Примера лада: Купить новую LADA 2021 в автосалоне выгодные цены

Содержание

Сравнение Nissan Primera и LADA (ВАЗ) 2115 по характеристикам, стоимости покупки и обслуживания. Что лучше


Показать только отличия
Рейтинг по отзывам

Характеристики
Основные
Объем двигателя 1.8 л	1.5 л
Тип двигателя Бензин	Бензин
Мощность двигателя 116 л.с.	76 л.с.
Коробка передач Автоматическая	Механическая
Количество передач 4	5
Привод Передний	Передний
Разгон до 100 км/ч 13.6 с	13.0 с
Расход топлива (смешанный) на 100 км 8.0 л	7.6 л
Минимальный объем багажника 450 л	445 л
Максимальный объем багажника 460 л	445 л
Дорожный просвет 150 мм	160 мм
Снаряженная масса	970 кг
Тип кузова Седан	Седан
Класс автомобиля D	B
Страна марки Япония	Россия
Размеры
Длина 4567 мм	4330 мм
Ширина 1760 мм	1650 мм
Высота 1482 мм	1402 мм
Колесная база 2680 мм	2460 мм
Передняя колея 1528 мм	1400 мм
Задняя колея 1534 мм	1370 мм
Объем и масса
Снаряженная масса	970 кг
Полная масса 1810 кг	1390 кг
Минимальный объем багажника 450 л	445 л
Максимальный объем багажника 460 л	445 л
Объем топливного бака 62 л	43 л
Двигатель
Объем двигателя 1796 куб. см	1499 куб.см
Тип двигателя Бензин	Бензин
Расположение двигателя переднее, поперечное	переднее, поперечное
Тип наддува нет	нет
Мощность двигателя 116 л.с.	76 л.с.
Максимальный крутящий момент 163 Н*м	102 Н*м
Расположение цилиндров рядное	рядное
Количество цилиндров 4	4
Количество клапанов на цилиндр 4	2
Система питания двигателя распределенный впрыск (многоточечный)	карбюратор
Степень сжатия 9.5
Диаметр цилиндра и ход поршня 80×88	82×71
Подвеска и тормоза
Тип задней подвески независимая, пружинная	полунезависимая, пружинная
Тип передней подвески независимая, пружинная	независимая, пружинная
Задние тормоза дисковые	барабанные
Передние тормоза дисковые вентилируемые	дисковые
Прочее
Количество дверей 4	4
Количество мест 5	5
Максимальная скорость 182 км/ч	164 км/ч
Пробег на полном баке 775 км	566 км
Марка топлива АИ-95	АИ-92
Расположение руля левый	левый
Экологический класс	Euro 4
Выбросы CO2
Фотографии
Сбоку
Дверь
Колесный диск
Передняя панель
Спереди
Багажник
Ручка КПП
3/4 сзади
Задний фонарь
3/4 спереди
Интересная деталь 1
Руль
Салон спереди
Сзади
Приборная панель
Интересная деталь 2
Боковое зеркало
Передняя фара
Салон сзади
Комплектация
Обзор
Автоматический корректор фар
Датчик дождя
Датчик света
Дневные ходовые огни
Омыватель фар
Противотуманные фары
Система адаптивного головного освещения в повороте
Система адаптивного освещения
Система управления дальним светом
Салон
Люк
Обогрев рулевого колеса
Отделка кожей рулевого колеса
Отделка кожей рычага КПП
Панорамная крыша / лобовое стекло
Передний центральный подлокотник
Складывающееся заднее сиденье
Спортивные передние сиденья
Тонированные стекла
Третий ряд сидений
Безопасность
Антиблокировочная система
Блокировка замков задних дверей
Бронированный кузов
Датчик давления в шинах
Система стабилизации
ЭРА-ГЛОНАСС
Мультимедиа
AUX
Android Auto
Bluetooth
CarPlay
USB
Голосовое управление
Мультимедиа система для задних пассажиров
Мультимедиа система с ЖК-экраном
Навигационная система
Розетка 12V
Розетка 220V
Яндекс. Авто
Защита от угона
Центральный замок
Иммобилайзер
Датчик проникновения в салон (датчик объема)
Элементы экстерьера
Аэрография
Обвес кузова
Рейлинги на крыше

О таких машинах мечтали в 90-е — 6 ярких примеров — журнал За рулем

Мечты об идеальном автомобиле воплощали в жизнь «дочки» и «сыночки» отечественных автозаводов. Удивительно, но среди странноватых, порой комичных, иногда и диких переделок — русский тюнинг не зря называли бессмысленным и беспощадным — встречались и интересные, технически грамотные работы.

