Самая новая лада 2018: LADA Granta седан — Официальный сайт LADA

Напомним, о том, что региону остро необходим редкий прибор, стало известно во время визита детского омбудсмена Анны Кузнецовой. О готовности приобрести аппарат буквально в течение двух часов заявил президент фонда развития региона имени Манякина Степан Бонковский. Этот поступок оценили далеко не все. В областной избирком поступила жалоба.

«Когда речь идёт о спасении жизни ребёнка, нужно действовать оперативно. Степан Степаныч поступил по-военному, оперативно решил проблему, я считаю, что здесь не имел место подкуп, а речь идёт о спасении жизни ребёнка», — отметил депутат Государственной Думы РФ Дмитрий Перминов.

Действовать в таких ситуациях, когда речь идет о жизни и здоровье, нужно максимально оперативно, подтвердила и врач-педиатр Елена Павлинова. Зачастую медикам нужно в кратчайшие сроки поставить верный диагноз. Сейчас определить уровень аммиака в крови в регионе нельзя — техники нет. Хотя в год в Омской области рождаются 3-4 ребёнка, которым такой анализ необходим. Проявляется болезнь тяжёлым состоянием вплоть до комы. Впрочем, скоро все изменится. Аппарат поставят в регион в течение двух месяцев. Сейчас готовятся необходимые документы.

«Аппарат дорогостоящий, японского производства, большое значение имеет для ведения таких пациентов. И не только с этим заболеванием, но и других пациентов, поступающих в том числе в отделение интенсивной терапии. Это исследование проводится в кратчайшие сроки, непосредственно у постели больного, поэтому прежде всего заинтересованы отделения интенсивной терапии в оснащении этими приборами», — рассказала заведующая кафедрой госпитальной педиатрии Омского государственного медицинского университета Елена Павлинова.

В поддержку Бонковского высказалась и Ольга Коптева. Дочь женщины Настя страдает СМА — спинально-мышечной атрофией. В 2018-м вердикт врачей стал для семьи приговором. Болезнь прогрессирует и девочке срочно нужны индивидуальный аппарат искусственной вентиляции лёгких и специальный откашливатель. Купить оборудование сами Коптевы не могли, так как стоимость приборов огромная. Помог фонд развития региона имени Манякина. Женщина назвала возможное снятие Бонковского с выборов несправедливостью.

«У дочери СМА, нужна помощь. Обращаешься к человеку, и он просто помогает. Он помог не каким-то друзьям, я к нему пришла как человек с улицы», — отметила жительница посёлка Москаленки Ольга Коптева.

Сейчас Коптевы, как могут, борются за жизнь дочери. И даже боятся представить, что будет, если так нужные приборы не будут приобретены вовремя.

Фото: 12 канал.

Подписаться на канал Яндекс.Дзен

Подписаться на канал Телеграм

Taylor 322CE 12 Fret 2018 Grand Concert Acoustic Electric |

Артикул: USTO322CE12FT

Приобретенная непосредственно у Taylor Guitars, эта гитара звучит великолепно, находится в отличном состоянии — точно как новая, чистая, без дефектов и по цене, которую можно двигать … Грифы Taylor с 12 ладами немного короче Длина в масштабе 24-7 / 8 дюймов Grand Concert и переставленный мост, который находится ближе к центру нижней части схватки. Результатом является более тонкое ощущение руки, которое упрощает формирование аккордов и изгиб струн, а также тональный отклик, который может похвастаться удивительной мощностью, теплотой и сустейном для меньшего корпуса.Задняя и боковые панели из черного дерева создают сильный акцент на средних частотах с всплеском верхнего мерцания, в то время как верх из красного дерева помогает выровнять тональный отклик. Среди других отличительных особенностей — верх с заштрихованными краями, полностью сатинированная отделка, небольшие алмазные вставки из итальянского акрила, венецианский вырез и звукосниматель Taylor’s Expression System 2.

Серийный номер 1105188040

• Тропическое красное дерево с затененной кромкой Burst Top
• Performance Bracing с разгрузкой
• Три кольца, белая и черная розетка Soundhole в тонкую полоску
• Черная накладка
• Белая и черная отделка сверху в тонкую полоску
• Tasmanian Blackwood Средне-коричневое пятно на оборотной стороне и по бокам
• Ширина нижней части (15 дюймов) при глубине корпуса (4 3/8 дюйма)
• Черный переплет
• Венецианский разрез
• Тело и шея с атласной отделкой
• Стандартный вырезной гриф из красного дерева в тропическом стиле
• Длина шкалы 24 7/8 дюйма (общая длина 38 дюймов)
• Гайка клыка шириной 1 3/4 дюйма
• Ebony 18 Fret 15-дюймовая накладка на гриф
• Итальянский акриловый жемчуг Инкрустация «Мелкие бриллианты»
• Тюнеры Taylor со слот-головкой и кнопками Ivoriod
• Мостик из черного дерева с компенсированным седлом из микарты
• Булавки моста из черного дерева
• Taylor Expression System 2 (ES-2) Акустическая электроника
• Elixir (16052) Набор светомеров из фосфорной бронзы

• Taylor Deluxe Grand Concert Темно-коричневый жесткий футляр

DeepFRET, программное обеспечение для быстрой и автоматической классификации данных FRET одиночных молекул с использованием глубинной обучение

Существенные изменения:

1) Неясно, как предварительное обучение модели может учесть бесконечные возможные состояния FRET / время жизни / занятость / пути перехода / шум и т. Д.Как это может не смещать результаты, чтобы искать трассы, которые имеют отношение сигнал / шум и т. Д. К обучающим данным? Например, максимальная вероятность перехода между состояниями в наборе обучающих данных 0,2 может привести к смещению анализа в сторону долгоживущих состояний FRET. Авторы должны это прокомментировать.

Это действительно очень верный комментарий, который является центральным для процесса, поскольку существует бесконечное количество возможных перестановок данных FRET, а неправильное обучение модели может привести к смещенному выбору трасс.Мы благодарим рецензентов за то, что они позволили нам прокомментировать этот вопрос, так как это могло быть неясно в рукописи.

Чтобы внести как можно меньшее смещение в сторону конкретных состояний FRET, мы стремились сгенерировать репрезентативную часть всей выборки пространства smFRET, равномерно большого числа бесконечных возможных перестановок данных ( состояний FRET / времени жизни / занятости / путей перехода / шума ) . Чтобы проверить это и дополнительно охарактеризовать данные обучения, мы предприняли ряд осторожных шагов, которые описаны ниже:

a) Состояния и занятия FRET .Количество состояний FRET в данной трассе выбиралось равномерно от 1 до 4 состояний. Каждому состоянию случайным образом присваивалось значение FRET путем равномерной выборки от 0 до 1. Для трасс с более чем одним состоянием требовалось минимальное расстояние 0,1 FRET между состояниями (т. Е. Случайная единообразная выборка повторялась до тех пор, пока требование не было выполнено). способен отличать реальные переходы от шумовых колебаний. Мы проверили, что все состояния FRET, а также занятость 150 тыс. Трасс в обучающих данных были равномерно распределены между 0 и 1, как показано на рисунке 1 — приложение к рисунку 3A.Мы поняли, что это могло быть неясно в исходной заявке, поэтому мы подробно описали это в подразделе «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET» в новой версии. Кроме того, мы исправили легенду к рисунку 1 — добавление к рисунку 3A: «Трассы smFRET были сгенерированы с 1-4 случайно определенными состояниями FRET […]», поскольку из-за ошибки формулировки в нем говорилось, что трассы были сгенерированы с 1, 2 или 3 говорится в исходном сообщении.

б) Вероятность перехода и время жизни. Мы благодарим рецензентов за то, что они заметили ошибку формулировки в исходном материале «с вероятностью перехода ниже 0 и 0,2». Вероятность перехода для каждого кадра следа из заданного состояния в другое равномерно дискретизируется между 0 и 0,2. Вероятности перехода относятся к между состояниями, так что в системе с 4 состояниями с максимально допустимыми вероятностями перехода 0,2, объединенная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,2 * (4-1 состояния) = 0.6. С другой стороны, в системе с двумя состояниями с вероятностями перехода между состояниями 0,01, объединенная вероятность перехода в любом заданном кадре составляет 0,01 * (2–1 состояния) = 0,01. Таким образом, средний срок службы вышеупомянутых систем составляет 1 / 0,6 = 1,7 кадра и 1 / 0,01 = 100 кадров соответственно. Распределение времени жизни всех обучающих данных представляет собой равномерно взвешенное среднее по экспоненциальным затуханиям для каждого возможного количества состояний FRET и вероятностей перехода, как показано на рисунке 1 — приложение к рисунку 3B.Моделирование методом Монте-Карло на 10 000 трассировок с вероятностями перехода сэмплирования равномерно от 0 до 0,2 на 2–4 трассах состояний подтверждает, что наши обучающие данные соответствуют базовой модели (рисунок 1 — приложение к рисунку 3B). Следовательно, мы выбираем широкий диапазон вероятностей переходов, равномерно охватывающий как долгоживущие, так и короткоживущие состояния FRET, стремясь быть похожими на большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретных времен жизни. Признавая, что это могло быть неясно в рукописи, мы добавили новый рисунок 1 — рисунок 3B с распределениями времени жизни и моделированием Монте-Карло вместе с кратким описанием того, как они были получены в подразделе «Материалы и методы» «Синтетический smFRET». генерация данных ».

c) Путь перехода следует цепи Маркова, которая генерируется случайным образом из матрицы перехода с вероятностями, выбранными, как описано выше. Марковская цепь каждой моделируемой трассы генерируется с использованием реализации скрытой марковской модели пакета Python с открытым исходным кодом под названием pomegranate. Чтобы убедиться, что обучающие данные выбирают подмножество всех возможных путей перехода единообразно, мы построили график плотности переходов для n = 10 000 смоделированных трасс. Это убедительно иллюстрирует полностью случайный и однородный путь перехода, как и ожидалось.Признавая, что эта критически важная информация не была реализована в первоначальном представлении, мы добавили график как новый рисунок 1 — рисунок в приложении 3C, и внесли дополнительные пояснения в подраздел «Материалы и методы» «Генерация синтетических данных smFRET».

г) Уровень шума. Экспериментальные данные могут содержать выборку широкого диапазона уровней шума в зависимости от биологической системы, оборудования, экспериментальной установки и т.д. из основных истинных значений FRET.Затем к интенсивности был добавлен шум путем выборки из нормального распределения со значениями σ, равномерно распределенными между 0,01 и 0,30. Для имитации дробового шума поверх был добавлен дополнительный слой гамма-шума с вероятностью 0,8. Чтобы обосновать выбранный диапазон значений σ, мы построили моделируемые распределения FRET для различных уровней шума, как показано на рисунке 1 — приложение к рисунку 4. Широкий диапазон уровней шума, который мы выбираем в обучающих данных, напоминает большинство экспериментальных данных, не внося смещения в сторону конкретное SNR из-за единообразной выборки, поддерживающей наши обучающие данные, и, таким образом, модель не смещена в сторону конкретного SNR в заданном диапазоне значений σ.В пересмотренной версии как в подразделе «Производительность DeepFRET», так и в разделе «Обсуждение» мы разъяснили, что в режиме, в котором скорости перехода аналогичны временному разрешению визуализации, динамические трассы smFRET могут быть неправильно классифицированы моделью как зашумленные. Имитация трассировки и повторное обучение модели (или изменение настроек визуализации) решат эту проблему.

Мы признаем, что, несмотря на наши строгие попытки внести как можно меньшую систематическую ошибку путем единообразной выборки всех параметров, специализированные пользователи могут иметь лучшее суждение и знание своих конкретных систем, уровней шума, времени жизни состояний или вероятностей перехода среди других параметров.При обучении модели может существовать некоторая систематическая ошибка, определяющая пределы интервалов для выбранных параметров. Таким образом, если опытный пользователь хочет адаптировать модель для лучшего удовлетворения своих конкретных потребностей, DeepFRET реализует удобный интерфейс моделирования трассировки, в котором новые трассы FRET могут быть легко смоделированы на основе определяемых пользователем параметров (см. Рисунок 1 — приложение к рисунку 6). и используется для переобучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https://github.com/hatzakislab/DeepFRETModel). Мы дополнительно подчеркнули это в новом абзаце в разделе «Обсуждение».

2) Сравнение DeepFRET с человеческой точностью в выборе «чистых следов» не кажется подходящим сравнением (и, очевидно, быстрее). Ручной выбор трассировки, как правило, больше не является стандартным средством анализа данных smFRET с учетом свободно доступных автоматизированных альтернатив с открытым исходным кодом (например, HAMMY, ebFRET, SPARTAN и т. Д.). Сравнение с другими доступными программными пакетами важно, чтобы убедить пользователей в превосходной или, по крайней мере, эквивалентной производительности DeepFRET при автоматическом выборе трассировки.Авторы должны включить такое сравнение в исправленную версию рукописи.

Мы хотим подчеркнуть, что основная цель этой рукописи — предоставить интуитивно понятную платформу, требующую минимального вмешательства человека, которая, как прокомментировали рецензенты, «[…] может снизить порог для экспертизы smFRET, позволяя большему количеству ученых Воспользуйтесь преимуществами этого мощного инструмента », , вместо того, чтобы доказывать неправоту существующих надежных программных пакетов, разработанных и эксплуатируемых экспертами в данной области.Мы также признаем, что ручной выбор трассировки не должен быть стандартным средством анализа данных smFRET, но, несмотря на широкий спектр доступных пакетов программного обеспечения для анализа данных smFRET, только некоторые из них реализуют расширенную автоматическую сортировку трасс. HAMMY и ebFRET как рецензенты предложили сосредоточиться на извлечении кинетической скорости и предложить простые пороговые значения, основанные на интенсивности и значениях FRET. Удаление следов за пределами этих простых пороговых значений часто требует дополнительного ручного выбора. iSMS предлагает более продвинутую сортировку по интенсивности донора / акцептора, среднему FRET и средней стехиометрии для данных ALEX, а также автоматическое обнаружение фотообесцвечивания. SPARTAN предлагает более обширные реализации для автоматической сортировки (всего 26 параметров) и оптимизирован для данных, отличных от ALEX. Однако фактические пороговые критерии могут значительно различаться для каждой группы и экспериментальной системы (Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Yao et al., 2015). Специализированные группы хорошо обучены ориентироваться в этих множественных критериях и точно определять свои собственные, которые оптимизированы для работы с их конкретными системами (Aznauryan et al., 2016; Fessl et al., 2018; Gouge et al., 2017; Schärfen and Schlierf, 2019; Tsuboyama et al., 2018; Wu et al., 2018; Yao et al., 2015). Однако разнообразие этих критериев сортировки может внести ненужную систематическую ошибку в и без того сложную серию обработки данных, особенно с учетом того, что появление коммерческих инструментов быстро расширило сферу smFRET.

Чтобы напрямую ответить на комментарии рецензентов, мы выполнили два типа экспериментальных проверок. Сначала мы сравнили DeepFRET напрямую с возможностями сортировки HAMMY, ebFRET, SPARTAN и iSMS на смоделированных данных, достоверность которых известна. Затем мы сравнили SPARTAN и iSMS, у которых есть расширенные возможности сортировки, на наборах экспериментальных данных, опубликованных другими группами.

В первом случае мы объединили 200 смоделированных наземных трассировок smFRET с 1800 смоделированными трассами nonmFRET (Рисунок 4 — дополнение к рисунку 3A и Материалы и методы для распределений FRET и описаний параметров, соответственно) и реконструированные файлы TIF, которые будут соответствовать в необработанные данные smFRET.Мы смоделировали как данные ALEX, так и данные, не относящиеся к ALEX, поскольку iSMS оптимизирован для данных ALEX, в то время как HAMMY, ebFRET и SPARTAN оптимально работают с данными, не относящимися к ALEX. Файлы tif были загружены в соответствующие программные пакеты и использованы для извлечения и сортировки трасс с применением показателя качества 0,80 в DeepFRET, параметров сортировки по умолчанию в SPARTAN (кроме порога фонового шума), пороговых значений интенсивности, стехиометрии и FRET в iSMS, пороговых значений интенсивности. в порогах HAMMY и FRET в ebFRET. Мы обнаружили, что DeepFRET, SPARTAN и iSMS восстанавливают базовое истинное распределение FRET до различных уровней детализации, в то время как простые значения интенсивности и пороговые значения FRET для HAMMY и ebFRET потребуют дальнейшей сортировки для получения оптимальных результатов.Примечательно, что DeepFRET, как было обнаружено, сортирует трассы, по крайней мере, так же или лучше, чем SPARTAN и iSMS, без какой-либо настройки параметров (рисунок 4 — приложение к рисунку 3B). Мы настоятельно отмечаем, что опытные пользователи смогут точно настроить все возможные пороговые значения, чтобы лучше соответствовать достоверным данным. Однако в реальном эксперименте, где достоверная информация неизвестна, задача становится более сложной, и параметры точной настройки могут быть искажены, особенно для неспециализированных пользователей. Классификация на основе единого порога, предлагаемая DeepFRET, может иметь решающее значение для большего числа ученых, чтобы воспользоваться этим инструментом.

