирующие ключи! Эти коды можно погасить в игре, и они помогут вам прогрессировать намного быстрее в этой бездействующей ролевой игре — совершенно бесплатно! В этом руководстве мы покажем вам список всех активных кодов купонов AFK Dungeon и то, что вы получите при их использовании.Это не только бесплатно, но и разработчик Lilith Games регулярно выпускает кучу кодов AFK Arena, которые, как и следовало ожидать, предоставляют вам кучу бесплатных внутриигровых вещей, которые позволят вам намного быстрее прогрессировать в этой ролевой игре Gacha. . Введите код в текстовое поле и нажмите кнопку ОК, чтобы получить награду. Код активации AFK Arena будет показан на видео. Каждый код уникален и может быть получен, участвуя в мероприятиях форума. Как и во многих играх Roblox, в Anime Mania есть коды, которые можно обменять на драгоценные камни и золото.27 марта 2021 г. · Больше игровых кодов Roblox Codes. Коды рубашек Roblox — найдите свой любимый идентификатор футболки в 2021 году. После того, как вы найдете Свиток Духа Хвостатого Зверя, вы можете разблокировать его на вкладке режимов в игре. dqy4aq3pyw — 30 свитков призыва + 888 алмазов + 8888 монет лабиринта + 8888 монет героев — добавлено 29 июля. Спасибо. танцевальный инструмент, вывеска trade afk и игрушка isaac00299 @ isaac00299 (11 февраля 2021 г.). Затем нажмите кнопку «Погасить код». Вы не получите Robux в качестве награды, но вы можете получить игровые награды, такие как монеты, деньги, алмазы, драгоценные камни, домашних животных, оружие или эксклюзивные предметы для игры.С этим кодом Idle Legend вы получите х300 алмазов, 20К золотых монет, х100 духовных камней. Мы не включаем сюда коды с истекшим сроком действия SL2, потому что их было много, и кажется, что коды также очень быстро истекают в Shindo Life. Сражайтесь с другими игроками в режиме арены PVP. Подарочные коды GLOBAL666GLOBAL999GLOBAL8881. G. Миллионы пользователей уже получили выплаты с помощью генератора Robux. Приведенные ниже коды были выпущены разработчиком игры Anime World i. Вы можете выполнить следующие действия, чтобы получить коды в Dragon Ball Rage: Launch Dragon Ball Rage.Дополнительные читы и коды для игр вы также можете проверить: Код погашения кодов Naruto Slugfest — февраль 2021 г. antonioeccellente. Больше информации . Так что не бойтесь и просто нажимайте кнопку в сообщении. Все ролевые игры Naruto: Shinobi Origin New и OP, рабочие коды, активные и действительные. Коды I Am Hero AFK Tactical Teamfight. ЛЮБИМАЯ КАРТА. d14m0nd5 — вы можете заработать 100000 золота и 100 алмазов. Сегодня мы представляем вам удивительный генератор слитков Naruto Online для всех игроков, которые играют в Naruto Online.welcometorod: погасите этот код и получите x10 Обычный билет из пула, x777 драгоценных камней, x3 AFK EXP 6h, x5 AFK Gold 6h. Позволяет игрокам обмениваться внутриигровыми предметами, такими как шкуры, шляпы, спинки, спреи, красители, Крункер. В новом сезоне NBA 2K выглядит лучше, чем когда-либо. 11 августа 2021 г. · Найдите наш список новых кодов Naruto Slugfest 2021, которые работают сегодня. 24 ноября 2020 г. · Список кодов активации Afk Naruto. HW2020 — Погасите код для бесплатного питомца. AFK Arena — увлекательная игра с уникальным графическим стилем. Получите бесплатное вознаграждение.8. AFK Meme. Скрипт анти-афк ахк — послух. Узнайте, как обрабатываются данные вашего комментария. Иногда бывает сложно найти все доступные бесплатные коды MTG Arena в одном месте. Примечания к патчу 70. Он включает в себя коды активации, которые все еще действительны, а также старые, которые иногда все еще могут работать. Они часто предлагают бесплатные награды, чтобы продвигать новые вещи и помогать начинающим или опытным игрокам быстрее развиваться. Код 1 — FREEDRAW10 (0m: 24s) Код 2 — FREEDRAW100 (1m: 20s) Войдите в систему и оставьте комментарий первым.19 апр, 2021 · Как активировать код Наруто Слагфест? Чтобы иметь возможность требовать коды погашения в этой игре, вам потребуются: Шаг 1: «В игре нажмите на награды», Шаг 2: Затем вы должны нажать кнопку «Погасить код». 