Материалы по теме

Нынче, когда даже незаводские колпаки на колесах, не говоря о самих колесах, становятся прегрешением перед властями, диву даешься: чего только не делали на основе отечественных автомобилей четверть века назад! Я говорю не о частниках, улучшающих свои машины, а о небольших, но порой очень активных тюнинговых фирмах, расплодившихся на просторах взбудораженной переменами страны.

Не избалованные разнообразием покупатели и в советские времена пытались индивидуализировать свои машины. Кто-то — хотя бы дополнительными фарами, кто-то — нестандартными колпаками колес, черной (по моде середины 1970‑х) крышей, на худой конец — антенной, способной задеть низколетящий самолет.

А тут такое раздолье! Тем более что заводы поощряли работу новых мастерских, особенно, конечно, приближенных — дочерних, или, как шутили тогда, «сыновьих». В условиях конкуренции с подержанными и даже с новыми иномарками интересные модификации заводам были кстати. А демократичные законы тех лет позволяли разгуляться.

Материалы по теме

Условно тюнинг делился на три направления: красиво, быстро и улучшение проходимости. Последний пункт оставим пока в стороне, он заслуживает отдельного рассказа.

ВАЗ‑2108 по имени Caprice фирмы Лада-Брокер — пример довольно диковатого отечественного тюнинга раннего периода.

ВАЗ‑2108 по имени Caprice фирмы Лада-Брокер — пример довольно диковатого отечественного тюнинга раннего периода.

Материалы по теме

Клеем и скотчем

Материалы по теме

«Чем приклеить тюнинги на Ниву?» Этот вопрос нашего читателя, давно превратившийся в редакционный анекдот, был абсолютно реальным. Аналогичные вопросы в 1990‑х перед «За рулем» ставили во многих (тогда бумажных!) письмах. Украшение автомобилей накладками на бамперы и пороги, причудливыми спойлерами стало тогда массовым увлечением. Страсть эту подогревали еще и наши автомобили, в основном Самары, аналогично обработанные, с той или иной долей вкуса или безвкусицы, за рубежом. Певучее слово «тюнинг», недавно мало известное, стало популярным почти как «бизнес», «коммерция», «консалтинг» и иные, с упоением произносимые в перестройку слова.

Материалы по теме

Множество мастерских пытались перещеголять друг друга причудливостью пластмассового обвеса. Понемногу стали заниматься и салонами, меняя штатные рули на маленькие «бублики», иногда деревянные, обивку, панели приборов, устанавливая электростеклоподъемники и CD-проигрыватели, которые тогда казались чудом. В конструкцию на первых порах обычно не вторгались. Максимум — импортные колесные диски, амортизаторы, изредка — спортивные воздушные фильтры.

Волги: длинные и с удобствами

Одновременно с тюнинговыми Самарами появились переделанные Волги. Ведь почти недоступную вчера машину теперь мог купить каждый, причем относительно недорого. Но, мягко говоря, консервативный дизайн быстро наскучил. Кто-то считал Волгу, оформленную в эдаком спортивном стиле, китчем, но иным нравился именно такой идеологический контраст.

Вариант представительской Волги по имени Персона от компании «Самотлор-НН». Несколько таких машин сохранилось.

Вариант представительской Волги по имени Персона от компании «Самотлор-НН». Несколько таких машин сохранилось.

Волгу, разумеется, встраивали и в бизнес-класс. Тем более что для многих красиво и богато — синонимы. Волги не только стали отделывать изнутри деревом, но и удлинять. Кто насколько мог! Вставки доходили до полуметра. Более гармонично выглядело творение нижегородской компании «Рида», которая аккуратно нарастила в длину каждую дверь лишь на 150 мм.

Салоны тюнинговых Волг обычно обшивали кожей и по возможности начиняли опциями: от кондиционера до телевизора.

Салоны тюнинговых Волг обычно обшивали кожей и по возможности начиняли опциями: от кондиционера до телевизора.