Во втором случае мы сравнили производительность трех программных пакетов, предлагающих расширенную сортировку, на экспериментальных данных, опубликованных другими группами. Выбор наборов данных, отличных от ALEX и ALEX, опубликованных Kilic et al. (Kilic et al., 2018) и Hellenkamp et al. (Hellenkamp et al., 2018), соответственно, обеспечивает надлежащее тестирование в различных настройках FRET и наборах данных. Мы использовали практически настройки по умолчанию в обоих программах и обрезали данные до первых 10 кадров каждой кривой, минимизируя обесцвечивание без использования жесткого порога по умолчанию при FRET <0.2 в СПАРТАНСКОМ. Наш анализ показывает, что все три пакета программного обеспечения способны воспроизводить опубликованные распределения FRET из необработанных файлов tif с небольшими расхождениями (рисунок 4 - приложение к рисунку 4). DeepFRET демонстрирует производительность, эквивалентную или превосходящую существующие сложные программные пакеты, также на экспериментальных данных. Мы подчеркиваем, что существующие программные пакеты очень надежны, и опытные пользователи смогут перемещаться и оптимизировать все необходимые настройки для отдельных наборов данных.Сила DeepFRET заключается в его способности анализировать как данные ALEX, так и данные, не относящиеся к ALEX, воспроизводимым образом, требуя лишь минимального вмешательства человека и, следовательно, минимального опыта в установке пороговых значений, a , что позволяет большему количеству ученых воспользоваться преимуществами этого мощного орудие труда. Признавая отсутствие сравнения с существующим программным обеспечением, мы добавили новый рисунок 4 — рисунки 3-4. Мы также переименовали подраздел «Производительность DeepFRET на реальных данных» в «Производительность DeepFRET на реальных данных, сравнение с существующим надежным программным обеспечением для анализа smFRET», а также добавили новый параграф в раздел, в котором подробно обсуждается сравнение на смоделированных реальных данных и опубликованные данные.

3) Аналогичным образом, лучший способ доказать возможности анализа трассировки DeepFRET — это взять несколько наборов данных и сравнить результаты анализа HAMMY, ebFRET и т. Д. С DeepFRET. Авторы должны включить такой сравнительный анализ более чем одного набора данных в исправленную версию рукописи.

Чтобы ответить на комментарий рецензентов, мы напрямую сравнили производительность DeepFRET с опубликованными результатами на двух экспериментальных наборах данных (ALEX и не-ALEX) в разных группах (рисунок 4 — приложение к рисунку 4 и ответ на комментарий 2).Мы обнаружили, что DeepFRET смог воспроизвести опубликованные распределения smFRET с использованием простого порога качества 0,80 без дальнейшего вмешательства человека, и, более того, так же или лучше, чем существующее программное обеспечение (см. Также ответ на комментарий рецензента 2). Эти данные дополнительно подтверждают производительность и мощность DeepFRET по сравнению с другим существующим программным обеспечением, требующим определенных пользователем пороговых значений, что может потребовать специальных знаний от пользователей. Мы объяснили сравнение в основном тексте и добавили новый рисунок 4 — приложение к рисунку 4 в рукописи.

4) Было бы полезно, если бы в разделе «Обсуждение» авторы могли обсудить ограничения инструмента. Обсуждение случаев, когда их инструмент может дать сбой, будет полезным для исследователей, которые хотят использовать свой инструмент или развить его. Например, в разделе «Материалы и методы» отмечается, что фотофизические эффекты, которые иногда наблюдаются в экспериментах с smFRET, могут быть проблематичными для метода (похоже, что инструмент, скорее всего, классифицирует их как бесполезные трассы, даже если они могут отражать «истинный» сигнал от эксперимента [e.грамм. наблюдение PIFE в работе от группы TJ Ha]).

После комментария рецензентов мы добавили новый абзац в раздел «Обсуждение», в котором описываются ограничения текущей версии DeepFRET и что можно сделать в будущем для ее улучшения. Как отмечалось в предыдущих разделах, DeepFRET точно работает как с смоделированными, так и с экспериментальными данными двухцветного smFRET в нескольких лабораториях. Ограничения, обсуждаемые в обновленной версии рукописи, могут быть устранены опытными пользователями путем моделирования новых обучающих данных и повторного обучения модели DNN в соответствии с нашими инструкциями (https: // github.com / hatzakislab / DeepFRET-Model), как описано в разделе Материалы и методы.

Артикулы:

Азнаурян, М., Сондергаард, С., Ноер, С.Л., Шиотт, Б., Биркедал, В., 2016. Непосредственный взгляд на сложную многопутевую укладку теломерных G-квадруплексов. Nucleic Acids Res. 44, 11024–11032. DOI: 10.1093 / nar / gkw1010

Фессл, Т., Уоткинс, Д., Оутли, П., Аллен, В.Дж., Кори, Р.А., Хорн, Дж., Болдуин, С.А., Рэдфорд, С.Е., Коллинсон, И., Тума, Р., 2018. Dynamic действие механизма Sec во время инициации, транслокации белка и терминации. eLife 7. doi: 10.7554 / eLife .35112

Gouge, J., Guthertz, N., Kramm, K., Dergai, O., Abascal-Palacios, G., Satia, K., Cousin, P., Hernandez, N., Grohmann, D., Vannini, А., 2017. Молекулярные механизмы Bdp1 в сборке TFIIIB и инициации транскрипции РНК-полимеразы III. Nat. Commun. 8, 130.

DOI: 10.1038 / s41467-017-00126-1

Schärfen, L., Schlierf, M., 2019. Мониторинг в реальном времени вызванных белком конформационных изменений ДНК с использованием одномолекулярного FRET.Методы 169, 11–20.

DOI: 10.1016 / j.ymeth.2019.02.011

Цубояма, К., Тадакума, Х., Томари, Ю., 2018. Конформационная активация аргонавта посредством различных, но скоординированных действий систем шаперонов hsp70 и hsp90. Мол. Ячейка 70, 722-729.e4. DOI: 10.1016 / j.molcel.2018.04.010

Ву, С., Лю, Дж., Ван, В., 2018. Анализ ферментного катализа, модулируемого конформационной динамикой, с помощью одномолекулярного FRET. J. Phys. Chem. В 122, 6179–6187.

DOI: 10.1021 / ACS.jpcb.8b02374

Яо, К., Сасаки, Х.М., Уэда, Т., Томари, Ю., Тадакума, Х., 2015. Одномолекулярный анализ целевой реакции расщепления ферментным комплексом Drosophila RNAi. Мол. Cell 59, 125–132. DOI: 10.1016 / j.molcel.2015.05.015

Динамическая структурная биология на основе FRET: проблемы, перспективы и призыв к практикам открытой науки

Понимание того, как биомолекулы соединяют структурную динамику с функцией, лежит в основе нескольких дисциплин и остается выдающейся целью биологии.Связывание конформационных состояний и их переходов с биохимической функцией требует способности точно определять структуру и динамику биологической системы, которая часто изменяется при связывании лиганда или находится под влиянием химических и физических свойств окружающей среды. Наиболее хорошо зарекомендовавшие себя инструменты структурной биологии предоставили с высоким разрешением «снимки» состояний в кристаллизованной или замороженной форме (например, рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия единичных частиц, криоЭМ) или усредненное по ансамблю всех конформаций. (е.g., ядерный магнитный резонанс, ЯМР; малоугловое рассеяние рентгеновских лучей, МУРР; малоугловое рассеяние нейтронов, МУРН; двойной электронно-электронный резонанс, DEER; поперечно-сшивающая масс-спектрометрия, XL-MS; ансамбль-FRET). В последние годы дальнейшие разработки позволили этим традиционным структурным инструментам обнаруживать конформационную динамику и промежуточные продукты реакции. Например, методы ЯМР (Anthis and Clore, 2015; Clore and Iwahara, 2009; Palmer, 2004; Ravera et al., 2014; Sekhar and Kay, 2019) и методы электронного парамагнитного резонанса (Jeschke, 2018; Jeschke, 2012; Krstić и другие., 2011) были продвинуты для изучения конформационной динамики и захвата временных промежуточных соединений. Кристаллографические исследования с временным разрешением использовались для определения функционально значимых структурных смещений, связанных с биологической функцией (Kupitz et al., 2014; Moffat, 2001; Schlichting et al., 1990; Schlichting and Chu, 2000; Schotte et al., 2003). ). Достижения в микрожидкостных устройствах для смешивания и распыления позволили использовать криоЭМ с временным разрешением (Feng et al., 2017; Kaledhonkar et al., 2018) и масс-спектрометрию с поперечными связями (XL-MS или CL-MS) (Braitbard et al., 2019; Brodie et al., 2019; Чен и др., 2020; Якобуччи и др., 2019; Мураками и др., 2013; Славин, Калисман, 2018). Прогресс в вычислительных методах также предоставил новые инструменты для изучения биомолекулярной структуры и динамики. Каждое из этих достижений подчеркивает возросшее понимание того, что необходимо напрямую и непрерывно отслеживать динамические свойства отдельных биомолекул, чтобы понять их функцию и регуляцию.

В этом контексте FRET (называемый резонансным переносом энергии флуоресценции или резонансным переносом энергии Фёрстера [Braslavsky et al., 2008]) исследования на ансамблевом и одномолекулярном уровнях стали важными инструментами для измерения структурной динамики по крайней мере на 12 порядков во времени и картирования конформационных и функциональных неоднородностей биомолекул в условиях окружающей среды. Исследования FRET, исследующие затухание флуоресценции на уровне ансамбля (Grinvald et al., 1972; Haas et al., 1975; Haas, Steinberg, 1984; Hochstrasser et al., 1992) (FRET с временным разрешением) позволили уже в начале 1970-х годов исследование структурных неоднородностей на временах, превышающих время жизни флуоресценции (несколько нс).Этот подход используется до сих пор (Becker, 2019; Orevi et al., 2014; Peulen et al., 2017) и перенесен в исследования одиночных молекул. Возможность измерения FRET в отдельных молекулах (Deniz et al., 1999; Ha et al., 1996; Lerner et al., 2018a) сделала этот метод еще более привлекательным. Одномолекулярный FRET (smFRET) широко используется для изучения конформационной динамики и биомолекулярных взаимодействий в стационарных условиях (Dupuis et al., 2014; Larsen et al., 2019; Lerner et al., 2018а; Lipman et al., 2003; Маргиттай и др., 2003; Мазаль и Аран, 2019; Michalet et al., 2006; Ореви и др., 2014; Ray et al., 2019; Sasmal et al., 2016; Schuler et al., 2005; Schuler et al., 2002; Steiner et al., 2008; Zhuang et al., 2000). Примечательно, что во многих механистических исследованиях достаточно использовать FRET для различения различных конформаций и определения кинетических скоростей, так что абсолютные эффективности FRET и, следовательно, расстояния не нужно определять. Однако возможность точного измерения расстояний и кинетики с помощью smFRET привела к его появлению в качестве важного инструмента в эту новую эру «динамической структурной биологии » для картирования биомолекулярных неоднородностей и измерения структурной динамики в широком диапазоне временных масштабов (Lerner и другие., 2018а; Мазаль и Аран, 2019; Санабрия и др., 2020; Шулер и Хофманн, 2013; Weiss, 1999).

Одномолекулярные методы FRET (smFRET) имеют много преимуществ в качестве метода структурной биологии, в том числе:

• чувствительность к макромолекулярным расстояниям (2,5–10 нм),

• способность разрешать структурные и динамические неоднородности,

• высококачественные измерения с низким потреблением образцов интересующих молекул (низкие концентрации и низкие объемы), поскольку образец анализируется по одной молекуле за раз,

• определение структурных переходов в состоянии равновесия, следовательно, без необходимости синхронизации,

• возможность обнаружения (очень) редких событий.Действительно, в биологии наиболее интересными для изучения молекулы часто являются редкие, функционально активные молекулы среди моря неактивных молекул,

• высокая чувствительность и специфичность для меченых молекул. Поскольку только меченая молекула вносит уникальный вклад в детектируемый сигнал, эти индикаторы также могут применяться в качестве FRET-репортеров в тесноте (Dupuis et al., 2014; Soranno et al., 2014; Zosel et al., 2020b) (отсюда smFRET может использоваться для проверки результатов, полученных изолированно, или обнаружения модуляции конформационных предпочтений и / или структурной динамики посредством так называемых пяти взаимодействий [Guin and Gruebele, 2019]), и

• высокая специфичность для остатков / доменов за счет специфической маркировки.Биомолекулы могут быть специально помечены уникальной парой красителей, что позволяет проводить измерения smFRET для всех размеров молекул, включая большие сложные сборки (см. Рисунок 1 [Kilic et al., 2018]), активные биологические машины (например, рибосомы) ( Dunkle et al., 2011) и даже на целых нативных вирионах (Lu et al., 2019; Munro et al., 2014).

Рабочий процесс моделирования динамических структур по измерениям FRET.

( A ) Интеграционное моделирование требует структурной и динамической информации. Предварительная информация из традиционных подходов (рентген, ЯМР, криоЭМ) вместе с вычислительными инструментами определяет пространство возможных решений для структурного моделирования с помощью FRET. Комбинация структурной (расстояния между красителями) и динамической информации (кинетическая связь и обменные курсы) позволяет идентифицировать непротиворечивую модель. ( B ) Изучение структуры и динамики хроматиновых волокон.Комбинированное TIRF и конфокальное FRET исследование структуры и динамики хроматиновых волокон с использованием трех позиций маркировки FRET (DA1-3) для двух пар красителей с различными расстояниями Ферстера. Расстояния Фёрстера (определены в разделе Расстояния между красителями, уравнение 6). Предварительная структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии (вверху слева) (Song et al., 2014) и рентгеновской кристаллографии (вверху, справа PDB ID: 1ZBB Schalch et al., 2005), объединена со структурной и динамической информацией. полученные в результате экспериментов FRET на иммобилизованных молекулах, измеренных с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF), и на свободно диффундирующих молекулах с помощью конфокальной микроскопии (Kilic et al., 2018). На основе объединенной информации получена согласованная модель конформаций хроматиновых волокон со смещенными регистрами, которые связаны медленными (> 100 мс) и быстрыми процессами декомпакции (150 мкс), которые протекают не напрямую, а скорее через открытое волокно. конформация. Рисунок 1B был воспроизведен с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018, Nature Communications с разрешения, опубликованном под Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY 4.0; https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /).

© 2018, Kilic et al. Панель B была воспроизведена с рисунков 1, 3 и 6 в Kilic et al., 2018 с разрешения, опубликованного в соответствии с Международной общественной лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

Несколько методов были использованы для определения структурных ансамблей, таких как ЯМР, одночастичная криоЭМ или XL-MS, а недавно также smFRET в интегративном / гибридном (I / H) подходе с компьютерным моделированием для преодоления разреженности экспериментальных данных. относительно атомистического описания (Берман и др., 2019; де Соуза и Пикотти, 2020; Димура и др., 2020; Gauto et al., 2019; Кукос и Бонвин, 2020; На и Пэк, 2020; Тан и Гонг, 2020; Webb et al., 2018). Структурные модели I / H, полученные из экспериментов smFRET с использованием расстояний между красителями в качестве ограничений, были описаны для гибких свернутых белков (Brunger et al., 2011; Hellenkamp et al., 2017; Margittai et al., 2003; McCann et al., 2012). ), конформационные ансамбли неупорядоченных / неструктурированных и развернутых белков (Borgia et al., 2018; Holmstrom et al., 2018; Schuler et al., 2020), нуклеиновые кислоты и комплексы белок-нуклеиновая кислота (Craggs et al., 2019; Craggs, Kapanidis, 2012; Kalinin et al., 2012; Lerner et al., 2018b; Muschielok et al., 2008). ; Возняк и др., 2008).

Еще одним уникальным аспектом исследований smFRET является то, что структурная, кинетическая и спектроскопическая информация о больших и сложных системах может быть записана одновременно в одном измерении. Это облегчает объединение динамической и структурной информации в интегративный подход к (рис. 1A) (Hellenkamp et al., 2017; Килич и др., 2018; Ли и др., 2020b; Санабрия и др., 2020; Вассерман и др., 2016; Янез Ороско и др., 2018):

• определить количество возможных структур, согласующихся с данными,

• потенциально снижает неоднозначность между различными структурными моделями, совместимыми с экспериментальными данными, а

• раскрывают структурно разрешенные динамические пути обмена.

В качестве примера на рисунке 1B показаны результаты мультимодального исследования smFRET конформационного ландшафта 12-мерного массива хроматина (~ 2.5 MDa) (Kilic et al., 2018) с динамикой, происходящей во временных масштабах от наносекунд до часов. SmFRET эксперименты могут обнаруживать гибкие конформации хроматина (рис. 1B, средняя панель), показывая их динамическую структурную неоднородность (рис. 1B, нижняя панель), в отличие от хорошо упорядоченных статических структур хроматиновых волокон (рис. 1B, верхняя панель). Эти гибкие, частично открытые и открытые конформации, которые довольно многочисленны в растворе (популяция> 70%; рис. 1B, нижняя панель), не были разрешены ранее, хотя они необходимы для правильной организации и функции генов.Они представляют собой центральный узел взаимопревращений для отдельных регистров стэкинга хроматина и их трудно обнаружить с помощью других структурных методов. Такой подход к визуализации биомолекул в действии в условиях окружающей среды подчеркивает важность их динамической природы, разрешая переходы между различными конформационными состояниями, что во многих случаях способствует их функции (Aviram et al., 2018; Henzler-Wildman et al., 2007; Iljina et al., 2020; Lerner et al., 2018b; Sanabria et al., 2020; Tassis et al., 2020).