2021 nowherecoredeal 250 драгоценных камней 21. Шаг 1: Войдите в игру и войдите в лобби. J0HNRBX: используйте этот код, чтобы получить John Tower XP, а также монеты или деньги в качестве награды. лилит. POWER — активировать код для Open Egg Faster Boost. Чтобы получить этот код, нажмите аватар бездействующего героя в верхнем левом углу.AFK Naruto IDLE Game Gameplay2021 Бесплатные коды погашения. Нажмите на нее, и откроется окно погашения кода. 10 ИГРОКОВ: Используйте этот код, чтобы получить 100 опыта, а также 100 монет в качестве награды. Вы увидите область текстового поля, где вы можете ввести код. Сделки 2 часа назад 24 ноября 2020 г. 13 июня 2020 г. · Наруто Онлайн Читы, которые работают. Щелкните RobloxPlayer. Очистить: отрегулируйте атрибут снаряжения, попробуйте! Ты можешь это сделать! 3. 25 апреля 2020 г. · Ини диа список kumpulan beberapa game mirip mobile legends offline ян дапат калиан майнкан.Чтобы получить доступ к вкладке режимов, нажмите клавишу «M» в игре, выберите вкладку «Sub-Ability» и прокрутите вниз до [MODE], чтобы увидеть все режимы в игре, а также те, которые вы разблокировали. 24 февраля 2021 г. · Roblox Swordburst 2 New Speed ​​Hack Code 2018 с исправлением F8 позволяет получать ценную информацию о своих сделках и принимать обоснованные решения о покупке. 3598-6755-2041 КОД КОПИИ. games 17 августа 2021 г. · Коды MTG Arena: окончательный список — обновлен в августе 2021 г. Коды Astroneer — полный список (август 2021 г.) 21 октября 2020 г. · Это список предстоящих игр gacha, которые будут выпущены во всем мире на английском языке.BZZZZZ — обменять код на x10 шансов секретных питомцев на 1 час. 000 слитков, с этим онлайн-генератором вы можете получить НЕОГРАНИЧЕННОЕ количество 100% БЕСПЛАТНО. ОФАНОТЕРОН — Получил 30 000 долларов. 30 марта 2020 г. · Magic Revenge: Mighty AFK RPG Совет № 3: Описание характеристик атрибутов. Найдите коды Afk Arena, включая сотни способов приготовления еды. 2- Найдите кнопку вознаграждений (вверху в центре) 3- Прокрутите вниз и нажмите на код активации. Игровая платформа Instaplay — это мобильная игровая платформа, на которой можно мгновенно играть в новейшие и самые популярные мобильные игры без необходимости их загружать! Начните играть прямо сейчас на www.2 일 전. 2021 г. Затем введите подарочный код, чтобы получить приз. Список кодов погашения ROS, апрель 2021 г. (Коды с истекшим сроком действия) Ниже приведен список кодов погашения ROS. 25 мая 2021 г. · Новые * коды Naruto Slugfest и коды погашения 2021. 30 августа 2021 г. · 77Valentine2021 — погасите этот код погашения Idle Legend до 20 августа 2021 г. Также вы можете найти здесь все действующие РПГ Naruto Beyond (игра Roblox от Bb Studio) в одном обновленном списке. 27 августа 2021 г. · Если вы сожгли все доступные коды аниме-воинов, другой способ получить кристаллы для призыва — просто AFK.О. На данный момент нет активных кодов активации 3reqr. 4. Все. Это рабочий чит для всех систем (android и ios)! Этот генератор очень быстрый, через несколько минут ресурсы будут в вашем аккаунте. Ee782f1676a2 со стены желаний. 21 октября 2020 ·. выкупить код дари суату игра bertemakan наруто яиту афк ниндзя арена. Скопируйте и вставьте его отсюда. Коды погашения AFK Arena. Ee767d51ae0b Общий уровень взноса 2. Просто введите необходимую информацию вместе с кодом погашения.16. Канал уведомлений AFK для тех, у кого есть веская причина исчезнуть на длительный период времени. Найдите аватар игрока в левой части экрана и щелкните по нему. 3255-7490-0349 КОПИРОВАТЬ КОД. maghskm36u новый код 25 декабря 17 августа 2021 · Коды выкупа на арене Afk (рабочие) Вот список всех действующих кодов: dqy4aq3pyw — код погашения на 888 монет героя, 888 алмазов, 888 жетонов лабиринта и 30 обычных героев. Свитки. 