Материалы по теме

В салоне длинных Волг были все возможные, по тем временам, удобства: кожа, телевизоры, бары (какой без них бизнес?), климатические установки. Последние, как правило, полукустарные и работали, мягко говоря, своеобразно. С одной из них в качестве эксперимента имел несчастье общаться в комплекте с редакционной Волгой. Включалась и выключалась она с неуловимой логикой, и отменно способствовала стремительному, без предупреждения, запотеванию ветрового стекла.

Лады: еще длиннее!

Удлинения не избежала и Лада. В 1993 году появился Амадео 500 на основе Самары фирмы «Мастер-Дизайн». Машину нарастили аж на 500 мм, салон отделали по последнему слову отечественной роскоши. Однако мотор остался родным — 1,6 литра, 88 л. с.

Амадео‑500 — представительская вариация Лады Самары со вставкой в 500 мм.

Максимальной длины достиг ВАЗ‑21109 Консул 1996 года. Базу увеличили аж на 650 мм! Двигатели на двух опытных образцах опять сохранили серийные — 1,5 л, 91 л.с. Заказов на Консул не было, да и трудно представить покупателя эдакого чуда.

Самую длинную Ладу — ВАЗ‑21109 Консул — нарастили в колесной базе аж на 650 мм.

В салоне Консула — все мыслимые в те времена удобства. Причем в таком количестве, что гигантского простора не осталось.

В салоне Консула — все мыслимые в те времена удобства. Причем в таком количестве, что гигантского простора не осталось.

Зато ВАЗ‑21108 Премьер мастерской «СуперАвто» со вставкой всего 175 мм делали-таки мелкосерийно. На таких машинах (конечно, черных!) ездило высокое вазовское начальство.

Ока: Винни и Астро

Тюнинговые фирмы не оставили вниманием и маленькую Оку. Чего только с крошкой не творили! По заказу ЗМА в центре стиля ВАЗа под руководством Юрия Верещагина создали лупоглазый автомобильчик по прозвищу Винни.

Характерный пример «плюшевой» стилистики Оки — микролитражка по имени Винни, спроектированная в Тольятти.

Противоположностью «плюшевости» этого «медвежонка» стала Ока московского ателье «Виста» с подчеркнуто взрослым «лицом» по мотивам Самары первого поколения. Оригинальные пластиковые накладки на Оку делала и фирма «Астро» из Набережных Челнов. Помимо внешности неутомимые тюнингисты меняли обивки салона, ставили сиденья и комбинации приборов от «взрослых» ВАЗов.

Астро‑11301 — вариация на тему Оки от фирмы «АстроКар» из Набережных Челнов.

Салон Астро‑11301 решили в веселенькой, яркой стилистике. Заодно поставили более удобные сиденья.

Изменений во внешности многим вскоре стало мало. Захотелось, чтобы эта красота стала еще и лучше управляться, была понадежней, но в первую очередь — чтобы ехала быстрей. Об этом мы еще расскажем — заходите почаще!

ТЮНИНГ ПО-НАУЧНОМУ

В 1990‑х в стенах НАМИ, оставшимся в новых реалиях на периферии российского автопрома, фирма «Престиж-НАМИ» создала несколько вариаций на тему отечественных машин. Среди них — удлиненная Волга-Кортеж на основе ГАЗ‑31029 и интересный, хотя и забавный, вариант Волги по имени Престиж с передком, напоминающим Jaguar, но при этом с решеткой радиатора в стиле церковного купола. Начинка обеих машин была серийной.

Волга-Кортеж, сделанная в конце 1990-х в НАМИ.

Волга-Престиж — обрусевший Jaguar от компании «Престиж-НАМИ».

Самые яркие примеры «тюнинга по-русски» 1960-1990-х мы собрали тут.

Мы точно знаем, что нужно автолюбителю, и предлагаем это на лучших условиях. Автоаксессуары «За рулем» — выбор экспертов!

Ассортимент расходных материалов под ТМ «За рулем» постоянно расширяется. Оцените и вы качество наших товаров!

«За рулем» теперь можно читать в Instagram.

Фото: из архива «За рулем»

В США новую Lada Niva поставили в пример дизайнерам Hummer. Видео

В США восхитились новой Lada Niva Фото: Александр Константинов © URA.RU

«Величайший советский автомобиль всех времен, Lada Niva, возродится. Это результат новой амбициозной бизнес-стратегии Renault с участием российского автопроизводителя АвтоВАЗа и дорожной карты, разработанной для новой „Нивы“», — говорится в статье.