SmFRET обычно выполняются с использованием двух подходов: с использованием иммобилизованных на поверхности молекул с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) и обнаружения на основе камеры или со свободно диффундирующими молекулами в растворе с использованием конфокальной микроскопии и точечных детекторов. Экспериментальные системы имеются в продаже, но обычно их изготавливают самостоятельно. Образцы подготавливаются, а данные собираются с использованием протоколов для конкретных лабораторий, где данные хранятся в различных форматах файлов и анализируются с использованием набора все более мощного программного обеспечения.Для полевых исследований в целом и для структурных исследований в частности важно продемонстрировать, что smFRET как метод воспроизводим и надежен независимо от того, где и как измеряется образец. С этой целью под руководством Торстена Хугеля двадцать лабораторий объединились для измерения smFRET на нескольких конструкциях дцДНК (Hellenkamp et al., 2018a). Изучая шесть различных образцов с разными красителями и различными расстояниями между красителями, средняя эффективность FRET, полученная участвующими лабораториями, показала удивительно высокую степень согласия (ΔE между 0.02 и 0,05 в зависимости от деталей образца). Количественная оценка и воспроизводимость измерений smFRET на основе интенсивности и обсуждение анализа данных стали важной вехой. Эти стандарты дцДНК FRET теперь доступны для ежедневной калибровки и особенно полезны для новых групп, присоединяющихся к сообществу.

Вдохновленный идеями, полученными в ходе вышеупомянутой попытки FRET (Hellenkamp et al., 2018a), были начаты новые многолабораторные слепые исследования.Следующее сравнительное исследование FRET, проведенное Thorben Cordes, исследует надежность и надежность экспериментов smFRET на белках, претерпевающих индуцированные лигандом конформационные изменения (Gebhardt et al., В стадии подготовки). В этом исследовании используются два различных модельных белка для оценки воспроизводимости и точности smFRET на основе белков для измерения расстояния между красителями. Белковые системы ставят новые задачи, включая статистическую маркировку красителей, специфичные для сайта свойства красителей, стабильность белков, транспортировку, хранение и конформационную динамику.Следовательно, в исследовании также оценивается способность smFRET обнаруживать и количественно оценивать динамику в различных временных масштабах от микросекунд до секунд. Еще одна задача FRET, инициированная Соней Шмид, — это программа kinSoftChallenge (http://www.kinsoftchallenge.com, Götz et al., В стадии подготовки), которая оценивает существующие инструменты для извлечения кинетической информации из временных траекторий одиночных молекул. Эта задача направлена ​​на: (1) продемонстрировать способность кинетического анализа на основе smFRET точно выводить динамическую информацию и (2) предоставить сообществу средства оценки различных доступных программных инструментов.

Одним из важных результатов различных исследований FRET в нескольких лабораториях было то, что, хотя согласие было хорошим, его можно было улучшить еще больше. В частности, анализ данных и, в частности, исправления могут повлиять на определенную эффективность FRET и результирующие расстояния. Следовательно, открытое обсуждение того, какие подходы работают наиболее надежно, при каких условиях необходимо. Доступ к первичным данным и возможность их обработки с помощью различных подходов к анализу были и останутся наиболее прозрачным способом продвижения вперед в этой области.В настоящее время это сложно, учитывая множество вариантов используемых методов, их документации, форматов файлов и экспериментальных процедур, применяемых в разных лабораториях, для установления оптимальных условий, рабочего процесса и передовых практик даже для существующих, хорошо протестированных методов, поскольку сравнение этих методов затруднительно. требует много времени, а необходимая информация во многих случаях недоступна. С расширением открытых научных практик и представлением опубликованных данных в репозитории необходим консенсус относительно того, какие данные и метаданные следует хранить и в каких возможных форматах, чтобы их могло легко использовать сообщество.

В связи с этими соображениями и множеством возможностей для роста сообщества smFRET, несколько лабораторий, обладающих опытом в FRET, без претензии на исчерпывающий или исключительный характер, собрались, чтобы поддержать эти усилия и предложить шаги по организации сообщества вокруг последовательной и открытой науки. практики. Это действие переводится в общие методологические рекомендации или предложения, которые мы представляем после типичного рабочего процесса эксперимента smFRET, включая подготовку и определение характеристик образцов, описание установки, сбор и сохранение данных, а также анализ данных.Эти рекомендации о том, как «практиковать» smFRET, являются , а не попыткой систематизировать сообщество, а скорее первоначальным предложением, которое направлено на поощрение открытого диалога о существующих практиках в нашей области и приводит к более высокой воспроизводимости результатов экспериментов smFRET. Затем мы обсуждаем практику открытой науки, а также первые шаги, которые были предприняты для формирования международного сообщества FRET. В заключение мы выделим несколько областей, в которых smFRET окажет большое влияние в различных областях науки в ближайшем будущем.

Платформа гибридных биосенсоров BRET-FRET для оптогенетики, химического скрининга и визуализации in vivo

Конструирование плазмиды

Комплементарная ДНК (кДНК), кодирующая mTurquoise, и кДНК, кодирующая mTurquoise-GL, были получены от Joachim Goedhart ⁴³ . кДНК для Turquoise2-GL, mTurquoise2 и Turquoise2 были получены сайт-специфическим мутагенезом с помощью ПЦР. Были введены следующие мутации: I146F (для Turquoise2-GL и mTurquoise2) ⁴³ и K206A (для Turquoise2-GL).Прототип ERK-биосенсора активности FRET, EKAREVnes, состоит из ECFP и YPet для донорных и акцепторных флуоресцентных белков соответственно ¹⁹ . В дальнейшем белки, происходящие из бирюзы, и ECFP вместе называются CFP. Точно так же белки, производные YFP, включая YPet и Venus, вместе называются YFP. Чтобы сконструировать биосенсор hyBRET для активности ERK, hyBRET-ERK, кДНК ECFP в EKAREVnes была заменена на PCR-амплифицированную кДНК, кодирующую слитый белок, состоящий из Turquoise2-GL dC10, Gly-Thr и RLuc8 S257G dN3, с использованием рестрикционного расщепления с последующим перевариванием. путем сборки ДНК с помощью набора для клонирования In-Fusion HD (Takara Bio, Otsu, Japan).Точно так же CFP в PicchuEV-x ^19,44,45 и RaichuEV-Ras ^19,46 были заменены тандемно связанными Turquoise2-GL dC10 и RLuc8 S257G dN3 для образования hyBRET-PicchuX и hyBRET-HRas, соответственно. В качестве контроля мы разработали EKAREV-4464, заменив ECFP Turquoise2-GL dC10 из EKAREVnes. Варианты CFP hyBRET-ERK были получены путем замены Turquoise2-GL dC10 в hyBRET-ERK на mTurquoise2 dC10, Turquoise2 dC10 или ECFP dC10 посредством реакции In-Fusion. HyBRET-ERK с парой mVenus-mTurquoise2 был создан путем замены mVenus dC10 на YPet путем лигирования рестрикционных фрагментов.Варианты hyBRET-ERK NanoLuc также были получены реакцией In-Fusion. Ранее сообщалось о CeNL, гибридном белке Turquoise2 и NanoLuc ²² . Для разработки биосенсоров hyBRET для других киназ Ser / Thr сенсорный домен и соответствующий лигандный домен в hyBRET-ERK были заменены на таковые из AKAR3EV, JNKAR1EV и Eevee-S6K путем лигирования рестрикционных фрагментов, генерируя hyBRET-PKA, JNK и S6K, соответственно. . кДНК, кодирующие биосенсоры или флуоресцентные белки, субклонировали в вектор pCAGGS ⁴⁷ или вектор pPBbsr, транспозонный вектор PiggyBac с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) ⁴⁸ .Лентивирусный вектор для hyBRET-ERK был сконструирован путем вставки компонентов, кодирующих кДНК hyBRET-ERK, за исключением YPet, в вектор pCSII-EF с IRES-bsr (ген устойчивости к бластицидину) и кодон-оптимизированным YPet для E . coli для подавления рекомбинации между гуманизированным YFP и CFP ⁴⁹ . Затем остаток треонина субстрата ERK в pCSIIbsr-hyBRET-ERK был заменен на аланин для создания устойчивого к фосфорилированию мутанта hyBRET-ERK-TA путем рестрикционного переваривания и последующего лигирования отожженного дуплекса олиго-ДНК.Чтобы сконструировать векторы для стабильной экспрессии биолюминесцентных белков в клетках млекопитающих, кДНК для RLuc8 S257G dN3 была вставлена ​​в вектор CSII-EF с IRES-puro, и кДНК для голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были амплифицированы с помощью ПЦР и субклонированы в Вектор pPBbsr путем лигирования рестрикционных фрагментов. pCX4puro-CRY2-cRaf и pCX4neo-CIBN-EGFPx были описаны ранее ⁵⁰ . Для создания pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf кДНК, кодирующая mCherry, была амплифицирована с помощью ПЦР и слита с CRY2 в pCX4puro-CRY2-cRaf с помощью реакции In-Fusion.Затем cRaf в pCX4puro-mCherry-CRY2-cRaf был заменен линкером и каталитическим доменом мышиного Sos1 (aa 548–1020) или интер-Sh3 доменом p85 человека (aa 428–621), образуя pCX4puro-mCherry-CRY2- Soscat и pCX4puro-mCherry-CRY2-iSh3 соответственно. pT2ADW-hyBRET-ERK был сконструирован следующим образом: инсулятор D4Z4 был вставлен перед промотором CAG pT2AL200R175-CAGGS-EGFP, несущего сайты рекомбинации Tol2 ⁵¹ . Затем последовательность WPRE pCSII-EF была вставлена ​​перед последовательностью поли А.Наконец, EGFP был заменен кДНК hyBRET-ERK.

Культура клеток и создание стабильных клеточных линий

Клетки HeLa были приобретены в Human Science Research Resources Bank (Sennanshi, Japan). Клетки HCT116 и клетки 4T1 были получены из АТСС (Американская коллекция типовых культур). Клетки Lenti-X 293T были приобретены у Clontech (Маунтин-Вью, Калифорния). Клетки РС9 были любезным подарком от Масато Окада (Университет Осаки, Япония). Клетки HeLa и Lenti-X 293T поддерживали в среде DMEM (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония).Клетки HCT116 выращивали в среде McCoy 5A (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Клетки 4T1 и клетки PC9 культивировали в RPMI1640 (ThermoFisher Scientific). Описанная выше среда для выращивания была дополнена 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой (FBS) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) и пенициллин / стрептомицин (Nacalai Tesque, Киото, Япония). Все клетки инкубировали во влажной атмосфере 5% CO2 на воздухе при 37 ° C. Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих биосенсоры hyBRET с помощью системы транспозонов, клетки котрансфицировали вектором pPB и pCMV-mPBase ⁴⁸ , полученным из Wellcome Trust Sanger Institute.Через день после трансфекции трансфицированные клетки отбирали 20 мкг / мл бластицидина S (InVivoGen, Сан-Диего, Калифорния), а затем культивировали дополнительно в течение по меньшей мере 1 недели. Для получения лентивируса клетки HEK-293T котрансфицировали вектором pCSII-EF, psPAX2, который был получен от Addgene (плазмида # 12260) и pCMV-VSV-G-RSV-Rev, любезным подарком доктора. Миёси (RIKEN BioResource Center, Ибараки, Япония) липофекцией с использованием полиэтиленимина «Макс» с молекулярной массой 40 000 (Polyscience Inc., Уоррингтон, Пенсильвания).Среды, содержащие вирус, собирали через 48 часов после трансфекции, фильтровали и концентрировали с помощью PEG6000. Клетки-мишени инфицировали в присутствии 10 мкг / мл полибрена (Nacalai Tesque). Через два дня после заражения инфицированные клетки отбирали с помощью бластицидина S с концентрацией 20 мкг / мл. Основная масса клеток использовалась в последующих анализах.

Реагенты

Диацетилцелентеразин-h синтезировали, как описано ранее ¹⁴ . Целентеразин-h и PD-0325901 были получены от Wako (Осака, Япония).Гефитиниб и AZD6244 были приобретены в компании Symansis (Шанхай, Китай). Анизомицин, dbcAMP и фактор роста эпидермиса были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Реагент для трансфекции 293fectin был получен от ThermoFisher Scientific и использовался для липофекции плазмиды в клетки HeLa. Система анализа люциферазы Nano-Glo была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин), и субстрат для анализа, включенный в набор, использовали в качестве исходного раствора фуримазина. Люциферины, используемые в каждом люминесцентном анализе, перечислены в таблице S3.

Спектроскопия

Для измерения спектров флуоресценции клетки HeLa, экспрессирующие только CFP, только YFP, или биосенсор помещали на 35-миллиметровую стеклянную чашку. Клетки наблюдали с помощью инвертированного микроскопа (IX81; Olympus, Tokyo), снабженного линзой объектива (масляный объектив UPLAPO 100 × / 1,35NA; Olympus). CFP возбуждались фильтром возбуждения FF02-438 / 24 (Semrock) и дихроичным зеркалом FF458-Di02-25×36 (Semrock). YFP возбуждали возбуждающим фильтром S492 / 18X (Chroma) и стеклянным дихроичным зеркалом (Olympus).Спектры флуоресценции регистрировали с интервалом 2 нм с использованием фотонного многоканального анализатора PMA-12 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan). Для измерения люминесцентных спектров клетки HeLa, экспрессирующие биосенсор, обрабатывали трипсином и суспендировали в M199 (ThermoFisher Scientific), содержащем 3% FBS и 20 мМ HEPES. К суспензии клеток добавляли 20 мкМ целентеразин-h или 3 мкМ фуримазин для регистрации спектров люминесценции с помощью PMA-12. Полученные спектры флуоресценции и люминесценции были использованы для оценки эффективности передачи энергии биосенсорами.

Оценка эффективности передачи энергии

Для оценки эффективности передачи энергии спектры флуоресценции и биолюминесценции биосенсора hyBRET были подогнаны к теоретическим спектрам излучения, по существу, как сообщалось ранее ²⁰ . Для нелинейной регрессии использовались метод Лербенберга-Марквардта, реализованный в функции nlinfit в MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс) и функции решателя в Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон). Теоретические спектры флуоресценции описываются следующим уравнением:

$$ {\ rm {F}} (\ lambda) = {\ varepsilon} _ {c} ({\ lambda} _ {ex}) \ {(1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + {E} _ {CY} \ times {\ varphi} _ {Y} \ раз {f} _ {Y} (\ lambda) \} + {\ varepsilon} _ {Y} ({\ lambda} _ {ex}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda), $$

(1)

где F ( λ ) — флуоресценция на длине волны λ, ε _c ( λ _из ) — коэффициент возбуждения CFP на длине волны возбуждения, E _CY — КПД FRET между CFP и YFP, ϕ _C — квантовая эффективность CFP, f _C ( λ ) — нормированное излучение CFP на длине волны λ, ϕ _Y — квантовая эффективность YFP, f _Y ( λ ) — нормализованное излучение YFP, а ε _Y ( λ _из ) — коэффициент экстинкции YFP на длине волны возбуждения. ε _Y ( λ _из ) значение на 440 нм, которое представляет перекрестное возбуждение YFP ​​в режиме FRET, составляет 2,9% от максимального ε _Y ( λ _из ) значение при 513 нм.

Если предположить, что слияние RLuc8 на С-конце в кадре не изменило физических свойств биосенсоров, теоретические биолюминесцентные спектры описываются следующим уравнением:

$$ \ begin {array} {rcl} { \ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {RC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ { C} (\ lambda) + ({E} _ {RY} + {E} _ {RC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ { Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {RC} — {E} _ {RY}) \ times {\ varphi} _ {R} \ times {f} _ {R } (\ lambda), \ end {array} $$

(2)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _RC — эффективность BRET между RLuc8 и CFP, E _RY — эффективность BRET между RLuc8 и YFP, ϕ _R — квантовая эффективность RLuc8, а f _R ( λ ) — нормализованное излучение RLuc8.

E _CY был оценен путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к формуле. 1. E _RC считается постоянным независимо от конформации биосенсора, поскольку линкер между RLuc8 и CFP был оптимизирован для максимизации эффективности BRET и стабилизации структуры слитого белка RLuc8-CFP. Следовательно, E _RC Nano-lantern используется для биосенсора hyBRET.Квантовая эффективность голубого нано-фонаря, ϕ _CNL , выражается следующим уравнением:

$$ {\ varphi} _ {CNL} = {\ varphi} _ {C} \ times {E} _ {RC} + {\ varphi} _ {R} \ times (1- {E} _ {RC}), $$

(3)

Используя данные квантовой эффективности, приведенные в таблице S1, E _RC был определен как 0,13. Наконец, E _RY был оценен путем подгонки измеренных биолюминесцентных спектров к формуле.2. Значения ε и ϕ перечислены в Таблице S1.

Скорости передачи энергии биосенсоров, содержащих NanoLuc, определяли аналогично биосенсорам, содержащим RLuc8, путем нелинейной подгонки измеренных спектров флуоресценции к уравнению. 4.

$$ \ begin {array} {rcl} {\ rm {B}} (\ lambda) & = & {E} _ {NC} \ times (1- {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {C} \ times {f} _ {C} (\ lambda) + ({E} _ {NY} + {E} _ {NC} \ times {E} _ {CY}) \ times {\ varphi} _ {Y} \ times {f} _ {Y} (\ lambda) \\ & & + \, (1- {E} _ {NC} — {E} _ {NY}) \ times { \ varphi} _ {N} \ times {f} _ {N} (\ lambda), \ end {array} $$

(4)

где B ( λ ) — интенсивность биолюминесценции на длине волны λ, E _NC — эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NY — эффективность BRET между NanoLuc и YFP, ϕ _N — квантовая эффективность NanoLuc, а f _N ( λ ) — нормализованное излучение NanoLuc.Обратите внимание, что эффективность BRET между NanoLuc и CFP, E _NC , был также оценен по формуле. 4, установка E _NY и E _CY как ноль.