4- Скопируйте и вставьте коды из нашего списка и нажмите ОК.1. (Ваш проверочный код меняется каждые 2 минуты). Шаг 4. См. Afk_redeem_api. Если вы хотите ввести коды в Anime Fighting Simulator, чтобы получить некоторую бесплатную валюту, вам просто нужно найти ярко-синий значок Twitter в левой части экрана. Likes300 — используйте этот код, чтобы обменять 1500 монет и 50 драгоценных камней. от Oc Co. Код искупления Idle Legend. 24 января 2020 г. · К счастью, есть способ получить множество наград бесплатно в виде кодов погашения. е. 9, торговля была долгожданным событием.Коды для Naruto Slugfest: Redeem Code & 5 Best Tips, Android, iOS Strategy Guide и. Окончательный подарочный код Наруто. toca world pubg mobile lite pubg mobile kr цифровой мир наруто игра capcut car gta san andreas vpn. Веб-сайт для обмена видео Playtube Pk Ultimate. 10 ноября 2019 г. · 3S8KZMC: используйте этот код, чтобы получить 50 опыта, а также 250 долларов в качестве награды. Последние коды выкупа самураев тренируют новую эру мобильного геймплея Naruto idle legends. 240. Если код не работает, попробуйте еще раз на VIP-сервере. Все рабочие коды AFK Arena.uf4shqjngq — 30 свитков призыва — добавлено 1 мая. КОДЫ (9 дней назад) Код активации Naruto Online 2021 — 07/2021. Все действующие коды Naruto RPG Beyond Beta в одном обновленном списке — Roblox Games от Bb Studio — с большинством кодов вы получите бесплатные попытки или вращения в качестве награды, но коды скоро истекают, так что поторопитесь и погасите их все: Содержание [скрыть ] 1 Наруто RPG Beyond Codes — Полный список. 15 августа 2021 г. · + несколько пользовательских диалоговых окон на стороне сервера (простой html), e. 29 марта 2020 г. · Совет № 1 от Naruto Slugfest: улучшайте снаряжение.Проверьте наш каталог бесплатных кодов рубашек и легко найдите ID своей любимой футболки в Roblox. Members300 — Используйте этот код, чтобы обменять 500 монет и 50 драгоценных камней. Коды AFK для арены, август 2021 г. (активные коды) Вот список активных кодов, которые вы можете использовать для получения наград в этой игре. Улучшение: Увеличьте уровень снаряжения, чтобы усилить атрибуты. Список кодов Crisis S обновляется каждый раз, когда для игры выпускается новый. Вы можете легко получить доступ к информации о «Кодах активации Наруто в Интернете», нажав на большинство из них.Введите свой код в открывшееся окно и нажмите кнопку «Подтвердить». Полная форма AFK находится далеко от клавиатуры. Как покупать еду у горожан. Коды с истекшим сроком действия Shindo Life. В верхнем левом углу экрана нажмите МЕНЮ. Время от времени разработчики AFK Summoners выпускают новые коды погашения, которые вы можете использовать в игре, чтобы получить бесплатные награды. 16 окт.2020 г. · Статья: как погасить коды арены Afk Думаете, как погасить коды арены Afk, чтобы поесть? Мы вас прикрыли.7. После того, как вы разблокируете и экипируете лучшего хвостатого духа. com / Authenticate / SignIn? redirectUrl = https% 3A% Подарочные коды GLOBAL666GLOBAL999GLOBAL8881. Активируйте коды как можно скорее, так как срок их действия может истечь. Новые действующие коды погашения для Idle Legend. ActionTowerDefence — используйте этот код, чтобы выкупить 150 драгоценных камней. 4 августа 2020 ·. Tatakai — это игра-файтинг Roblox, выпущенная в июне 2020 года и насчитывающая более 5 миллионов посещений Roblox. Как использовать код: Откройте вашу игру. на данный момент нет просроченных кодов.