Хвалебный отзыв получил и промо-ролик, который полон «потрясающими холодными погодных перспектив», и сам дизайн автомобиля. Отдельно журналист отметил L-образную светодиодную ленту на фарах и менее заметную D-образную форму внутри, которые отсылают к названию марки Lada (LD). «Даже если это не было намеренно, это кажется хорошо реализованным кусочком дизайна, который чтит икону. Команда дизайнеров Hummer GM могла бы многому научиться у новой „Нивы“», — говорится в материале.

Подписывайтесь на URA.RU в Google News и наш канал в Яндекс.Дзен, следите за главными новостями России и Урала в telegram-канале URA.RU и получайте все самые важные известия с доставкой в вашу почту в нашей ежедневной рассылке.

Американское автомобильное издание Jalopnik восхитился новым поколением внедорожника Lada Niva. Автор материала даже поставил эту модель в пример команде дизайнеров марки Hummer. «Величайший советский автомобиль всех времен, Lada Niva, возродится. Это результат новой амбициозной бизнес-стратегии Renault с участием российского автопроизводителя АвтоВАЗа и дорожной карты, разработанной для новой „Нивы“», — говорится в статье. Хвалебный отзыв получил и промо-ролик, который полон «потрясающими холодными погодных перспектив», и сам дизайн автомобиля. Отдельно журналист отметил L-образную светодиодную ленту на фарах и менее заметную D-образную форму внутри, которые отсылают к названию марки Lada (LD). «Даже если это не было намеренно, это кажется хорошо реализованным кусочком дизайна, который чтит икону. Команда дизайнеров Hummer GM могла бы многому научиться у новой „Нивы“», — говорится в материале.

Коврики в салон Ниссан Примера 2002-2008 Lada locker

Коврики в салон Ниссан Примера 2002-2008 — Lada locker — extruzion

Автоковрики Nissan Primera 2002-2008 изготовлены для конкретной модели автомобиля, надежно защищают салон от грязи и протирания.

Nissan крупнейший японский автопроизводитель в мире. Основана в Японии в 1933 году, благодаря слиянию двух компаний «Тобата имоно» и «Нихон сангё».
У нас можете приобрести коврики Ниссан Примера 2002-2008 таких производителей: Lada locker — extruzion.

На коврах Ниссан Примера 2002-2008 таких производителей: Lada locker — extruzion предусмотрены люверсы — для крепления коврика в салоне автомобиля — что бы они не ползали по салону (если люверсы идут с завода и установлены автопроизводителем). Большинство моделей идут со специальным местом для отдыха левой ноги — лентяйкой.

Предприятия компании Nissan находятся во многих странах мира — США, Мексика, Великобритания, Юар, Россия и др. в России, а вернее тогда еще бывшем СССР компания с 1983 года, занимает 4 место по продажам автомобилей на отечественном рынке.

Автоковрики — автомобильные коврики в салон — Nissan Primera 2002-2008 — Lada locker — extruzion цена в Автошаре: от 979 до 979 грн

Товар	Цена
Коврики в салон Nissan Primera 2001-2007 полиуретан (резиновые) комплект Lada Locker	979 грн

Автоковрики Ниссан Примера 2002-2008 — Lada locker — extruzion

Коврики легко чистятся, моются напором воды на автомойке, удобны в эксплуатации и не требуют специального ухода.

Самыми популярными моделями считается такие марки как Nissan Teana, Nissan X-Trail и Nissan Murano и Nissan Almera. Эмблема компании символизирует искренность, в кругу марки восходящее солнце.

Магазин АвтоШара бесплатно доставит коврики Ниссан Примера 2002-2008 : таких производителей: Lada locker — extruzion в любой город Украины компаниями — перевозчиками и по Киеву курьером. Также возможен самовывоз из нашего офиса. Правильно подобранные коврики отлично подойдут для Nissan Primera 2002-2008 .

Будем благодарны за отзывы о коврах салона Ниссан Примера 2002-2008 таких производителей: Lada locker — extruzion в нашем магазине — АвтоШара.

Первый муж Лады Дэнс забрал у бывшей жены детей и запрещает им общаться

Павел Свирский

Вскоре после развода Павел Свирский перестал скрывать отношения с Региной Мянник. По слухам, именно актриса стала причиной разлада в семье. У пары был подписан брачный договор, поэтому они с легкостью разрешили материальные вопросы. Бывшие возлюбленные договорились, что дети (девочки двух и пяти лет) живут с матерью, а отец общается с ними в любое время с 9 до 21:00 по месту их жительства. Впрочем, избежать драмы все же не удалось.