Покадровая визуализация культивируемых клеток

Покадровая съемка была получена и обработана с использованием, по существу, тех же условий и процедур, что и ранее. ⁵² .Вкратце, клетки HeLa, экспрессирующие биосенсоры hyBRET, голодали в течение 3-8 часов с помощью FluoroBrite DMEM (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, Массачусетс) с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 мМ пирувата натрия (Thermo Fischer Scientific), GlutaMax и пенициллина. /стрептомицин. При необходимости голодные клетки обрабатывали стимулом в процессе покадровой визуализации. Клетки получали с помощью инвертированного микроскопа (IX83; Olympus, Токио), оснащенного линзой объектива (масляный объектив UPlanSApo 60 × / 1,35NA; Olympus), системой освещения (световой двигатель Spectra-X; Lumencore, Бивертон, Орегон), Лазерная система автофокусировки IX3-ZDC2 (Olympus), автоматически программируемый XY-столик MD-XY30100T-Meta (SIGMA KOKI, Токио) и инкубатор INUG2F-IX3W (Tokai Hit, Фудзиномия, Япония).В каждом эксперименте использовалась одна из следующих камер: CCD с охлаждением MD-695 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния), EMCCD с охлаждением iXon Ultra 888 (ANDOR, Белфаст, Великобритания) и EMCCD с охлаждением Rolera Thunder (QImaging, Surey, BC) . Для визуализации FRET клетки подвергали воздействию света 440 нм с интенсивностью света 25 мкВт / см ² в течение 30–200 мс, и получали изображения FRET и CFP. Для визуализации BRET в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-h или 3 мкМ фуримазин (Promega) перед началом визуализации.Голубое свечение и желтое свечение клеток регистрировали при времени экспозиции от 6 до 30 с, в зависимости от камеры, используемой в каждом эксперименте. Чтобы уменьшить паразитный свет от микроскопа и окружающей среды во время визуализации BRET, в IX83 был включен режим аппаратного затемнения, верх нагревателя предметного столика был покрыт алюминиевой фольгой, и эксперименты проводились в темной комнате. Дихроичные зеркала и фильтры, использованные в этой работе, представляли собой дихроичное зеркало FF458-Di02-25×36 для CFP и FRET, три эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для CFP и голубой люминесценции, FF01-542 / 27-25 для FRET, YFP и желтое свечение и FF01-624 / 40-25 для mCherry) от Semrock (Рочестер, Нью-Йорк) и стеклянный отражатель U-MREF, используемый в качестве дихроичного зеркала для YFP и mCherry от Olympus.Для визуализации BRET не использовалось дихроичное зеркало.

Обработка изображений

Программное обеспечение Metamorph (Molecular Devices) и программное обеспечение Safir (Roper Scientific France, Lisses, Франция) использовались для уменьшения шума и анализа изображений. После вычитания фона изображения отношения FRET / CFP были созданы и представлены в режиме отображения с модуляцией интенсивности (IMD). В режиме IMD восемь цветов от красного до синего используются для представления отношения FRET / CFP, причем интенсивность каждого цвета указывает среднюю интенсивность каналов FRET и CFP.Для люминесцентных изображений вычитанию фона предшествовало удаление космических лучей и уменьшение шума ⁵³ . Затем были созданы изображения с соотношением желтого / голубого люминесценции таким же образом, как и изображения с соотношением FRET / CFP. Двухволновые изображения, полученные при люминесцентном изображении всего тела, были разделены между желтым и голубым люминесцентными изображениями после удаления шума и вычитания фона. На рис. S7 сигналы от голубого нано-фонарика и желтого нано-фонаря были разделены линейным разделением.

Optogenetics

Клетки HeLa трансфицировали вектором экспрессии для биосенсора hyBRET, pCX4neo-CIBN-EGFP-x и вектором экспрессии для слитого белка CRY2.Через день после трансфекции клетки голодали с помощью FluoroBrite DMEM с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1 мМ пирувата натрия и GlutaMAX в течение 3-8 часов. Перед началом визуализации в чашку для культивирования добавляли 20 мкМ коэлентеразин-ч. Канал mCherry использовался для определения фокуса и положения стадии, чтобы не запускать транслокацию через мембрану слитых с CRY2 сигнальных молекул. Визуализацию BRET выполняли, как описано выше. В момент времени 0 клетки освещали светом с длиной волны 490 нм (55 мкВт / см ² ) в течение 100 мс.Чтобы оценить влияние освещения синим светом на соотношение BRET сенсоров hyBRET и интенсивность люминесценции RLuc8, клетки трансфицировали pCAGGS-hyBRET-ERK или pCSIIpuro-RLuc8. На следующий день клетки голодали и получали люминесцентное изображение, как описано выше. Во время визуализации клетки освещали светом 440 нм (200 или 450 мкВт / см ² ) или светом 490 нм (180 мкВт / см ² ) в течение 5 с в заранее определенные моменты времени. Плотность света измеряли измерителем оптической мощности TQ8230 (Advantest).

Анализы на микропланшетном ридере

Клетки, экспрессирующие hyBRET-ERK, высевали на 96-луночные белые планшеты при плотности клеток 3000 клеток / лунку. На следующий день клетки обрабатывали серийно разведенным AZD6244, ингибитором MEK, в течение 20 минут. Цифровой диспенсер HP D300 (Tecan, Männedorf, Швейцария) использовался для разбавления лекарственного средства и добавления в лунку. После обработки лекарственным средством в каждую лунку добавляли среду, содержащую 1 мкМ коелентеразин-h с серийно разбавленным ингибитором, и измеряли желтое и голубое свечение с помощью считывающего устройства для микропланшетов GloMax Discover (Promega).Фильтр короткого прохода 495 нм использовали для голубой люминесценции, а фильтр длиной 530 нм использовали для желтой люминесценции. В мультиплексном анализе, показанном на рис. 4c – f, среду заменяли 250 мкл FluoroBriteDMEM с добавлением 10% FBS, 1 мМ пирувата натрия, GlutaMAX и пенициллина / стрептомицина после прикрепления клеток ко дну лунки. Через несколько часов после смены среды клетки обрабатывали серийно разведенным гефитинибом в течение 1 дня. Голубое свечение и желтое свечение клеток hyBRET-ERK, обработанных лекарственным средством, измеряли в присутствии 1 мкМ целентеразина-h.{\ prime} = 1- \ frac {3 (S {D} _ {AZD0} + S {D} _ {AZD1})} {Av {e} _ {AZD0} -Av {e} _ {AZD1}} $

(5)

Здесь SD — это стандартное отклонение, а Ave — это среднее значение желтого / голубого люминесценции из 3 лунок, обработанных без AZD6244 (AZD0) или 1 мкМ AZD6244 (AZD1). На рис. 4f теоретические функции, описанные ниже, использовались в качестве модельных функций для соответствия экспериментальным данным, как сообщалось ранее ²⁶ . Уравнения представляют взаимосвязь между активностью ERK и количеством живых клеток.{\ frac {1} {n {H} _ {ERK}}} $$

(7)

Здесь min — минимум, amp — амплитуда, IC50 — это половина максимальной ингибирующей концентрации, а nH — коэффициент Хилла количества живых клеток (L) или активности ERK (ERK). ERK — это соотношение желтого / голубого люминесценции hyBRET-ERK. Поскольку минимумы и амплитуды были однозначно определены из экспериментальных данных, IC50s и nHs были подобраны как свободные параметры.

Образование опухоли ксенотрансплантатом и генерация трансгенных мышей

Самок мышей BALB / c nu / nu в возрасте 7–9 недель (Japan SLC, Hamamatsu, Japan) использовали для образования опухоли ксенотрансплантата.1 × 10 ⁶ клеток HeLa, стабильно экспрессирующих желтый нано-фонарь и голубой нано-фонарь в 50 мкл GelTrex / PBS (1: 1) (ThermoFisher Scientific), вводили подкожно в левый и правый бок мышей. Мышей визуализировали через две недели после трансплантации. Для исследования метастазов опухоли мышам внутривенно вводили 1 × 10 ⁵ клеток опухоли молочной железы мыши 4T1, стабильно экспрессирующих hyBRET-ERK или hyBRET-ERK-TA в PBS в хвостовой вене, и анализировали через 2–3 недели после инъекции опухоли 4T1. .Трансгенные мыши были получены с помощью Tol2-опосредованного переноса гена ⁵⁴ . Вкратце, оплодотворенные яйца, полученные от мышей Jcl: B6C3F1 (B57BL / 6N Jcl X C3H / HeN Jcl), микроинъектировали смесью мРНК Tol2 и pT2ADW-hyBRET-ERK. Животных-основателей скрещивали с мышами Jcl: ICR для получения стабильных линий. Новорожденных мышей освещали синим фонариком LEDGFP-3W (Optocode, Tokyo) и проверяли на зеленую или красную флуоресценцию через желтые очки. Протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Высшей школы медицины Киотского университета (No.10584, 14079, 15064, 16038 и 17539), и методы были выполнены в соответствии с соответствующими директивами и правилами.

Биолюминесцентная визуализация всего тела животных

Для сравнения продолжительности жизни биолюминесценции между аналогами целентеразина-h in vivo (рис. S7) мышей с подкожными опухолями анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) в этаноле / PBS (1: 4) или диацетил-коэлентеразин-h (80 мкг на мышь) / Pluronic F-127 (20% мас. / об. в DMSO) (Biotium, Hayward , CA) (1: 1) растворяли в PBS.Для люминесцентной визуализации мышей с метастазированными опухолями (рис. 5a – j и S8) мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0,5 л / мин) и внутривенно вводили смесь диацетил-целентеразина-h (200 мкг на мышь. ) и носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 в Pluronic F-127 (20% мас. / об. в ДМСО) / PBS (1: 1) (общий объем составлял 100 мкл / мышь). Для визуализации трансгенных мышей, экспрессирующих hyBRET-ERK (рис. 5k), трансгенных мышей анестезировали изофлураном (1,5% ингаляции, 0.5 л / мин) и вводили 1 мМ диацетил целентеразин-h, растворенный в PBS, содержащем 1% Pluronic F-127 (20% мас. / Об. В ДМСО), путем непрерывной внутривенной инфузии со скоростью 90 мкл / час с помощью шприцевого насоса Model 11 plus (Harvard Аппарат, Холлистон, Массачусетс). Носитель или 5,0 мг / кг PD-0325901 (общий объем составлял 100 мкл / мышь) вводили внутрибрюшинно во время визуализации. Изображение мышей получали с помощью имидж-сканера MIIS (Molecular Devices), оснащенного камерой iXon Ultra 888 EMCCD (ANDOR), оптикой разделения изображений W-VIEW GEMINI (Hamamatsu Photonics), системой светодиодного освещения XT640-W (Lumen Dynamics, Missisauga, ON ) и монофокальный телецентрический объектив TEC-55 (Computar, Cary, NC), управляемый программой Metamorph (Molecular Devices).Во время люминесцентной визуализации мышей держали под анестезией изофлураном и держали в тепле с помощью пластины предварительного нагрева Chamlide (Live Cell Instrument, Сеул, Корея). Желтое свечение и голубое свечение опухолей регистрировали при следующих условиях: время воздействия 30 с (для подкожных опухолей) или 4 мин (для метастазированных опухолей), усиление ЭМ 1000 (максимум) и биннинг ПЗС 1. Дихроичное зеркало и Эмиссионные фильтры, установленные в W-VIEW GEMINI для двухцветного люминесцентного изображения in vivo , представляли собой дихроичное зеркало FF509-Di01-25×36 и два эмиссионных фильтра (FF01-483 / 32-25 для голубой люминесценции и FF01-542 / 27- 25 для желтого свечения) и были получены от Semrock.

Прижизненная FRET-визуализация легкого мыши

Мышей с метастатической опухолью 4T1 анестезировали изофлураном (1% ингаляция, 0,5 л / мин). Часть кожи на левой груди была разрезана, чтобы обнажить поверхностный мышечный слой и ребра. Горло мышей разрезали по средней линии глотки, чтобы обнажить трахеальную трубку, и в трахеальную трубку вставляли ангиокатетер SURFLO 22-G (Terumo, Tokyo). Затем мышей помещали в положение для правого бокового пролежня и резецировали левые ребра, чтобы обнажить левое легкое.Мышей немедленно подключали к механическому аппарату ИВЛ MK-V100 (Muromachi Kikai, Tokyo). До конца визуализации дыхание обеспечивалось механически при следующих условиях: 55 ударов в минуту, 35 мл / мин, соотношение вдох / выдох 3: 2, изофлуран 1,5%. Чтобы уменьшить артефакты движения, вызванные дыханием, обнаженную область левого легкого осторожно отсосали и зафиксировали на покровном стекле с помощью изготовленного на заказ стабилизатора органа, который был подключен к вакуумному насосу. Опухоли в легких получали с помощью вертикального микроскопа FV1200MPE-BX61WI (Olympus), оснащенного водно-иммерсионным объективом XLPlanN 25x (Olympus), лазером InSight DeepSee (Spectra-Physics, Санта-Клара, Калифорния) и FV1200MPE Reflected Четырехканальный внешний детектор GaAsP NDD (Olympus).CFP возбуждали лазером с длиной волны 840 нм. В качестве дихроичных зеркал использовали DM450, DM570 и DM505 (Olympus). Используемые фильтры выбросов: FF01-425 / 30 (Semrock), BA460–500 (Olympus) и BA520–560 (Olympus) для SHG, CFP и FRET, соответственно. Во время визуализации FRET мышам внутривенно вводили 5,0 мг кг ^-1 PD-0325901 без прерывания визуализации.

Работники отеля беспокоятся о новом сопернике: Алекса на стойке регистрации

Боссы еще не внедрили технологию распознавания лиц в отеле Royal Hawaiian.Но со своего места за стойкой регистрации в розовом неомавританском дворце с видом на пляж Вайкики Жан Тео-Гибни может предвидеть это.

«Marriott только что представила это в Китае», что позволяет гостям регистрироваться в своих комнатах, не утруждая себя формальностями на стойке регистрации, — сказала г-жа Тео-Гибни, 53-летняя бабушка семи детей. «Похоже, они знают, что сократят наши рабочие места».

Подобные опасения витают в обширной сети отелей Marriott, крупнейшей в США.За последние две недели г-жа Тео-Гибни и тысячи других работников Marriott — повара и кассиры, посыльные и горничные — проголосовали за разрешение своему профсоюзу Unite Here проводить забастовки в десятках населенных пунктов от Вайкики до Бостона и Сан-Франциско. Диего в Детройт.

Наряду с обычными требованиями повышения заработной платы и повышения безопасности на рабочем месте, профсоюз поднимает еще одну проблему, требуя процедур для защиты работников, пострадавших от новых технологий и инноваций, которые они стимулируют.

«Вы не собираетесь останавливать технологии, — сказал президент Unite Here Д.Тейлор. «Вопрос в том, будут ли сотрудники сотрудничать с ним в развертывании или случайные прохожие, которых он сбивает».

В отличие от производственных рабочих, рабочие места которых были потеряны из-за автоматизации еще в 1950-х годах, работники низкооплачиваемой части сектора услуг до сих пор в значительной степени защищены от технологий, сокращающих рабочие места.

Многие заработали слишком мало, чтобы оправдать большие капитальные затраты на их замену. Согласно правительственным данным, типичный клерк в отеле или мотеле зарабатывает чуть более 12 долларов в час; консьерж чуть больше 13 долларов.50. И многие из выполняемых ими задач казались слишком сложными, чтобы их можно было автоматизировать. Технологии меняют этот расчет.

Не существует эквивалентной меры по проникновению программных систем, таких как Alexa или сенсорных экранов, на рабочие места. Но в 2014 году автопроизводители в США имели 117 роботов на каждую 1000 рабочих, согласно исследованиям экономистов Дарона Аджемоглу из Массачусетского технологического института и Паскуаля Рестрепо из Бостонского университета. В сфере услуг их практически не было.

Но с развитием машинного обучения и других инноваций в области информационных технологий многие рабочие места в сфере обслуживания теперь потенциально находятся под угрозой. По сравнению с производством, инвестиции, необходимые для автоматизации некоторых задач в гостиничном секторе, таких как стойка регистрации или услуги консьержа, вероятно, будут относительно низкими.

Мария Мендиола, консьерж в San Jose Marriott, обеспокоена тем, что соглашение Amazon разместить свое устройство Echo в гостиничных номерах в отелях Marriott в конечном итоге сделает ее положение бессмысленным.«Алекса может сделать мою работу в будущем», — сказала она.

В Sheraton Waikiki, рядом с Royal Hawaiian, кассиры в пляжном лаундже беспокоятся о недавно развернутой компьютерной системе, которая позволит серверам закрывать свои собственные чеки, делая кассиров ненужными.

В продаже есть автоматические посудомоечные машины; машины для переворачивания гамбургеров и смешивания коктейлей; роботы для доставки еды и напитков в номер или помощи в бронировании столика в ресторане.

Новые технологии изменяют конфигурацию рабочего места иным образом.Швейцары теряют чаевые, поскольку гости обращаются к Uber и Lyft вместо обычных такси. Так же поступают посыльные, когда гости используют приложение для доставки еды Seamless вместо обслуживания номеров.