танцевальный инструмент, торговый знак AFK и игрушечное снаряжение. дротик. Коды погашения — это форма подарочного кода, который выдается время от времени или обнаруживается игроками, который может зацепить вас бесплатными наградами, особенно бриллиантами. Сегодня я делюсь с вами кодами активации Ultimate Ninja. Каналы и мероприятия для объединения сообщества, такие как совместные игровые сессии, причудливые хедканоны, сеансы потоковой передачи фильмов, оценка музыки, неканоническая RP в песочнице (чтобы лучше почувствовать своего персонажа), RP без DC и классы для облегчения.Ch4atc0de — обменять код на 100к золота и 100 алмазов. Как и все игры на этом сайте, будь то для мобильных устройств, ПК, консолей (ps4 и xbox), код погашения Naruto Slugfest предназначен для улучшения, помощи и вознаграждения игроков. 2 сен, 2020 · Обновлен список кодов шкафчиков NBA 2K20. Ознакомьтесь с обновленным списком бесплатных кодов активации PUBG Mobile 2020. Условия использования | Политика конфиденциальности | Политика использования файлов cookie | Политика конфиденциальности | Политика использования файлов cookie Перейти к основному содержанию. Последний рабочий код / ​​CDK был выпущен 7 апреля 2020 года.com 1- Откройте игру и выберите уже созданный класс персонажа. нажмите на слово коды, скопируйте один из кодов из нашего списка, вставьте его в поле «введите код здесь» и 15 июля 2021 г. · Boku No Roblox: Remastered Codes Апрель 2021 г. — наш Roblox Boku No Roblox: Remastered Codes предоставляет самая последняя подборка операционных кодов, на которые можно было погасить код. Сал обсуждает чит-коды, созданный им журнал Nintendo Power Magazine, видеоигры, в которые он любит играть, где Джокеры играют в игры во время турне, крутые вещи, которые делает Сал, когда заканчиваются Непрактичные Джокеры, и многое другое.Квесты иллюзий Автор: Наголрад. Одной из причин, по которой игра является несправедливой, является высокая цена валюты, 100 долларов за 5. Нажмите «ОК», как только вы успешно установили Roblox. Задайте вопрос или добавьте ответы, посмотрите видеоуроки и поделитесь своим мнением об этой игре / приложении. Ee756167d033 Общий уровень взносов 1. 7 мая 2021 г. · Эти коды были проверены. Утро — Темная ворона. Посмотреть источник. ОНИ ГДЕ-ТО БЫЛИ ПОТЕРЯЛИ! — погасите код и получите 2x Exp. 05 янв.2021 · Подписаться 138.2021 illbewatchingyou 300 Gems 16. update2115: обменять на пропуски: 7 июня 2021 · Погасить коды. нажмите ссылку https: // в соотв. Вы получите свои награды по внутриигровой почте. rellEmberBias! — погасив код, вы получите 90 вращений. update2225 — обменять на пропуски. 28 ноября 2020 г. 2 июня 2021 г. · Просто следуйте приведенным ниже инструкциям, чтобы использовать коды для получения вознаграждений. 25 мая 2021 г. · Активные коды погашения Ultimate Ninja World: 4OF0E24E80U5; 3QY24ME6E004; Как активировать коды Ultimate Ninja World: сначала откройте игру и перейдите в меню своего аватара.Он в основном используется в сообщениях или текстовых сообщениях в разговоре между людьми. Для итальянских фанатов я открыл # блог для всех поклонников # технологий, # игр, # аниме и # манги. 08. Проверьте, не истек ли срок действия кодов AFK Arena. Разработчики игры не публикуют их слишком часто, но иногда они могут быстро истечь. Купить Naruto Shippuden: Ultimate Ninja Storm Legacy — PS4 [Цифровой код]: прочтите обзоры видеоигр — Amazon. Коды NBA 2K Mobile — Купоны на июль 2020 г. CURRYFAM RUBYJOKER HOODIEMELO […] MerelyTrade Hangout Roblox Wikia — Торговые коды Hangout Wiki | Главные новости Германии.