Павел, согласившись оставить детей с матерью, поставил ряд жестких условий. Бизнесмен нанял надзирателя, который контролировал каждый шаг Людмилы и девочек. По требованиям Свирского Людмила с детьми должна находиться в доме после девяти вечера — и ни минутой позже. «Каждый день! Если тебя нет дома в 21:00, я забираю детей!» — угрожал бизнесмен экс-супруге.

Не разрешалось и приглашать к себе гостей, даже если это близкие друзья и родственники. Он также имел доступ к видео камерам в доме и следил за происходящим. Когда Свирский приезжал общаться с детьми, то требовал, чтобы Людмила и ее 13-ти летний сын от первого брака не попадались ему на глаза, а лучше ждали на веранде, пока он не уедет.

не пропустите«Когда-то я очень близко дружила с его женой»: Регина Мянник впервые о новом романе

«Я буду заходить и заезжать когда посчитаю нужным. Я тебя попросил! Подождать на веранде, так как мне тебя и твоего сынка видеть противно», — заявлял бизнесмен.

Несмотря на то, что женщина выполняла все требования влиятельного предпринимателя, он постоянно угрожал забрать детей. У Людмилы сохранена переписка его жестких высказываний. «А я богатый, у меня гувернантки, повара и прочие. Есть, кому присмотреть», — хвастался Павел.

У актрисы двое сыновей от первого брака

Бывшая жена бизнесмена рассказала, что 20 декабря в 11:40, в то время пока она была на очередном судебном заседании, инициированном Свирским, тот забрал девочек из детского сада и увез их к новой пассии. Ни полиция, ни органы опеки повлиять на ситуацию не могут, так как судом решение об определении места жительства девочек до сих пор не вынесено. Прошло уже 35 дней, как экс-супруга Свирского не может увидеть дочерей, а им запрещено общаться с матерью. Она в отчаянии, и намерена бороться за детей в судебном порядке.

не пропуститеЛада Дэнс рассказала, как увела мужчину из семьи

Сам Павел обвиняет Людмилу в алкоголизме. Бизнесмен даже уверяет, что у него есть видеодоказательства и медицинские документы. Однако никаких официальных подтверждений проблем у женщины со спиртными напитками нет. Более того, женщина уверяет, что прошла ряд независимых экспертиз, которые доказывают — она не страдает алкоголизмом.

Напомним, что Свирский был первым супругом Лады Дэнс. Певица родила от него сына Илью и дочь Елизавету. После расставания со звездой состоятельный мужчина несколько раз пытался создать крепкую семью, Людмила являлась его пятой избранницей, а детей у олигарха от разных отношений семеро.

Фото: Ведомости/PhotoXPress.ru, Instagram, Legion-Media

Флуоресцентно-резонансная микроскопия с переносом энергии (FRET) для визуализации локализации белков живых клеток

J Cell Biol. 2003 г., 3 марта; 160(5): 629–633.

В.М. Центр клеточной визуализации Кека, факультеты биологии и биомедицинской инженерии, Университет Вирджинии, Шарлоттсвилль, Вирджиния, 22904

Центр клеточной визуализации Кека, кафедра биологии, Гилмер-холл (064), Университет Вирджинии, Шарлоттсвилль, Вирджиния 22904.

Тел.: (434) 243-7602/(434) 982-4869. Факс: (434) 982-5210. Электронная почта: ude.ainigriv@t3pa

Поступила в редакцию 24 октября 2002 г .; Пересмотрено 21 января 2003 г .; Принято 21 января 2003 г.

Copyright © 2003, The Rockefeller University Press. Эта статья распространяется в соответствии с условиями лицензии «Атрибуция — некоммерческая — совместное использование — отсутствие зеркальных сайтов» в течение первых шести месяцев после даты публикации (см. http://www. rupress.org/terms). Через шесть месяцев он доступен под лицензией Creative Commons (Атрибуция — Некоммерческая — Share Alike 4.0 Неперенесенная лицензия, как описано на http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/). Эта статья цитировалась в других статьях PMC.