Сколько рабочих мест займет технология? Отельерам еще предстоит выяснить, как гости отреагируют на более технологичный опыт. Представитель Marriott заявила в своем заявлении, что сеть не использует технологии для сокращения рабочих мест, а «персонализирует обслуживание гостей и улучшает их пребывание».

Клифф Аткинсон, старший вице-президент MGM Resorts по вопросам гостеприимства, сказал, что новые технологии изменили должностные инструкции в отелях его сети, но не привели к сокращению рабочих мест.Клерки на стойке регистрации, замененные киосками автоматической регистрации, используются в качестве «послов в вестибюле» или консьержей.

Тем не менее, история показывает, что самой сильной мотивацией к развертыванию новых технологий была возможность снизить затраты на рабочую силу. По оценкам профессоров Асемоглу и Рестрепо, с 1993 по 2007 год каждый новый робот сокращал 5,6 рабочих мест и снижал заработную плату на 0,5 процента.

По мере того, как технологии становятся лучше и дешевле, появляется множество новых задач, которые они могут взять на себя. «Это новая, неизведанная область для нашей компании и нашей отрасли в целом», — сказал г-н.- сказал Аткинсон. «Мы говорили об одном или двух брендах, которые полностью автоматизированы и самообслуживаются для гостей».

Ежедневный бизнес-брифинг

Дэвид Атор, экономист из Массачусетского технологического института, говорит, что можно предвидеть будущее, в котором — как это сделали авиакомпании — отели будут использовать людей для обслуживания элитных гостей и автоматизированные системы для всех остальных. По утверждению профессора Автор, затраты на рабочих значительно превышают их почасовую заработную плату.Они болеют, берут отпуск и требуют менеджеров. «Люди беспорядочные», — отметил он. «Машины просты».

В прошлом году Глобальный институт McKinsey опубликовал отчет, в котором прогнозируется, что технологии приведут к 30-процентному сокращению рабочих мест в сфере общественного питания и жилья с 2016 по 2030 год. Это почти соответствует сокращению на 38 процентов рабочих мест в обрабатывающей промышленности с 1960 по 2012 годы.

Профсоюзы предпочли бы, чтобы история производства не повторялась в сфере услуг. «Мы пытаемся опередить это», — сказал Ананд Сингх, президент местного отделения Unite Here в Сан-Франциско.«Мы не луддиты, но мы ищем настоящего голоса за столом».

Международное братство водителей грузовиков также обеспокоено технологией, стремительно проникающей в настоящее. В ходе переговоров по контракту с United Parcel Service в этом году профсоюз сделал смелое предложение: запретить использование дронов или автономных транспортных средств для доставки посылок. Но в сентябре, когда профсоюз разослал соглашение членам для ратификационного голосования, такого положения не было.

Эдвард Виткинд, до этого года возглавлявший Департамент транспортных перевозок компании A.F.L.-C.I.O. заявил, что профсоюзы не смогут остановить развитие технологий, даже если они попытаются это сделать. «Может быть, вы сможете остановить это с помощью одного раунда торга или замедлить его», — сказал он. «Но инновации продолжаются 100 лет и никогда не прекращаются».

И он отметил, какой может быть цена успеха: «Завоевываем ли мы будущее для рабочих? Нет, если компания обанкротится ».

Лучшей стратегией могло бы быть требование высказывать свое мнение о том, как развертываются технологии.

Предварительная сделка Teamsters с U.P.S.например, призывает к предварительному предупреждению профсоюзов за шесть месяцев о развертывании технологий и к созданию комитета с представителями профсоюзов и компаний, который будет вести переговоры «относительно последствий предлагаемых технологических изменений».

Unite Идет по аналогичному пути. Г-н Сингх перечислил цели профсоюзов в отношении контрактов Marriott: «Мы хотим поговорить о том, как технологии могут помочь в выполняемой нами работе и облегчить ее суровость, как проходят обучение наших членов, что происходит с работниками, которые в противном случае были бы отмечены как лишние. , как наши участники перемещаются для достижения успеха или нанимаются на другие рабочие места.”

В июне профсоюзу впервые удалось включить защиту от технологических изменений в свои контракты, касающиеся рабочих на объектах MGM Resorts и Caesars Entertainment в Лас-Вегасе. Рабочие будут обучены выполнять рабочие места, созданные или модифицированные с помощью новых технологий, что позволит им участвовать в приросте производительности. Контракты также предусматривают, что компания пытается найти работу для уволенных работников. Но ключевым достижением профсоюза было предупреждение о развертывании технологий за 180 дней.

«Они должны сообщить нам об этом, показать прототипы и провести с нами переговоры», — сказал г-н Тейлор. «В конце концов, они могут двигаться вперед, но это дает нам время, чтобы понять последствия».

Если бы они могли выбрать прецедент из американской трудовой истории, сегодняшние профсоюзные лидеры могли бы пойти по пути Международного союза береговых берегов и складов.

В 1960-х и 1970-х годах докеры были поражены одним из самых революционных технических нововведений 20-го века: контейнерами.Контейнеры одним ударом сократили время и количество рабочих, необходимых для загрузки корабля, что позволило сэкономить огромные суммы денег.

Вместо того, чтобы пытаться остановить большие коробки, профсоюз, покрывающий грузчиков на Западном побережье, потребовал долю добычи: богатые пенсионные пакеты для уволенных рабочих и солидное вознаграждение для тех, кто остался. В результате грузчики, работающие полный рабочий день круглый год, в настоящее время зарабатывают в среднем от 168 000 до 186 000 долларов в год.

Но чтобы заключить такую ​​сделку, нужно много энергии.Профсоюз портовых компаний может закрыть порты по своему желанию, что повлечет за собой огромные расходы для грузоотправителей. Для рабочих, не обладающих таким влиянием, успехи, достигнутые грузчиками, кажутся недосягаемыми.

Объединиться Здесь не бессильно. Согласно государственной статистике, по всей стране только 7,6% работников индустрии размещения состоят в профсоюзах. Но в Сан-Франциско, например, Unite Here представляет 89 процентов работников отелей класса А. Отчасти поэтому горничные в Сан-Франциско зарабатывают 22 доллара.64 в час, отмечает профсоюз, что более чем вдвое превышает средний показатель по стране, составляющий 10,09 доллара.

Unite Здесь победы были одержаны нелегко. «Это был непростой вопрос», — сказал г-н Тейлор о языке технологий в сделках в Лас-Вегасе. «Это действительно ущемляет право отелей делать то, что они хотят».

Результат может принести или не принести большую долю прибыли от технологий рабочим. Но у служащих и консьержей будут лучшие варианты, чем выходное пособие, когда Alexa или компьютерное программное обеспечение возьмут на себя некоторые из их задач.«Это было хорошее решение», — сказал г-н Тейлор. «Время покажет, достаточно ли он хорош».

Биологические перспективы pH-зонда на основе FRET, демонстрирующего работу молекулярного логического элемента при изменении pH

Мониторинг внутриклеточного pH — мощный инструмент для понимания множества клеточных функций и прогноза многих заболеваний. В этом исследовании был приготовлен эффективный многофункциональный кислый чувствительный к pH зонд 1 , основанный на резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET) через соединение родамина B в качестве акцептора FRET и нафталимидного флуорофора в качестве донора FRET с использованием 1 , 4-диаминобутан в качестве неконъюгированного линкера.Морфолин был добавлен в качестве потенциальной целевой группы для лизосом к нафталимидному фрагменту. Зонд имеет селективное переключение излучения с зеленого на красный в диапазоне pH от нейтрального до кислого (от pH 7,0 до pH 4,0), тогда как он, по-видимому, остается неизменным в основной среде с наблюдаемым p K _a , равным ∼4,80. Кроме того, зонд 1 можно использовать для создания логического элемента INHIBIT и соответствующей дополнительной логической схемы, применяя ионы H ⁺ и OH ^— в качестве входных сигналов на основе изменений спектра поглощения и излучения соответственно.Зонд показал эффективную склонность к связыванию с CT-ДНК ( K _b = 1,34 × 10 ⁵ M ^-1 ), что свидетельствует о частичной интеркаляции через плоские фрагменты между парами оснований ДНК. Он также показал сильную аффинность связывания с белком бычьего сывороточного альбумина (BSA) ( K _BSA = 1,74 × 10 ⁶ M ^-1 ) с эффективным гашением флуоресценции триптофана (97%). при λ _em = 345 нм.Интересно, что нафталимидный флуорофор, являющийся эффективным фотосенсибилизатором, позволяет зонду демонстрировать эффективное фоторасщепление ДНК под действием УФ-А света ( λ = 312 нм) с 65% конверсией сверхспиральной (SC) ДНК в ее кольцевую (NC) форму ДНК с разрывами . через фотогенерация активных форм кислорода (АФК) в микромолярной концентрации в физиологических условиях.

У вас есть доступ к этой статье

Биосенсор на основе FRET для измерения активации Gα13 в отдельных клетках

Abstract

Фёрстеровский резонансный перенос энергии (FRET) обеспечивает способ прямого наблюдения за активацией гетеротримерных G-белков рецепторами, связанными с G-белками (GPCR).С этой целью создаются биосенсоры на основе FRET, в которых используются субъединицы гетеротримерного G-белка, меченные флуоресцентными белками. Эти биосенсоры на основе FRET дополняют существующие косвенные способы наблюдения активации GPCR. Здесь мы сообщаем о вставке mTurquoise2 в несколько сайтов в субъединице Gα13 человека с целью разработки биосенсора активации Gα13 на основе FRET. Было обнаружено, что три флуоресцентно меченных варианта Gα13 являются функциональными на основании i) локализации на плазматической мембране и ii) способности рекрутировать p115-RhoGEF при активации рецептора LPA2.Меченые субъединицы Gα13 использовали в качестве донора FRET и объединяли с cp173Venus, слитой с субъединицей Gγ2, в качестве акцептора. Мы сконструировали биосенсоры Gα13, создав единственную плазмиду, которая продуцирует Gα13-mTurquoise2, Gβ1 и cp173Venus-Gγ2. Биосенсоры активации Gα13 показали быстрый и устойчивый ответ при использовании в первичных эндотелиальных клетках человека, подвергшихся действию тромбина, запускающих рецепторы, активируемые эндогенными протеазами (PAR). Этот ответ эффективно подавлялся RGS-доменом p115-RhoGEF, и из данных биосенсора мы сделали вывод, что это связано с активностью GAP.Наконец, мы продемонстрировали, что датчик Gα13 может использоваться для анализа эффективности связывания гетеротримерного G-белка в отдельных живых клетках. Мы пришли к выводу, что биосенсор Gα13 является ценным инструментом для измерения живых клеток, который исследует пространственно-временные аспекты активации Gα13.

Образец цитирования: Mastop M, Reinhard NR, Zuconelli CR, Terwey F, Gadella TWJ Jr, van Unen J, et al. (2018) Биосенсор на основе FRET для измерения активации Gα13 в отдельных клетках. PLoS ONE 13 (3): e0193705.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705

Редактор: Sabato D’Auria, Consiglio Nazionale delle Ricerche, ИТАЛИЯ

Поступила: 29 ноября 2017 г .; Одобрена: 19 февраля 2018 г .; Опубликовано: 5 марта 2018 г.

Авторские права: © 2018 Mastop et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Информация о плазмидах и плазмидах доступна на сайте addgene (http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/). Большинство экспериментальных данных представлено в рукописи, а исходные данные депонированы: https://doi.org/10.5281/zenodo.1158456.

Финансирование: JG было поддержано грантом NWO Chemical Sciences ECHO (711.013.009). MJWA получило финансовую поддержку от бразильского агентства по финансированию исследований CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior) (грант: BEX 13247 / 13-1).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR), являются членами большого семейства рецепторов, расположенных на мембране, с примерно 750 генами, кодирующими GPCR, идентифицированными в геноме человека [1]. Эти семь трансмембранных белков могут воспринимать широкий спектр сигналов, включая свет, гормоны, ионы и нейротрансмиттеры [2].GPCR действуют как факторы обмена гуанина (GEF) [3] для гетеротримерных G-белков. Эти белковые комплексы состоят из субъединиц Gα, Gβ и Gγ. Гетеротример представляет собой белковый комплекс периферической мембраны за счет липидной модификации субъединиц Gα и Gγ [4].

Активность GEF проявляется в субъединице Gα, которая может быть преобразована из неактивного состояния, связанного с GDP, в активное состояние, связанное с GTP [5]. Активация комплекса приводит к конформационным изменениям и в некоторых случаях к диссоциации субъединицы Gα от димера Gβγ [2,6,7].Как активированная GTP-связанная субъединица Gα, так и димер Gβγ способны активировать нижестоящие эффекторы [2].

Можно различить почти двадцать различных субъединиц Gα, которые сгруппированы в четыре класса; Gi / o, Gs, Gq и G12 / 13 [2]. В этой рукописи мы будем использовать Gα13 для обозначения субъединицы и G13 для обозначения гетеротримеров, состоящих из Gα13, Gβ и Gγ, та же терминология будет использоваться для Gq / Gαq и Gi / Gαi, соответственно. Каждый класс субъединиц Gα активирует различные нижестоящие эффекторы [5].Лучше всего охарактеризованными эффекторами субъединиц Gα12 / Gα13 являются RhoGEF, которые активируют RhoA, например LARG, PDZ-RhoGEF и p115-RhoGEF [8,9]. В течение некоторого времени считалось, что активация GPCR субъединиц Gα12 / Gα13 является преобладающим способом активации RhoA. Эта точка зрения изменилась за последнее десятилетие с идентификацией RhoGEFs, которые могут активироваться Gαq [9,10]. В настоящее время ясно, что и Gαq, и Gα12 / Gα13 могут быстро активировать передачу сигналов RhoA в клетках [11,12], хотя и путем активации различных эффекторов.Поскольку класс Gq и класс G12 / 13 эффективно активируют RhoA, было трудно различить, какой из этих двух гетеротримерных комплексов G-белок активируется, когда измеряются только нижестоящие эффекты. Еще больше усложняет ситуацию то, что GPCRs, которые активируют G12 / 13, часто также активируют Gq [13,14]. Тем не менее, ясно, что передача сигналов через Gq или G12 / 13 имеет разные физиологические эффекты [13,15,16]. Следовательно, необходимы инструменты, которые могут измерить активацию самого гетеротримерного G-белка.

Прямое наблюдение активации гетеротримерного G-белка обычно проводят путем количественной оценки связывания радиоактивно меченных нуклеотидов [17]. Этот подход трудоемок, использует поврежденные клетки и не имеет временного разрешения. Более того, этот метод обычно менее подходит для Gq, Gs и G12 / 13 из-за их низкого уровня экспрессии по сравнению с Gi [18]. С другой стороны, оптические считывания, часто основанные на методах FRET и биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET), хорошо подходят для измерения активности передачи сигналов с высоким временным разрешением в интактных клетках [19,20].Несколько групп создали биосенсоры на основе BRET или FRET для обнаружения событий непосредственно после активированных GPCR [20–24]. Оптические биосенсоры, основанные на гетеротримерных G-белках, особенно подходят для регистрации активации GPCR [25]. Однако сообщалось только о нескольких оптических биосенсорах, сообщающих об активации Gα12 или Gα13.

Sauliere et al. сообщили о биосенсоре на основе BRET для обнаружения активации активации Gα13, что позволяет обнаруживать предвзятый агонизм через рецептор ангиотензина II типа 1 (AT1R) [26].Однако этому подходу не хватает пространственного разрешения. Улучшенные люциферазы, такие как нанолюцифераза, позволили проводить измерения BRET отдельных клеток, но требуется более длительное время сбора данных, поэтому временное разрешение уменьшается [27]. Как правило, датчики на основе FRET имеют более высокую интенсивность излучения, что требует более короткого времени сбора данных для получения достаточного пространственного и временного разрешения. Таким образом, разработка основанного на FRET биосенсора, сообщающего об активации Gα13, будет реальным преимуществом для исследований передачи сигналов GPCR.Ранее мы сообщали об одинарных плазмидных системах, которые обеспечивают экспрессию мультимерного сенсора на основе FRET для Gαq и Gαi [28,29]. Здесь мы сообщаем о разработке, характеристике и применении единственной плазмиды, биосенсора на основе FRET для активации Gα13.

Результаты

Стратегия мечения Gα13 флуоресцентным белком

Чтобы напрямую измерить активацию Gα13 с высоким пространственно-временным разрешением в живых клетках, мы стремились создать функциональную, меченную флуоресцентным белком (FP) субъединицу Gα13.Субъединицы Gα не могут быть помечены на N- или C-конце, так как они необходимы для взаимодействия с субъединицей Gβγ и GPCR [30]. Чтобы функционально пометить Gα13, FP должен быть вставлен в последовательность Gα13, как это было ранее сделано для других изоформ Gα [25,31].

Первоначально мы использовали выравнивание последовательностей четырех классов Gα-белков и идентифицировали остатки Gαq [32] и Gαi [29], после которых мы ранее вставили mTurquoise2 (Рис. 1B, S1 Рис). Основываясь на гомологии последовательностей, мы выбрали вставку mTurquoise2 после остатка Q144 человеческого Gα13, обозначенного черным прямоугольником в выравнивании.При трансфекции плазмиды, кодирующей этот вариант, мы наблюдали цитоплазматическую флуоресценцию. Эта локализация, вероятно, отражает неправильную укладку или нацеливание субъединицы Gα, поскольку хорошо уложенные и функционально меченые варианты локализуются на плазматической мембране [31,32]. Изучение кристаллической структуры (PDB ID: 1ZCB) показало, что Q144 является частью α-спирали (αB2), которая, вероятно, будет разрушена после модификации или вставки [33].