Независимо от того, новичок он или профессионал, все имеют право на одинаковые награды. Категории. После установки нажмите «Присоединиться» ниже, чтобы присоединиться к акции! Руководства Переключить меню AFK Arena среди Fortnite Genshin Impact Pokemon Valorant Warframe World Tanks Промокоды Бизнес-меню Переключить блог Хостинг Маркетинг SEO Сделки в социальных сетях Меню Переключить Amazon Razer О меню Переключить Рекламу с помощью. Мы также добавили ссылку на скачивание этой игры для iOS и Apk. Иди в свой город. Эти простые рецепты — все, что вам нужно для приготовления вкусной еды.mvqr, zqk, ztn, wa, cqmde, xuj, cqpl, ue, ruu, prlm, um, ovit, hvh, kbj, jftr, ppp, vgm, ga, qve, ukkv, yzkvd, pk, zcue, lwz, ovck, vhl, henbb, dxz, zcd,. Кодовый номер 1 — «7fc77c08d2bbb97304d9454311442420». С максимальным количеством кодов вы получите отличные награды, но коды скоро истекают, так что будьте краткими и используйте их все: ShinobiLife2 !: Используйте этот код, чтобы заработать 2000 денег в качестве бесплатного вознаграждения. ForTheOne: погасите этот код и получите x1 Книгу тайн, x1 Зелье статов IV, x1 костюм барона, x1 барона Туинга, x1 кушак барона (действительно до 30 мая 2021 г.)В темноте Deathrun BY: i. stillonthegrind — обменять на пропуски. Кроме того, вы можете просто перейти в раздел событий, где находится интерфейс кодов Godzilla vs Kong Redeem Codes. что случилось? есть это isaac00299 @ isaac00299 (09 февраля 2021 г.). Все принадлежит JM Ninja World. В игре есть много кодов простоя Dragon Ball. Последние имеющиеся подарочные коды: t7vnu6r439 7bjg7rk4hb FREEDRAW10 FREEDRAW100 n 25 мая 2021 г. · Новые * коды Naruto Slugfest и коды активации 2021. Шаг 2. Посмотрите это видео, чтобы узнать, как можно бесплатно получить 888 алмазов для игры AFK Arena.28 ноября 2020 г. · Как получить SSS в AFK Naruto / Naruto Idle Legend. 2021fathersday: активируйте этот код и получите награду. Trade Hangout Roblox Спросите Robux бесплатно Получите бесплатные коды Robux 2020 Погасите коды сейчас, промокоды Roblox, единственный рабочий способ получить бесплатные коды Roblox, который действительно работает. com. Поиск Перейдите на вкладку «Настройки», затем нажмите «Проверочный код», вернитесь на https: // cdkey. Используя эти коды Naruto Slugfest, вы можете легко заработать бесплатные награды. 31 августа 2021 г. · 31 августа 2021 г. Мы проверили наличие новых кодов AFK Arena. Если вы из тех мобильных геймеров, которые любят бесплатные игры, то AFK Arena — игра для вас.com / afk-global и введите номер кода подтверждения из приложения. playShind0! — погасите код, получите 45. 3. Затем введите подарочный код в. Если вы говорите об интерфейсе, который требует промокода, то с момента открытия игры практически не было никаких активных кодов. AFK Redeem — погашение кодов AFK Arena. Коды погашения Ultimate Ninja World [обновлено] 27 августа 2021 г. Хобби Частные · Только вы можете получить доступ к этому списку. Введите код «2019» для одноразового подарка в виде 100 бесплатных домино! эй, просто в торговой тусовке, 3 моих предмета исчезли.нажмите «выгода» вверху экрана. Спасибо, что посетили Roblox. 28 мая 2021 г. · Все последние коды AFK Arena для бесплатных алмазов, камней души, золота, свитков героев и способов их использования в игре. 27 мая 2021 года: мы проверили наличие новых кодов AFK Arena. Геймер, который любит бесплатные вещи, то AFK Arena — игра для вас. Она не только бесплатна, но и разработчик Lilith Games регулярно выпускает кучу кодов AFK Arena, которые, как вы можете ожидать, предоставляют вам. io Вики Fandom.Подпишитесь 131. Чтобы помочь вам быть в курсе всех новостей. Избегайте чит-кодов для взлома Ultimate Ninja AFK в целях собственной безопасности, выбирайте наши советы и рекомендации, подтвержденные профессиональными игроками, тестировщиками и такими же пользователями, как вы. 15 декабря 2019 г. — NBA 2K Mobile CODES 2019/2020 Это новый сайт NBA 2k мобильных кодов погашения, который даст вам возможность получить NBA… Код активации Free Fire (14 августа 2021 г.) · Код активации Free Fire India на сегодня : TJ57-OSSD-N5AP · Награды: 3 промо-кода Roblox ваучера на оружие Royale — бесплатные головные уборы, одежда и многое другое. У нас есть полный рабочий список последних промо-кодов Roblox, включая эксклюзивные предметы и все остальные виды бесплатных подарков. .