Abstract

Современные достижения флуоресцентной микроскопии в сочетании с разработкой новых флуоресцентных зондов делают флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) мощным методом изучения молекулярных взаимодействий внутри живых клеток с улучшенным пространственным (ангстремным) и временным (наносекундным) разрешением. , диапазон расстояний и чувствительность, а также более широкий спектр биологических приложений.

Ключевые слова: FRET-микроскопия; анализ данных; камелеоны; димеризация; Анализы FRET

Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) ^* представляет собой физический процесс, зависящий от расстояния, при котором энергия безызлучательно передается от возбужденного молекулярного флуорофора (донора) к другому флуорофору (акцептору) посредством межмолекулярного дальнодействия. диполь-дипольная связь. FRET может быть точным измерением молекулярной близости на ангстремных расстояниях (10–100 Å) и высокоэффективным, если донор и акцептор расположены в пределах радиуса Фёрстера (расстояние, на котором половина энергии возбуждения донора передается акцептору, обычно 3–6 нм).Эффективность FRET зависит от обратной шестой степени межмолекулярного разделения (Förster, 1965; Clegg, 1996; Lakowicz, 1999), что делает его чувствительным методом для исследования различных биологических явлений, вызывающих изменения в молекулярной близости (dos Remedios et al. др., 1987). Технологические достижения в области световой микроскопии в сочетании с доступностью генетически кодируемых флуоресцентных белков обеспечивают инструменты, необходимые для получения пространственного и временного распределения белковых ассоциаций внутри живых клеток (Heim and Tsien, 1996; Day, 1998; Elangovan et al., 2002, 2003).

Широко используемые донорные и акцепторные флуорофоры для исследований FRET происходят из класса аутофлуоресцентных белков, называемых GFP. Спектроскопические свойства, которые тщательно учитываются при выборе GFP в качестве пригодных для работы пар FRET, включают достаточное разделение в спектрах возбуждения для избирательной стимуляции донорного GFP, перекрытие (> 30%) между спектром излучения донора и спектром возбуждения акцептора для получить эффективную передачу энергии и разумное разделение в спектрах излучения между донорными и акцепторными GFP, чтобы обеспечить независимое измерение флуоресценции каждого флуорофора (Pollok and Heim, 1999). Методы визуализации FRET, основанные на GFP, сыграли важную роль в определении компартментализации и функциональной организации живых клеток и в отслеживании движения белков внутри клеток (Hanson and Kohler, 2001).

В этой статье мы даем краткое описание методов микроскопической визуализации FRET и анализа данных. Кроме того, обсуждаются важные биологические применения FRET-микроскопии, такие как исследования взаимодействия белков, передача сигналов Ca ²⁺, исследования нуклеиновых кислот, характеристика экспрессии генов и анализы ПЦР в реальном времени.

Доступны дополнительные материалы

Дополнительные технические сведения о различных методах визуализации FRET на основе интенсивности и времени жизни флуоресценции доступны в Интернете по адресу http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200210140/DC1. Также включено обсуждение успехов других методов FRET-микроскопии.

Визуализирующая микроскопия FRET

В то время как световая микроскопия положила начало нашему пониманию клеточной структуры и связанных с ней функций, молекулярно-биологические исследования за последние несколько десятилетий показали, что клеточные процессы, такие как передача сигнала и транскрипция генов, требуют сборки белков в определенные макромолекулярные комплексы. Традиционные биофизические или биохимические методы не давали прямого доступа к взаимодействиям этих белков-партнеров в их естественной среде. Впоследствии были разработаны основанные на интенсивности методы визуализации с применением метода FRET-микроскопии (широкопольная, конфокальная и многофотонная [MP]), что облегчило изучение этих взаимодействий внутри интактных живых клеток (Periasamy, 2001). Новые технологии визуализации в сочетании с разработкой новых генетически кодируемых флуоресцентных меток и датчиков, а также растущими возможностями компьютерного программного обеспечения для получения и анализа изображений позволили провести более сложные исследования функций и процессов белков, начиная от экспрессии генов и заканчивая каскадами вторичных мессенджеров и межклеточными процессами. сигнализация (Roessel and Brand, 2002).

FRET-микроскопия основана на способности улавливать флуоресцентные сигналы от взаимодействия меченых молекул в одиночных живых или фиксированных клетках. Если происходит FRET, сигнал донорного канала подавляется, а сигнал акцепторного канала становится чувствительным или усиливается (Herman, 1998). С помощью микроскопии FRET можно увидеть не только совместную локализацию донорно- и акцепторно-меченых зондов в пределах ∼0,09 мкм ², но также можно проверить молекулярные ассоциации на близких расстояниях.