Рис. 1. Вставка флуоресцентного белка в различные положения в Gα13.

(A) Белковая структура человеческого Gα13 (PDB ID: 1ZCB). Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку. Успешные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 в Gα13 розовым цветом и неудачные сайты оранжевым. (B) Частичное выравнивание последовательности белка (полное выравнивание см. S1 фиг.) Различных классов Gα. Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку (или люциферазе). Жирным шрифтом выделены сайты, которые ранее использовались для вставки Rluc [26].Вставка mTurquoise2-Δ9 в Gα13 после остатка Q144 (черный) была основана на гомологии с предыдущими вставками в Gαq и Gαi (черный). Удачные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 (R128, A129 и R140) в розовый и неудачные сайты (L106 и L143) в оранжевый. Цифры, указанные под выравниванием, соответствуют номерам вариантов Gα13, используемым во всей рукописи. Цвета под выравниванием совпадают с цветами αHelices, показанных на (A). (C) Конфокальные изображения меченых вариантов Gα13, временно экспрессируемых в клетках HeLa.Цифры в левом нижнем углу каждого изображения указывают количество клеток, которые показали локализацию плазматической мембраны из общего числа проанализированных клеток. Меченые варианты Gα13 также локализуются в структурах внутри клетки, которые предположительно являются эндомембранами. Ширина изображений 76 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g001

Затем мы использовали структуру белка, чтобы выбрать ряд остатков, которые были рядом с предыдущими сайтами вставки и рядом или рядом с концом α- спираль (αA, αB2 или αB1).Мы также взяли с собой сайт вставки (L106), который ранее использовался для вставки люциферазы в Gα13 [26]. Мы использовали усеченный mTurquoise2, удалив последние 9 аминокислот, так как это хорошо работало в сенсоре Gi [29]. Сайты вставки выделены на структуре белка и в выравнивании последовательностей на фиг. 1A и 1B. Различные варианты пронумерованы как Gα13.1, Gα13.2, Gα13.3, Gα13.5 и Gα13.6 по всей рукописи.

Плазмиды, кодирующие различные варианты с метками, трансфицировали в клетки HeLa, и мы наблюдали поразительные различия в локализации.Как показано на фиг. 1C, варианты 1 и 6 показали цитоплазматическую локализацию. Напротив, сильное мечение плазматической мембраны наблюдалось для вариантов Gα13.2, Gα13.3 и, в меньшей степени, для Gα13.5. Поскольку ожидается, что нативный Gα13 будет локализоваться на плазматической мембране за счет пальмитоилирования [4], мы решили продолжить оптимизацию и характеристику вариантов 2, 3 и 5.

Функциональность помеченных вариантов Gα13

Правильная локализация меченых вариантов Gα13 не обязательно отражает функциональность в отношении активности в передаче сигналов, т.е.е. возможность обмена ВВП на GTP. Чтобы определить функциональность, мы обратились к динамическому клеточному анализу. Этот анализ основан на наблюдении, что эктопическая экспрессия Gα13 необходима для перемещения p115-RhoGEF на плазматическую мембрану после стимуляции GPCR [34]. Чтобы оценить функциональность Gα13, мы совместно экспрессировали рецептор LPA2-P2A-mCherry [22], p115-RhoGEF, помеченный SYFP1, и различные варианты Gα13, включая немеченый нативный вариант (фиг. 2, S2, фиг.). Клетки, в которых Gα13 не был чрезмерно экспрессирован, не демонстрировали перемещения p115-RhoGEF после активации GPCR (фиг. 2B и 2C).Однако в присутствии нативного Gα13 было замечено перемещение p115-RhoGEF (рис. 2B и 2C). Эти данные согласуются с предыдущими данными и показывают, что функциональный Gα13 необходим для рекрутирования p115-RhoGEF на плазматическую мембрану. Затем аналогичные эксперименты были выполнены в присутствии Gα13 вариантов 2, 3 и 5, помеченных mTurquoise2Δ9. Во всех трех случаях наблюдалось устойчивое перемещение p115-RhoGEF (рис. 2). Напротив, перемещение не было очевидным, когда использовался вариант Gα13 (вариант 1), который не показал эффективной локализации на плазматической мембране (рис. 2B и 2C).Следовательно, мы наблюдали корреляцию между локализацией мембраны и функциональностью в анализе набора. В целом, результаты подтверждают мнение о том, что меченые варианты 2, 3 и 5 Gα13 могут быть активированы с помощью GPCR и способны рекрутировать p115-RhoGEF.

Рис. 2. Способность меченых вариантов Gα13 рекрутировать p115-RhoGEF.

(A) Конфокальные изображения репрезентативной клетки HeLa, экспрессирующей SYFP1-p115-RhoGEF, Gα13.2-mTurquoise2-Δ9 и LPA2-P2A-mCherry (здесь показан только SYFP1-p115-RhoGEF, для локализации других конструкций см. S2 рис.) (до (t = 0 с) и после (t = 100 с) добавления 3 мкМ LPA).Ширина картинок 67 мкм. (B) Средняя интенсивность цитоплазматической флуоресценции SYFP1-p115-RhoGEF с течением времени. Через 8 с добавляли 3 мкМ LPA. Все клетки временно экспрессировали рецептор LPA2-P2A-mCherry. Число отображаемых клеток: p115-RhoGEF n = 5, Gα13 немаркированный + p115-RhoGEF n = 15, Gα13.1 + p115-RhoGEF n = 27, Gα13.2 + p115-RhoGEF n = 28, Gα13,3 + p115-RhoGEF n = 24, Gα13,5 + p115-RhoGEF n = 20. Данные были получены из трех независимых экспериментов.(C) Количественная оценка интенсивности флуоресценции при t = 50 с для каждого варианта Gα13 относительно t = 0 с. Точки обозначают отдельные ячейки, а полосы ошибок показывают доверительные интервалы 95%. Количество проанализированных клеток такое же, как в (B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g002

Оценка меченых вариантов Gα13 для измерения активации Gα13

Сконструировав несколько правильно локализующихся вариантов Gα13, способных рекрутировать p115-RhoGEF, мы исследовали, могут ли эти варианты использоваться для сообщения об активации G13.Используя подход на основе FRET (как описано для Gq [32]), мы отслеживали взаимодействие между различными сгенерированными конструкциями Gα13, меченными mTurquoise2, и димером Gβγ, состоящим из немеченых-Gβ и 173cpVenus-Gγ, на отдельных плазмидах. Эти конструкции позволяют измерять соотношение FRET акцептор (173cpVenus) –донор (mTurquoise2), где активация G13 приводит к изменению расстояния и / или ориентации между парой FRET, тем самым вызывая уменьшение отношения FRET.

Здесь мы совместно экспрессировали немеченый LPA2-рецептор с одним из трех меченых вариантов Gα13, немаркированным Gβ и меченным Gγ.После активации рецептора LPA2 изменение соотношения FRET наблюдалось для всех трех выбранных вариантов Gα13 (рис. 3А). Вариант Gα13.2 показал наибольшее изменение отношения FRET, а вариант Gα13.5 — самое низкое (рис. 3A). Некоторые клетки, экспрессирующие вариант Gα13.3, показали более медленный ответ (рис. 3А).

Рис. 3. Способность меченых вариантов Gα13 сообщать о динамической активации Gα13 с помощью ратиометрической визуализации FRET.

(A) Ратиометрические следы FRET клеток HeLa, экспрессирующих рецептор LPA2 (без тегов), Gβ (без тегов), один из вариантов Gα13 (как указано в заголовке графиков), помеченных mTurquoise2-Δ9, и Gγ, помеченных cp173Venus.Серые линии представляют отдельные ячейки, а черный график представляет собой среднее значение, столбцы ошибок которого указывают доверительные интервалы 95%. LPA добавляли при t = 42-50 с, на что указывает стрелка. Количество проанализированных клеток составляет: Gα13,2-mTurquoise2-Δ9 n = 20, Gα13,3-mTurquoise2-Δ9 n = 16 и Gα13,5-mTurquoise2-Δ9 n = 11. Данные панели А приобретаются за несколько дней. (B) Ратиометрические следы FRET клеток HeLa, экспрессирующих рецептор LPA2 (без тегов), Gα13.2-mTurquoise2-Δ9 и либо Gγ, помеченный cp173Venus ( n = 38) (и немаркированный Gβ), либо Gβ, меченный mVenus ( n = 25) (и немаркированный Gγ). LPA добавляли при t = 50 с, на что указывает стрелка. Данные из панели B собираются в тот же день.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g003

Недавно было сообщено о датчике FRET для Gα13, в котором использовались меченые Gα и субъединицы Gβ [35]. Таким образом, мы также исследовали, приводит ли маркировка субъединицы Gβ вместо субъединицы Gγ к более высокому изменению соотношения FRET для наиболее эффективного варианта Gα13.Из рис. 3B можно сделать вывод, что мечение субъединицы Gγ с помощью акцептора FRET приводит к наибольшему изменению соотношения FRET при активации Gα13 через рецептор LPA2, что согласуется с нашими предыдущими наблюдениями [32].

Создание и характеристика биосенсоров FRET на активность Gα13

Ранее мы показали для активационных биосенсоров Gαq [28] и Gαi [29], что одна плазмида экспрессии обеспечивает надежную коэкспрессию компонентов сенсора и упрощает трансфекцию.Поскольку все три меченых варианта Gα13 способны сообщать об активации Gα13 с использованием 173cpVenus-Gγ в качестве акцептора FRET, мы разработали одиночные плазмидные сенсоры с использованием каждого из вариантов Gα13. Фиг. 4A показывает схематический обзор конструкции плазмиды для сенсора Gα13. Анализ интенсивностей CFP и YFP из отдельных клеток показывает лучшую корреляцию для одной плазмидной системы по сравнению с клетками, трансфицированными отдельными плазмидами (рис. 4B).

Рис. 4. Разработка и характеристика биосенсоров активации Gα13 на основе FRET.

(A) Архитектура конструкции биосенсора Gα13, кодирующей Gβ-2A-cp173Venus-Gγ ₂ -IRES-Gα13-mTurquoise2-Δ9, под контролем промотора CMV. (B) Эмиссию CFP и YFP измеряли из отдельных клеток, экспрессирующих сенсор Gα13.2 из одной плазмиды, или из клеток, трансфицированных отдельными плазмидами, кодирующими Gα13.2 и cp173Venus-Gγ ₂ . R ² — коэффициент корреляции. (C) Конфокальные изображения, показывающие локализацию Gα13 в вариантах сенсора (верхний, голубой) и cp173Venus-Gγ ₂ (нижний, желтый) в клетках HeLa (для Gα13.2 расположение датчика в Hek293T и HUVEC см. S3 рис.). Ширина изображений 75 мкм. (D) Следы соотношения FRET для HUVEC, экспрессирующих различные биосенсоры Gα13, стимулированных тромбином при t = 100 с (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал). Соответствующие кривые YFP ​​и CFP см. На рис. S4. Количество проанализированных ячеек составляет: датчик Gα13.2 n = 16, датчик Gα13.3 n = 11, датчик Gα13.5 n = 16.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g004

Как можно заключить из фиг. 4C, субклеточная локализация различных сенсоров Gα13, экспрессируемых в клетках HeLa, сходна.Как опубликовано, варианты Gα13 в основном расположены на плазматической мембране, а Gγ — на плазматической мембране и эндомембранах [28]. В клетках Hek293T, однако, временная экспрессия сенсора Gα13.2 приводит к очень круглым клеткам, которые легко отделяются (S3 Рис.), Что позволяет предположить, что очень высокая временная экспрессия сенсора может привести к усилению базальной активности Gα13.

Затем мы оценили работу датчиков в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Известно, что HUVEC реагируют на тромбин, активируя эндогенные рецепторы, активируемые протеазой (PAR), что приводит к передаче сигналов Gα13-RhoA [11,36].Мы не наблюдали эффекта эктопической сенсорной экспрессии в HUVEC. Когда к HUVEC добавляли тромбин, датчик Gα13.2 показал наиболее выраженное изменение FRET (рис. 4D). Это согласуется с ранее описанными четко определенными изменениями FRET сенсора Gx13.2 после стимуляции S1P в HUVECs [11]. Основываясь на данных визуализации соотношения FRET в HUVEC и HeLa, мы выбрали датчик Gα13.2 в качестве предпочтительного биосенсора активации Gα13 из-за его высокой чувствительности и надежного изменения соотношения FRET при активации Gα13.

Характеристика ингибирования Gα13 белком, активирующим ГТФазу

По нашим данным, Gα13.2 достаточно чувствителен для обнаружения передачи сигналов G13, активируемых эндогенными рецепторами тромбина в HUVEC. Мы и другие [11,37,38] использовали домен регулятора передачи сигналов G-белка (RGS) p115-RhoGEF в качестве ингибитора передачи сигналов G13. Домен RGS проявляет активность GTPase Activating Protein (GAP) [39]. Однако неясно, происходит ли ингибирование RGS-доменом в клетках из-за активности GAP или из-за конкурентного связывания RGS-домена и последующих эффекторов с Gα13. В последнем случае можно ожидать изменения соотношения FRET при наличии домена RGS.Чтобы понять механизм действия, мы использовали сенсор Gα13.2 и ко-экспрессировали связанный с мембраной RGS (Lck-mCherry-p115-RGS), который, как показано, эффективно ингибирует активацию RhoA [11].

В присутствии домена RGS мы не наблюдали изменения соотношения FRET сенсора Gα13.2 после добавления тромбина к HUVEC (рис. 5A и 5B и S1 Movie). В контрольном образце (Lck-mCherry) мы действительно наблюдали изменение соотношения сенсора Gα13.2, вызванное тромбином (рис. 5A и 5B и S2 Movie), в то время как соотношения FRET в состоянии покоя были одинаковыми для обоих условий.Отсутствие ответа FRET в присутствии домена RGS, отражающее подавление активного GTP-связанного Gα13, свидетельствует о том, что активность GAP участвует в ингибирующем эффекте домена RGS. Кроме того, мы изучили индуцированное тромбином сокращение HUVEC и показали, что чрезмерная экспрессия домена RGS предотвращает сокращение клеток, даже приводя к общему увеличению площади клеток (рис. 5C и S3 Movie). Вместе эти данные показывают, что домен RGS ингибирует активацию Gα13 и, как следствие, активацию RhoA, которая эффективно блокирует сокращение клеток.

Рис. 5. Влияние домена p115-RhoGEF RGS на активность Gα13.2 и морфологию клеток.

(A) Нормализованные ратиометрические кривые (верхние графики) и соответствующие кривые YFP ​​и CFP (нижние графики) (пунктирные линии показывают 95% доверительный интервал) HUVEC, которые были трансфицированы либо датчиком Gα13.2 FRET, либо Lck-mCherry (контроль, n = 11) или датчик Gα13.2 FRET и Lck-mCherry-RGS (+ RGS, n = 13). Клетки стимулировали при t = 110 с. (B) Ратиометрические изображения репрезентативных клеток, измеренные в (A).Холодные цвета представляют низкие отношения YFP / CFP, соответствующие отношениям эмиссии (ER) справа. (C) Изменение площади ячеек, измеренное в (B), визуализированное в соответствии с панелью LUT справа. Точечные диаграммы справа представляют отдельные измерения (± 95% ДИ) соответствующих клеток, измеренные в (A). Ширина изображения = 54 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g005

Применение биосенсора Gα13.2 в анализах активации GPCR

Опубликованные данные о сцеплении GPCRs с Gα13 часто основаны на косвенных измерениях, и поскольку нижестоящие сигнальные эффекты перекрываются с нижележащими сигнальными эффектами Gq, трудно сделать твердые выводы об участии любой из субъединиц [14].Наш новый датчик FRET позволяет напрямую наблюдать активацию Gα13. Поэтому мы оценили ответы Gαq и Gα13 на стимуляцию выбранных GPCR, опубликованных как сцепление с Gα13 [26,34,40,41]. Эти эксперименты проводили на клетках HeLa, временно экспрессирующих соответствующий GPCR. В качестве контроля стимулировались клетки, экспрессирующие только сенсор Gα13 или Gαq, что не вызывало заметного сенсорного ответа (рис. 6А). При стимуляции рецептора LPA2 (LPA2R) активируются как Gαq, так и Gα13, что соответствует опубликованным данным.Следует отметить, что ряд клеток (47 из 60 для Gαq и 23 из 37 для Gα13), временно экспрессирующих рецептор LPA2, не смогли показать ответ Gα13 или Gαq (рис. 6B). При стимуляции рецептора ангиотензина II типа 1 (AT1R) наблюдается заметный ответ датчика Gαq по сравнению с минимальным ответом датчика Gα13, который аналогичен контролю (сравните фиг. 6C и 6A). Рецептор кисспептина (KissR или GPR54) показал четкую реакцию сенсора Gαq и отсутствие ответа сенсора Gα13 при стимуляции (фиг. 6D).Вместе эти результаты указывают на то, что LPA2R связывается как с Gαq, так и с Gα13, тогда как AT1R и KissR связаны с Gαq и почти не связаны с Gα13. Более того, это показывает, что наш новый датчик Gα13 действительно может быть использован для различения Gα13- и Gαq-связанной передачи сигналов GPCR.

Рис. 6. Прямое наблюдение активации Gα13 и Gαq разными GPCR.