геймплей. [Электронная почта защищена] 2 августа 2021 г., автор: A. 5ucc355! -Кодовое вознаграждение: несколько бесплатных вращений при первом использовании. Это код усилителя чакры. 13 августа 2021 г. · Как активировать коды Naruto Slugfest? Чтобы активировать коды Naruto Slugfest, вам нужно будет выполнить следующие шаги: Откройте игру и выберите уже созданный класс персонажа. В мире Интернета на арене мемов AFK подписаны 6148 человек. googletagmanager. . «Используйте код FIDGET, чтобы разблокировать бесплатный непоседу.Игра Mirip Mobile Legend Offline Lig Xis. c0lOSsEuM — Повышение уровня. Большая часть опыта Roblox Shindo Life вращается вокруг выполнения ваших дел ниндзя, повышения уровня и траты очков для развития ваших боевых способностей. Хотите БЕСПЛАТНЫЕ предметы Roblox? Получите последний промокод Roblox с Coupert. КОДЫ НАГРАДЫ; ROD777: активируйте этот код и получите 10 бесплатных розыгрышей: welcometorod: активируйте этот код и получите x10 обычных билетов пула, x777 драгоценных камней, x3 AFK EXP 6h, x5 AFK Gold 6h: победа: погасите этот код и получите награду: COOLSUMMER: используйте это код и получите награду: 2021fathersday: погасите этот код и получите награду Instaplay Gaming Platform — это мобильная игровая платформа, на которой можно мгновенно играть в новейшие и самые популярные мобильные игры без необходимости их загружать! Начните играть прямо сейчас на www.Разработчик: AFK Redeem. Вот наш полный список кодов Naruto War Tycoon, которые вы можете обменять на игровые денежные вознаграждения и другие бесплатные подарки, которые помогут вам. Узнайте, как обменять их на ценные награды. Dragon Quest Tact Издатель / Разработчик: Nexon Дата выпуска: 2021Google Play Подружитесь, тренируйте и приведите команду монстров к победе! Нанимайте красочный состав существ из легендарной серии DRAGON QUEST и участвуйте в чудовищных стратегических боях! СОЗДАЙТЕ ИСКЛЮЧИТЕЛЬНУЮ КОМАНДУ МОНСТРОВ! Соберите список монстров.16 часов назад · Очень хороший скрипт автофермы для boku no roblox. Celebrity GamerZ поговорил с Салом Вулкано о непрактичных джокерах. 4 августа 2021 г. · Коды с истекшим сроком действия Это список кодов с истекшим сроком действия, эти коды больше не могут быть погашены. TC555: Погасите этот код и получите награду. FREEDRAW10 Наруто6666 Наруто8888 Наруто9999. В раскрывающемся меню выберите КОДЫ. Вот рабочие коды AFK Arena. 11 августа 2021 г. · Коды мира аниме Roblox. Предложения3 часа назад Действительные коды Naruto Slugfest 2021 Naruto Slugfest Redeem коды 2021 Друзья, ознакомьтесь с этими кодами вознаграждений для получения захватывающих наград… 2021.152828706: Louis Vuitton — оригинал Jazwares представляет собой крупнейшую в мире виртуальную вселенную, создаваемую пользователями. Она оживляет невероятный мир Roblox с помощью захватывающей линейки фигурок и аксессуаров. 21 мая 2021 г. · Погашение кодов совсем не требует времени, и все, что вам нужно сделать, это найти рабочий код. Генератор слитков Наруто онлайн. И легко зарабатывайте такие награды, как ваучеры mmon, игровые валюты и многое другое…. На глобусе играть в Roblox каждый день ищут коды Rocitizens 2021, чтобы получить деньги.После ввода кода нажмите кнопку погашения, и награды должны поступить в ваш почтовый ящик. Если у вас есть еще вопросы об игре или код не сработал, дайте нам знать в комментариях. Ожидайте глюков и багов. Как активировать Demon Tower Defense Simulator OP Рабочие коды Нажмите на значок Twitter (правая сторона экрана). Средняя подготовка, ученик на испытаниях, испытания воинов и тренировочная арена. 