Нормализованные соотношения-метрические следы FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gq (серая линия) или датчиком G13.2 (черная линия) (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал).(A) В качестве контроля измеряли клетки, экспрессирующие только датчик Gq ( n = 37) или G13.2 ( n = 20). Агонисты добавляли последовательно через 50, 150 и 230 секунд визуализации. (B) Соотношение следов клеток, трансфицированных немеченым рецептором LPA2 рядом с Gαq ( n = 13 (из 60 в целом)) или Gα13.2 ( n = 14 (из 37 в целом)) , стимулированный при t = 50 с. (C) Отношение следов клеток, трансфицированных рецептором ангиотензина II типа 1-P2A-mCherry, рядом с Gαq ( n = 22) или Gα13.2 ( n = 9) сенсор, стимулированный при t = 50 с. (D) Соотношение следов клеток, трансфицированных немаркированным рецептором поцелуя рядом с сенсором Gαq ( n = 13) или Gα13.2 ( n = 30), стимулированных при t = 50 с (указано стрелкой) .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.g006

Обсуждение

Комбинированная активация различных классов гетеротримерных G-белков с помощью GPCR определяет, какие сигнальные сети будут активированы.Известно, что для одного из классов G-белков, G12 / 13, его активация была чрезвычайно сложной. Здесь мы сообщаем о разработке, характеристике и применении биосенсора на основе FRET для активации Gα13. Этот новый инструмент можно использовать для изучения активации Gα13 GPCR в отдельных живых клетках. Кроме того, мы показываем, что датчик G13 достаточно чувствителен, чтобы сообщать об активации эндогенного рецептора в первичных клетках человека (HUVEC).

До сих пор инструменты, доступные для изучения активации Gα13 в отдельных живых клетках, были ограничены.Стратегии на основе BRET использовались для изучения активации класса G12. С этой целью люцифераза Renilla reniformis (Rluc) была вставлена ​​в Gα13 после остатка Ile 108 [42] или Leu 106 [26]. Однако мы обнаружили, что вставка mTurquoise2 после остатка Leu 106 (Gα13.1) не приводит к функционально маркированной субъединице, возможно потому, что Leu106 является частью α-спирали.

Три из пяти оцененных сайтов инсерции mTurquoise2 привели к локализации на плазматической мембране, помеченному Gα13, который был способен рекрутировать p115-RhoGEF на плазматическую мембрану.Локализованный в цитоплазме, меченый вариант Gα13.1 не был способен рекрутировать p115-RhoGEF, что указывает на то, что локализация на плазматической мембране необходима для функционирования. Поскольку все функциональные варианты Gα13 могут сообщать об активации G13, как определено с помощью визуализации соотношения FRET, мы разработали одиночные плазмидные сенсоры для этих трех вариантов. В клетках HeLa локализация, как и ожидалось, Gα13 на плазматической мембране и Gγ на плазматической мембране и эндомембранах. Биосенсоры активации Gα13 экспрессировались в HUVEC и могли сообщать об активации G13 через эндогенные рецепторы, активируемые протеазой (PAR).Сенсор Gα13.2 является наиболее эффективным биосенсором Gα13, исходя из его чувствительности и величины изменения соотношения FRET при активации. Дальнейшее улучшение датчиков может быть достигнуто путем изменения пар FRET [43] или изменения их относительной ориентации путем круговой перестановки [44].

Пока наша рукопись находилась в стадии подготовки, сообщалось о другом варианте Gα13, меченном mTurquoise2 [35]. В этом исследовании флуоресцентный белок был вставлен после остатка 127 Gα13, что очень похоже на наш Gα13.2 вариант, и он показал локализацию плазматической мембраны. Более того, Bodmann et al. наблюдали изменение FRET, когда вариант Gα13, меченный YFP, использовался в комбинации с субъединицей Gβ, меченной CFP, для сообщения об активации рецептора тромбоксана A2 [35]. Независимое наблюдение изменения FRET с использованием аналогичного помеченного варианта Gα13 подтверждает наше мнение о том, что биосенсор на основе G13.2 FRET является ценным инструментом для изучения активации Gα13.

Преимущество нашего датчика FRET заключается в том, что обнаруживается более сильное изменение соотношения, чем для датчика, о котором сообщают Bodmann et al.2017. Хотя они обнаружили максимальное изменение коэффициента FRET на 10%, мы смогли достичь изменения коэффициента FRET до 25% (рис. 3). Это может быть связано с использованием меченого Gβ вместо субъединицы Gγ, поскольку мы также наблюдаем более низкое изменение отношения FRET при использовании меченого Gβ (Рис. 3B). Примечательно, что Bodmann et al. обнаруживают увеличение FRET при стимуляции Gα13 (увеличение YFP, снижение интенсивности CFP), тогда как мы обнаруживаем снижение FRET при стимуляции Gα13 (рис. 3B). Все описанные нами сенсоры G-белка (Gαq, Gαi1,2,3 и Gα13) показывают снижение FRET при активации во всех испытанных до сих пор условиях [11,29,32], что соответствует диссоциации субъединиц Gα и Gβγ. .Более того, субъединицы Gα13, помеченные в разных сайтах (Gα13.2, Gα13.3 и Gα13.5), все демонстрируют снижение FRET (рис. 3). Одно заметное отличие состоит в том, что мы используем донора, помеченного Gα13, и Bodmann et al. используйте акцептор (YFP) с меткой Gα13. Однако неясно, как эта разница может приводить к противоположным изменениям FRET при активации, и поэтому у нас нет твердого объяснения различий в изменении FRET, наблюдаемых Bodmann et al. [35] и в этом исследовании.

Преимущество сконструированного нами сенсора состоит в том, что он позволяет одновременно продуцировать три белка, составляющих гетеротример, из одной плазмиды, и что донор и акцептор присутствуют с четко определенной стехиометрией [28].Это очевидно из лучшей корреляции между интенсивностями эмиссии CFP и YFP по сравнению с трансфекцией отдельных плазмид (рис. 4B). Более того, единая плазмидная система упрощает распространение и применение сенсора. Особенно в первичных клетках, таких как HUVEC, более сложно получить одновременную экспрессию белка из нескольких плазмид, тогда как временная экспрессия единственной сенсорной плазмиды в HUVEC была эффективной.

RGS-домен p115-RhoGEF эффективно ингибирует опосредованную GPCR-Gα12 / 13 активацию RhoA в эндотелиальных клетках [11] и сокращение клеток, как показано на фиг. 5C.В этих условиях датчик Gα13.2 не показывал изменения отношения FRET, что свидетельствует об отсутствии активации. Отсутствие изменения FRET согласуется с идеей, что активность GAP домена RGS отключает активность Gα13 [39].

Применяя сенсор Gα13.2 в клетках HeLa, мы показали, что и Gα13, и Gαq активируются через рецептор LPA2. Напротив, рецептор Kiss и рецептор AT1 вызывали преимущественно сенсорный ответ G? Q. Из наших данных невозможно судить, является ли минорный ответ Gα13 на активацию рецептора AT1 биологически значимым.GPCR, проанализированные в этом исследовании, сообщались как связанные с Gα13 и / или Gαq в других исследованиях [26,34,40,41]. Следует отметить, что временная экспрессия рецептора LPA2 показывает несколько нереагирующих с точки зрения активности Gαq или Gα13. Это можно объяснить недостаточным уровнем рецептора для достижения детектируемой активации.

Поразительно, но рецептор Kiss не активировал биосенсор Gα13, указывая на то, что неспецифическое беспорядочное связывание GPCR с эктопически экспрессируемым биосенсором G-белка не обнаружено.Напротив, мы ранее наблюдали, что HUVEC, обработанные S1P, действительно показывают активацию Gα13, но не активацию Gαq [11]. Вместе эти наблюдения предполагают, что наш набор биосенсоров на основе FRET обеспечивает способ определения селективности связывания GPCR по отношению к гетеротримерным G-белкам в живых клетках. Было бы целесообразно дополнить такие исследования дополнительными считываниями, чтобы проверить возможное возмущение эктопически экспрессируемых сенсоров G-белка.

Таким образом, результаты, полученные в этом исследовании, указывают на то, что Gα13.Биосенсор 2 представляет собой чувствительный датчик активации Gα13 для визуализации живых клеток, который подходит для применения в первичных клетках и способен обнаруживать эндогенную активацию GPCR.

Материалы и методы

Клонирование / конструирование плазмиды

mTurquoise2-Δ9 было вставлено в последовательность Gα13 с использованием ранее описанной стратегии [29]. ПЦР выполняли с последовательностью mTurquoise2, чтобы усечь ее и фланкировать сайтами AgeI с использованием праймеров Fw 5’-ATACCGGTTCTATGGTGAGCAAGGGCG-3 ’и Rv 5’-TAACCGGTGATCCCGGCGGC -3’.Чтобы определить, в какие позиции мы хотели вставить mTurquoise2 в Gα13, мы использовали Pymol, чтобы посмотреть на структуру Gα13, и мы использовали ClustalW для выравнивания нескольких классов Gα. ПЦР с полным вектором была проведена на векторе pcDNA, кодирующем Gα13 человека (заказанном на cDNA.org), чтобы ввести сайт рестрикции AgeI в то место, где мы хотели вставить mTurquoise2, с использованием праймеров Fw 5′-ATACCGGTCATATTCCCTGGGGAGACAAC-3 ‘и Rv 5 ‘- ATACCGGTAAGCTTCTCTCGAGCATCAAC-3′ для Gα13.1, праймеры Fw 5’-ATACCGGTGCCCCCATGGCAGCCC-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTCCGGGTATCAAACGACATCATCTTATC-3′ для Gα13.2, праймеры Fw 5’-ATACCGGTCCCATGGCAGCCCAAGG-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTGGCCCGGGTATCAAACGAC-3′ для Gα13.3, праймеры Fw 5’-ATACCGGTGTTTTTCTTAC’AATATCTAGTCCTGT и Rv 5 ‘-GTACTAGGTCCT и 3′ CTACTGATCαCTGT и RVTACTG5 и RVTACTACGTCCT и RVTACG5 и RVTACTACGTCCTCCT и RVTACTACG5 5’-ATCCGGTCAATATCTTCCTGCTATAAGAGCA-3 ‘и Rv 5′-ATACCGGTTAAGAAAACCCTTGTTTCCACC-3’ для Gα13.6. Вектор пкДНК Gα13, включающий сайт AgeI и продукт ПЦР mTq2, разрезали с помощью AgeI и лигировали, в результате чего получали Gα13, меченный mTurquoise2. Следует отметить, что клонирование варианта Gα13.4 со вставкой mTurquoise2-Δ9 после T139 не удалось.

Мы использовали GFP-p115-RhoGEF (любезный подарок Кита Берриджа, UNC, Чапел-Хилл, США) в качестве матрицы для амплификации p115-RhoGEF с праймерами Fw 5′- AACAGATCTCTTGGTACCGAGCTCGGATC-3 ‘и Rv 5’-AGCGTCGACCCA ‘. Продукт ПЦР, фланкированный сайтами рестрикции BglII и SalI, использовали для клонирования p115-RhoGEF в вектор C1 типа clontech, генерируя mVenus-p115-RhoGEF.

Немеченый рецептор LPA2 был заказан на cDNA.org. Для создания конструкции N1 LPA2 рецептор-P2A-mCherry в стиле clontech проводили ПЦР с использованием праймеров Fw 5’-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3 ’и Rv 5’-TATGTCGACTTGGGTGGAGTCATCAGTG-3’.Конструкция N1-P2A-mCherry, описанная ранее [22], и продукт ПЦР рецептора LPA2 переваривали EcoRI и SalI, и лигирование приводило к конструкции рецептор LPA2-P2A-mCherry.

Варианты одиночного плазмидного сенсора G13 были сконструированы, как описано ранее, с помощью ПЦР с перекрывающимся удлинением [29,45]. Первые ПЦР были выполнены на ранее опубликованном датчике Gαq [28] с использованием праймера A Fw 5′-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 ‘и праймера B Rv 5′-GTCCGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAG-3’ и на вариантах Gα13GATA с меткой mTurquoise2 ‘-3ACGATCATC-FwGATA с тегом mTurquoise2’-ACT ‘и праймер D Rv 5′-ATCAGCGGGTTTAAACG-3’.Вторую ПЦР проводили на смеси обоих продуктов ПЦР с использованием primerA и primerD. Этот второй продукт ПЦР и сенсор Gαq переваривали с помощью SacI и XbaI, и продукт ПЦР лигировали в сенсор, в результате чего получали сенсор одиночной плазмиды G13.

Lck-mCherry-p115-RhoGEF-RGS был сконструирован, как описано ранее [11]. Домен p115-RhoGEF-RGS (аминокислота 1-252) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием Fw 5’-GAGATCAGATCTATGGAAGACTTCGCCCGAG-3 ’и Rv 5’-GAGATCGAATTCTTAGTTCCCCATCACCTTTTTC-3’. Продукт ПЦР и вектор C1 Lck-mCherry в стиле clontech переваривали BglII и EcoRI, и лигирование приводило к вектору C1 стиля clontech, кодирующему Lck-mCherry-p115-RhoGEF-RGS.

Немеченый рецептор Kiss был приобретен на сайте www.cDNA.org.

rAT1aR-mVenus был любезным подарком Петера Варнаи (Университет Земмельвейса, Венгрия). Кодирующая последовательность AT1R была вставлена ​​в mCherry-N1 с пептидом P2A для получения AT1R-P2A-mCherry.

Культура клеток и подготовка проб

клеток HeLa (CCL-2, American Tissue Culture Collection; Manassas, VA, USA) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (Gibco, каталожный № 61965–059) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen, кат. 10270–106), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C в 7% CO ₂ .Для микроскопических экспериментов клетки выращивали на круглых покровных стеклах Ø 24 мм, толщиной 0,13–0,16 мм (Menzel, каталожный № 360208) до 50% слияния и трансфицировали плазмидной ДНК размером 500 нг, 1 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen, каталожный № 11668–019) или 4,5 мкл PEI (1 мг / мл) в воде (pH 7,3) и 100 мкл OptiMEM (Gibco, каталожный № 31985–047) на чашку Ø 35 мм с покровным стеклом Ø 24 мм. Через день после трансфекции покровное стекло помещали в камеру для клеток (Attofluor, Invitrogen). Среда для микроскопии (20 мМ HEPES (pH = 7,4), 137 мМ NaCL, 5.4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 0,8 мМ MgCl2 и 20 мМ глюкозы) добавляли к покровному стеклу в камере для клеток. Логометрические эксперименты FRET проводили при 37 ° C.

Первичные HUVEC, полученные от Lonza (Verviers, Бельгия), высевали в культуральные колбы, покрытые фибронектином (FN). HUVEC, выращенные в среде EGM-2, дополненные одиночными квотами (Lonza) при 37 ° C в 5% CO ₂ . Для микроскопических экспериментов HUVEC трансфицировали в пассаже № 4 или № 5 с помощью системы трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и набора для трансфекции Neon (Invitrogen) и выращивали на покрытых FN круглых покровных стеклах Ø 24 мм, 0.Толщиной 13–0,16 мм (Menzel, каталожный № 360208). Для трансфекции использовали 2 мкг плазмидной ДНК и генерировали одиночный импульс при 1300 В в течение 30 мс. [11]. Логометрические эксперименты FRET проводили при 37 ° C в среде EGM-2 и в 5% CO ₂ .

Конфокальная микроскопия

Для получения конфокальных изображений живых клеток HeLa, временно экспрессирующих либо меченый вариант Gα13, либо сенсор одиночной плазмиды G13, конфокальный микроскоп Nikon A1, оснащенный масляным иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер точечного отверстия был установлен на 1 единицу Эйри. Для проверки локализации меченых вариантов Gα13 образцы возбуждали лазерной линией 457 нм, использовали дихроичное зеркало 457/514 и излучение фильтровали через фильтр 482 / 35BP. Для проверки локализации сенсорных конструкций одиночной плазмиды G13 образцы возбуждали лазерной линией 440 нм (CFP) и 514 нм (YFP), использовали дихроичное зеркало 457/514 и излучение фильтровали через 482 / 35BP (CFP). ) или 540 / 30BP (YFP) соответственно.Изображения были получены в режиме последовательного строчного сканирования, чтобы избежать проступания.

Анализ набора p115-RhoGEF

Для анализа набора p115-RhoGEF клетки HeLa культивировали в среде RPMI с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и L-глутамина (2 мМ) (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия) и хранили при 7 ° C в 5% -ной среде. CO ₂ атмосфера. Клетки собирали, и 50 000 клеток / лунку высевали на восьми-луночные μ-слайды (Ibidi). Через 24 часа клетки временно трансфицировали 0.25 мкг рецептора LPA2-P2A-mCherry, вариантов SYFP1-p115-RhoGEF и Gα13, меченных mTurquoise2 (Gα13.1, Gα13.2, Gα13.3, Gα13.5). Трансфекцию клеток HeLa проводили с использованием Lipofectamine 3000 и Plus Reagent в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). Через 24 часа после трансфекции ростовую среду заменяли средой без фенолового красного RPMI, и измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов. На протяжении всех измерений клетки хранили при 37 ° C.Клетки стимулировали олеоил-L-α-лизофосфатидовой кислотой (10 мкМ, Sigma) в указанный момент времени. Конфокальные изображения получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Мангейм, Германия), оснащенного водно-иммерсионным объективом HCX PL APO 63 ×, N.A. 1.2. mTurquoise2 возбуждали на длине волны 458 нм, а излучение регистрировалось в диапазоне 465-500 нм; SYFP1 возбуждали на длине волны 514 нм, а эмиссию регистрировали в диапазоне 520-550 нм; mCherry возбуждали на длине волны 561 нм, а эмиссия регистрировалась в диапазоне 600-670 нм.Чтобы избежать проступания, изображения были получены в режиме последовательной строчной развертки. Анализ изображений проводился с Фиджи.

Широкопольная микроскопия

Ратиометрическая визуализация FRET клеток HeLa.

Ратиометрические эксперименты FRET были выполнены на широкопольном флуоресцентном микроскопе (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH) [32], оборудованном ксеноновой дуговой лампой с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK) и программным обеспечением Metamorph 6.1, для 240 с или 288 с (элементы управления на рис. 6A) и с интервалом времени 2 с.Интенсивность флуоресценции донора и акцептора регистрировали при времени экспозиции 200 мс на изображение с использованием объектива с 40-кратным увеличением (иммерсионный Plan-Neoflor 40 × / 1,30; Carl Zeiss GmbH). Использовали клетки HeLa, экспрессирующие cp173Venus-Gγ (или немаркированный Gγ на рис. 3В), немаркированный Gβ (или меченый mVenus Gβ на рис. 3В) и один из меченых mTurquoise2 вариантов Gα13 из нескольких плазмид или экспрессирующие единственный плазмидный Gq-сенсор или один вариантов датчика G13. GPCR экспрессируется из отдельной плазмиды, которая представляет собой немеченый рецептор LPA2, немеченый рецептор Kiss или рецептор ангиотензина II типа 1-P2A-mCherry.Флуорофоры возбуждали светом 420 нм (ширина щели 30 нм), излучение mTq2 регистрировалось фильтром BP470 / 30, излучение YFP ​​регистрировалось фильтром BP535 / 30, а излучение RFP регистрировалось фильтром BP620 / 60 путем поворота фильтра. колесо. Через 50 с клетки HeLa (если не указано иное) стимулировали конечной концентрацией 3 мкМ LPA (Sigma), 100 нМ амида Kiss-1 (112–121) (Phoenix Pharmaceuticals) или 10 мкМ ангиотензина (Sigma). Кривые были нормализованы к средней интенсивности первых 5 записанных кадров.ImageJ использовался для выполнения коррекции фона и расчета средней интенсивности каждой ячейки для каждой временной точки. Клетки, не показавшие видимого ответа, не использовали для анализа. Общее количество отображаемых клеток и количество проанализированных клеток («респонденты») указаны в подписях к рисункам.

Ratiometric FRET imaging HUVECs.

Для выполнения ратиометрических FRET-экспериментов на HUVEC мы использовали то же оборудование микроскопии и настройки фильтров, которые использовались для выполнения ратиометрической FRET-визуализации клеток HeLa, однако есть некоторые различия в способах записи данных.Визуализация HUVEC производится в течение 1230 с с интервалом времени 10 с, и визуализация выполняется при 37 ° C в среде EGM-2 и в 5% CO ₂ . Через 110 секунд HUVEC стимулировали конечной концентрацией тромбина 1 Ед / мл (Haematologic Technologies). Процедура обработки изображений, которая использовалась для отображения изменения площади клеток во время микроскопии живых клеток HUVEC, описана в другом месте [11]). Чтобы показать соотношение FRET на изображениях клеток, использовали imageJ. Сначала мы преобразовали CFP и стек YFP в 32-битный тип и скорректировали фоновый сигнал.Затем стопки были разделены для получения стопки YFP / CFP. Мы использовали стек CFP для создания двоичной маски и умножили эту маску на стек YFP / CFP. Наконец, мы применили плавный фильтр для уменьшения шума и использовали таблицу поиска (LUT) для визуализации изменений в соотношении FRET.

Дополнительная информация

S1 Рис. Полное аминокислотное выравнивание четырех классов человеческих Gα-субъединиц гетеротримерных G-белков.

Обратите внимание, что аминокислотная последовательность Gαs соответствует короткой изоформе.Выделенные остатки указывают на аминокислоту, предшествующую вставленному флуоресцентному белку (или люциферазе). Жирным шрифтом выделены сайты, которые ранее использовались для вставки Rluc (Saulière et al., 2012). Вставка mTurquoise2-Δ9 в Gα13 после остатка Q144 (черный) была основана на гомологии с предыдущими вставками в Gαq и Gαi (черный). Удачные сайты для вставки mTurquoise2-Δ9 (R128, A129 и R140) в розовый и неудачные сайты (L106 и L143) в оранжевый.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s001

(PNG)

S3 Рис. Изображения клеток Hek293T (слева), полученные с помощью конфокальной микроскопии, или изображения HUVEC, полученные с помощью широкопольной микроскопии, оба экспрессируют датчик G13.2.

Верхние изображения показывают локализацию Gα13.2, а нижние изображения показывают локализацию Gγ. Клетки Hek293T возбуждали светом 457 нм (CFP) и 514 нм (YFP), и, соответственно, для обнаружения испускаемого света использовали 482 / 35BP и 540 / 30BP. Ширина изображений 70 мкм. Клетки HUVEC возбуждали светом 420 нм (CFP) и 490 нм (YFP), и, соответственно, для обнаружения испускаемого света использовали 470 / 30BP и 535 / 30BP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s003

(PNG)

S4 Рис. Следы CFP и YFP HUVEC, экспрессирующих различные биосенсоры G13, стимулированных 1 ед. / Мл тромбина при t = 100 с (пунктирные линии обозначают 95% доверительный интервал).

Количество проанализированных ячеек: датчик G13.2 n = 16, датчик G13.3 n = 11, датчик G13.5 n = 16.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193705.s004

(PNG)

Благодарности

Мы благодарим сотрудников наших лабораторий за их постоянный интерес и поддержку этого проекта.Плазмида с rAT1aR-mVenus была любезным подарком от Питера Варнаи (Университет Земмельвейса, Венгрия), а GFP-p115-RhoGEF предоставлен Кейт Берридж (UNC, Чапел-Хилл, США).

Список литературы

1. 1. Вассилатис Д.К., Хоманн Дж. Г., Зенг Х., Ли Ф., Ранчалис Дж. Э., Мортруд М. Т. и др. Репертуары рецепторов, связанных с G-белками, человека и мыши. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2003; 100: 4903–8. pmid: 12679517
2. 2. Wettschureck N, Offermanns S. G-белки млекопитающих и их специфические для клеточного типа функции.Physiol Rev.2005; 85: 1159–204. pmid: 16183910
3. 3. Ренс-Домиано С., Хамм Х. Структурные и функциональные взаимоотношения гетеротримерных G-белков. FASEB J. 1995; 9: 1059–66. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7649405 pmid: 7649405
4. 4. Wedegaertner PB, Wilson PT, Bourne HR. Липидные модификации тримерных G-белков. J Biol Chem. 1995; 270: 503–6. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7822269 pmid: 7822269
5. 5. Хеплер-младший, Гилман АГ.G белки. Trends Biochem Sci. 1992; 17: 383–7. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1455506 pmid: 1455506
6. 6. Франк М., Тюмер Л., Лозе М. Дж., Бюнеман М. G Активация белка без диссоциации субъединицы зависит от G {альфа} (i) -специфической области. J Biol Chem. 2005; 280: 24584–90. pmid: 15866880
7. 7. Левицки А., Кляйн С. Диссоциация субъединицы G-белка не является неотъемлемой частью действия G-белка. Chembiochem. 2002; 3: 815–8. pmid: 12210980
8. 8.Зилер С. Регулирование белков RhoGEF рецепторами, сопряженными с G12 / 13. Br J Pharmacol. 2009; 158: 41–9. pmid: 19226283
9. 9. Aittaleb M, Богут, Калифорния, Tesmer JJG. Структура и функция факторов обмена генов нуклеотидов, регулируемых гетеротримерным G-белком. Mol Pharmacol. 2010; 77: 111–25. pmid: 19880753
10. 10. Рохас Р.Дж., Йохе М.Э., Гершбург С., Кавано Т., Козаса Т., Сондек Дж. Галфак непосредственно активирует p63RhoGEF и Trio через консервативное расширение гомологичного домена плекстрина, ассоциированного с гомологией Dbl.J Biol Chem. 2007. 282: 29201–10. pmid: 17606614
11. 11. Рейнхард Н.Р., Мастоп М., Инь Т., Ву Й., Босма Е.К., Гаделла TWJ и др. Баланс между путями Gα i -Cdc42 / Rac и Gα 12/13 -RhoA определяет регуляцию эндотелиального барьера с помощью сфингозин-1-фосфата. Ван Хаастерт П., редактор. Mol Biol Cell. 2017; mbc.E17-03-0136. pmid: 28954861 ​​
12. 12. ван Унен Дж., Инь Т., Ву И.И., Мастоп М., Гаделла TWJ, Годхарт Дж. Кинетика рекрутирования и аллостерической активации изоформ ARHGEF25 гетеротримерным G-белком Gαq.Научный доклад 2016; 6: 36825. pmid: 27833100
13. 13. Worzfeld T, Wettschureck N, Offermanns S. Передача сигналов, опосредованная G (12) / G (13), в физиологии и болезнях млекопитающих. Trends Pharmacol Sci. 2008; 29: 582–9. pmid: 18814923
14. 14. Riobo NA, Manning DR. Рецепторы, связанные с гетеротримерными G-белками семейства G12. Trends Pharmacol Sci. 2005. 26: 146–54. pmid: 15749160
15. 15. Takefuji M, Wirth A, Lukasova M, Takefuji S, Boettger T., Braun T. и др.G (13) -опосредованный сигнальный путь необходим для сердечного ремоделирования, вызванного перегрузкой давлением, и сердечной недостаточности. Тираж. 2012; 126: 1972–82. pmid: 22972902
16. 16. Wirth A, Benyó Z, Lukasova M, Leutgeb B, Wettschureck N, Gorbey S и др. G12-G13-LARG-опосредованная передача сигналов в гладких мышцах сосудов необходима для индуцированной солью гипертензии. Nat Med. 2008; 14: 64–8. pmid: 18084302
17. 17. Миллиган Г. Принципы: расширение возможностей анализа связывания [35S] GTP gamma S.Trends Pharmacol Sci. 2003. 24: 87–90. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12559773 pmid: 12559773
18. 18. Странный PG. Использование анализа связывания GTPγS ([35S] GTPγS и Eu-GTPγS) для анализа активности лиганда и эффективности в отношении рецепторов, связанных с G-белком. Br J Pharmacol. 2010; 161: 1238–49. pmid: 20662841
19. 19. ван Унен Дж., Вулард Дж., Ринкен А., Хоффманн С., Хилл С.Дж., Годхарт Дж. и др. Перспектива изучения передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками, с помощью биосенсоров с резонансным переносом энергии в живых организмах.Mol Pharmacol. 2015; 88: 589–95. pmid: 25972446
20. 20. Lohse MJ, Nuber S, Hoffmann C. Методы резонансной передачи энергии флуоресценции / биолюминесценции для изучения активации и передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками. Pharmacol Rev.2012; 64: 299–336. pmid: 22407612
21. 21. Клистер Т., Мехта С., Чжан Дж. Одноклеточный анализ передачи сигнала G-белка. J Biol Chem. 2015; 290: 6681–8. pmid: 25605723
22. 22. van Unen J, Rashidfarrokhi A, Hoogendoorn E, Postma M, Gadella TWJ, Goedhart J.Количественный одноклеточный анализ сигнальных путей, активируемых сразу после подтипов гистаминовых рецепторов. Mol Pharmacol. 2016; 90: 162–76. pmid: 27358232
23. 23. Салахпур А., Эспиноза С., Масри Б., Лам В., Барак Л.С., Гайнетдинов Р.Р. Биосенсоры BRET для изучения биологии, фармакологии GPCR и передачи сигналов. Фронт-эндокринол (Лозанна). 2012; 3: 105. pmid: 22952466
24. 24. Hébert TE, Galés C, Rebois RV. Обнаружение и визуализация белок-белковых взаимодействий во время опосредованной G-белком передачи сигнала in vivo и in situ с использованием методов, основанных на флуоресценции.Cell Biochem Biophys. 2006; 45: 85–109. pmid: 16679566
25. 25. Джанетопулос С., Девреотес П. Мониторинг опосредованной рецептором активации гетеротримерных G-белков с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии. Методы. 2002; 27: 366–73. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12217653 pmid: 12217653
26. 26. Saulière A, Bellot M, Paris H, Denis C, Finana F, Hansen JT и др. Расшифровка сложности предвзятого агонизма выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol.2012; 8: 622–30. pmid: 22634635
27. 27. Goyet E, Bouquier N, Ollendorff V, Perroy J. Быстрое и высокое разрешение BRET-визуализации отдельных клеток. Научный доклад 2016; 6: 28231. pmid: 27302735
28. 28. Goedhart J, van Weeren L, Adjobo-Hermans MJW, Elzenaar I., Hink MA, Gadella TWJ Jr. Количественная коэкспрессия белков на уровне отдельной клетки — приложение к мультимерному датчику FRET. PLoS One. 2011; 6: e27321. pmid: 22114669
29. 29. ван Унен Дж., Штумпф А.Д., Шмид Б., Рейнхард Н.Р., Хордийк П.Л., Хоффманн С. и др.Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках. PLoS One. 2016; 11: e0146789. pmid: 26799488
30. 30. Wall MA, Coleman DE, Lee E, Iñiguez-Lluhi JA, Posner BA, Gilman AG и др. Структура гетеротримера G-белка Gi альфа 1 бета 1 гамма 2. Клетка. 1995; 83: 1047–58. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8521505 pmid: 8521505
31. 31. Гибсон СК, Гилман АГ. Субъединицы Gialpha и Gbeta определяют селективность активации G-белка альфа2-адренорецепторами.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103: 212–7. pmid: 16371464
32. 32. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al. Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. BMC Biol. 2011; 9: 32. pmid: 21619590
33. 33. Kreutz B, Yau DM, Nance MR, Tanabe S, Tesmer JJG, Kozasa T. Новый подход к производству функциональных субъединиц G альфа дает активированные и деактивированные структуры белков G альфа (12/13).Биохимия. 2006; 45: 167–74. pmid: 16388592
34. 34. Meyer BH, Freuler F, Guerini D, Siehler S. Обратимая транслокация p115-RhoGEF с помощью рецепторов, связанных с G (12/13). J Cell Biochem. 2008; 104: 1660–70. pmid: 18320579
35. 35. Бодманн Э.Л., Кретт А.Л., Бюнеманн М. Усиление рецепторных ответов, вызванных длительным связыванием Gα13 и лейкемией RhoGEF. FASEB J. 2017; 31: 3663–3676. pmid: 28465324
36. 36. Рейнхард Н.Р., ван Хелден С.Ф., Энтони Э.К., Инь Т., Ву Ю.И., Годхарт Дж. И др.Пространственно-временной анализ активации RhoA / B / C в первичных эндотелиальных клетках человека. Научный доклад 2016; 6: 25502. pmid: 27147504
37. 37. Келли П., Стеммле Л.Н., Мэдден Дж. Ф., Филдс Т.А., Даака Ю., Кейси П.Дж. Роль семейства G12 гетеротримерных G-белков в инвазии рака простаты. J Biol Chem. 2006; 281: 26483–90. pmid: 16787920
38. 38. Мартин С.Б., Махон Г.М., Клингер М.Б., Кей Р.Дж., Саймонс М., Дер С.Дж. и др. Рецептор тромбина, PAR-1, вызывает трансформацию путем активации Rho-опосредованных сигнальных путей.Онкоген. 2001; 20: 1953–63. pmid: 11360179
39. 39. Kozasa T, Jiang X, Hart MJ, Sternweis PM, Singer WD, Gilman AG и др. p115 RhoGEF, белок, активирующий ГТФазу для Galpha12 и Galpha13. Наука. 1998; 280: 2109–11. Доступно: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9641915 pmid: 9641915
40. 40. Иноуэ А., Исигуро Дж., Китамура Х., Арима Н., Окутани М., Шуто А. и др. Анализ выделения TGFα: точный и универсальный метод обнаружения активации GPCR. Нат методы.2012; 9: 1021–9. pmid: 22983457
41. 41. Навенот Дж.М., Фуджи Н., Пайпер СК. Активация Rho и Rho-ассоциированной киназы продуктом гена-супрессора метастазирования GPR54 и KiSS1 вызывает изменения морфологии клеток и способствует апоптозу. Mol Pharmacol. 2009. 75: 1300–6. pmid: 19286835
42. 42. Ayoub MA, Trinquet E, Pfleger KDG, Pin J-P. Дифференциальные способы ассоциации рецептора тромбина PAR1 с Galphai1, Galpha12 и бета-аррестином 1. FASEB J. 2010; 24: 3522–35.pmid: 20410441
43. 43. Mastop M, Bindels DS, Shaner NC, Postma M, Gadella TWJ Jr, Goedhart J. Характеристика спектрально разнообразного набора флуоресцентных белков в качестве акцепторов FRET для mTurquoise2. Научный доклад 2017; 7: 11999. pmid: 28931898
44. 44. Фриц Р.Д., Летцельтер М., Рейман А., Мартин К., Фуско Л., Рицма Л. и др. Универсальный набор инструментов для создания чувствительных биосенсоров FRET для визуализации сигналов во времени и пространстве. Sci Signal. 2013; 6: RS12. pmid: 23882122
45. 45.