1951-3457-5267 КОД КОПИИ. КОДЫ (только сейчас) Код активации Naruto Online 2021 Купоны, промокоды 07-2021.как покупать еду в тусовке rocitizens Biggrannys на YouTube v155. Игра Ини Биса Терголонг Бару Карена Рилис Пада 17 июня 2021 Дан Баньяк Секали Иклан Менгенаи Игра Ини Бербагай Макам Социальные СМИ. Home Gaming I Am Hero Коды выкупа Tactical Teamfight AFK — август 2021 г., 9 января 2021 г. · Геймплей AFK Naruto — набор браузерных игр S SS Ninjas Pack 10 Хидан, Шикамару (Шиппуден), Саске (Шиппуден), Ли (Шиппуден). dangS0nWearU! — При первом использовании кода вы получите 90 вращений. Xiaban886 — 500 бриллиантов — добавлено 20 мая 2021 г.Откроется страница погашения кода. ›Проверено 2 дня назад› Url: Go Now ›Получить больше: НедвижимостьПоказать всю аренду Задать вопросы, связанные с играми Szynsz Сообщений: 22 Зарегистрирован: 09 мар 2017, 03:33 07 авг 2018, 07:31 Здравствуйте, я ищу простую антивирусную программу. afk script, tak 18 ноя, 2020 · Как погасить коды в Dragon Ball Rage. Откройте для себя уникальные идентификаторы черно-белых Adidas, Nike, Supreme, ABS, рубашек с капюшоном или футболок для мальчиков и девочек в Roblox. ниндопик. Веб-сайт, показанный в видео, для погашения. он нарушает применимые законы об интеллектуальной собственности или нарушает авторские права Enjoyongame или любой другой третьей стороны; 5.SPD: Скорость определяет порядок действий героя в раунде. «Последний шанс активировать код 100 домино (11 февраля 2021 г.) Разработчик игры на @Roblox. На данный момент есть один способ получить 1 код активации: использовать Google Chrome для входа в свою учетную запись и затем нажать« Активировать Flash » который находится. hr. tips Courses. 311j4hw00d — Погасите код на 100k золота и 100 бриллиантов. CODES (4 дня назад) За последние 90 дней было найдено 12 новых результатов онлайн-подарочных кодов Naruto, что означает, что каждые 8 ​​новых Наруто онлайн подарочный код результат вычислен.Коды активации можно получить в специальных мероприятиях (например, в прошлогоднем рождественском мероприятии) и в опросах, проведенных онлайн-модераторами Наруто, которые обычно находятся здесь, в разделе «Официальные форумы» — «Новости». М. Это очень просто, и вы можете получить слитки Naruto Online, не платя за это — 100%. Знаменитая стадия Roblox продолжает развиваться, в последнее время к ней прибывает 115 миллионов динамичных клиентов из месяца в месяц. Обновление 1. Все действующие коды размеров аниме в одном обновленном списке — Roblox Games от Albatross Games — Срок действия кодов истекает через несколько дней, поэтому погасите их быстро и получите все призы, например, игру с новыми наградами 31 июля 2021 г. · Как погасить коды.- активный код OOFANOTHERONE — активный код FR33C4SH (илиFR33CASH) -активный код 228617206: Это Хэллоуин REMIX. Вот несколько способов получить sss ninja. 9058-2968-2050. TC888: погасите этот код и получите x888 Diamonds и т. Д. Код активации afk naruto.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

ОСТАВЬТЕ СВОЮ ПОЧТУ
Клеточная линия Мутация PROTAC Боевая часть DC 50 (нМ) D макс (%) 33 лапатиниб 39,2 97,6
HeLa (сверхэкспрессированный мутант) Экзон 20 ins 33 90 лапатиниб 7 лапатиниб 72 68,8
HCC827 Exon 19 del 34 гефитиниб 11,7 98,9
h4255 904 65 904 904 904 904 904
h2975 L858R / T790M 35 афатиниб 215,8 79,1

МАГАЗИН

ТЕЛЕФОН: +7 (495) 177 - 72 - 37

РЕКВИЗИТЫ

ИП Шаталова Мария Александровна
Россия, Москва, Станиславского 25 к1
ИНН 771895335367
р/с 40802810838000030398
в ПАО СБЕРБАНК
кор/счет 30101810400000000225
БИК 044525225
ОГРНИП: 315774600362360

НАШ ИНСТАГРАМ