Существует несколько методов FRET-микроскопии, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.Они используются для различных биологических приложений, включая изучение структуры органелл, конъюгированных антител, цитохимической идентификации и окислительного метаболизма (www.cyto.purdue.edu). Широкопольная микроскопия — самый простой и широко используемый метод. Он используется для количественного сравнения клеточных компартментов и покадровых исследований подвижности клеток, внутриклеточной механики и молекулярного движения (www.api.com). Например, новые флуоресцентные индикаторы позволили измерить сигналы Ca ²⁺ в цитозоле и органеллах, которые часто чрезвычайно локализованы (Miyawaki et al. , 1997) и неразрушающей визуализации динамической активности протеинтирозинкиназы в отдельных живых клетках (Ting et al., 2001). Однако широкопольная микроскопия имеет существенный недостаток из-за генерации сигналов вне фокуса. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и микроскопия MP-FRET обеспечивают преимущество в отбрасывании информации, находящейся не в фокусе. Они также позволяют локализовать ассоциации, происходящие внутри клетки, в трех измерениях. Конфокальное изображение FRET () , с улучшенным поперечным разрешением, дает большое количество спектральной информации с рядом преимуществ по сравнению с широкопольным изображением, включая управляемую глубину резкости и возможность собирать серийные оптические срезы толстых образцов.Благодаря нанометровому разрешению по глубине и неинтрузивности конфокальный FRET обеспечивает новый подход к измерению вязкоупругости и биохимических реакций живых клеток, а также к мониторингу в реальном времени движения клеточных мембран в естественных условиях (неопубликованные данные). Однако конфокальная микроскопия ограничена стандартными лазерными линиями определенной длины волны. Микроскопия MP-FRET преодолевает это ограничение за счет использования перестраиваемого лазера (диапазон 700–1000 нм), что позволяет возбуждать широкий спектр флуорофоров с более высоким осевым разрешением, большей проникающей способностью образца, уменьшенным фотообесцвечиванием маркерных красителей и повышенной жизнеспособностью клеток.Эти преимущества позволяют проводить исследования на толстых образцах живых тканей, которые в противном случае были бы невозможны с помощью обычных методов. Тем не менее, все эти методы FRET, основанные на интенсивности, требуют программного обеспечения для удаления нежелательных компонентов просачивания в изображении FRET. .

Конфокальный FRET-анализ демонстрирует, что интегрины индуцируют локальную Rac-эффекторную связь. В клетки NIH-3T3 микроинъецировали кДНК, кодирующие указанные слитые белки GFP-V12-Rac, а затем белок Alexa-PBD (Pozo et al. , 2002). Показаны изображения донора (A), нескорректированного FRET (B) и скорректированного FRET (C). На цветовой шкале красный цвет соответствует высокому уровню сигнала FRET, а синий — низкому.

Локализация белков CFP- и YFP-C/EBP α , экспрессированных в клетках гипофиза GHFT1-5 живых мышей, изученных с помощью микроскопии MP-FRET Bio-Rad Laboratories. Донорское (A), нескорректированное FRET (B) и обработанное FRET (C) изображения и их соответствующие гистограммы (D, E и F), представляющие силу сигнала выбранного белка (Elangovan et al., 2003).

Другие методы визуализации FRET.

Временное разрешение методов визуализации может быть достигнуто с помощью метода визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM). Этот метод отслеживает локальные изменения времени жизни флуоресценции зонда и обеспечивает огромное преимущество для визуализации динамических событий в живых клетках. В сочетании с FRET этот подход дает прямые доказательства физических взаимодействий между двумя или более белками с очень высоким пространственным и временным разрешением (Bastiaens and Squire, 1999; Elangovan et al. , 2002). Корреляционная спектроскопия флуоресценции (FCS) (www.probes.com), в которой спонтанные флуктуации интенсивности флуоресценции измеряются в микроскопическом объеме обнаружения, значительно увеличила полезность и область применения FRET. FRAP, основанный на принципе наблюдения скорости восстановления флуоресценции за счет перемещения флуоресцентного маркера в область мембраны, широко используется для оценки структуры биологических мембран и измерения латеральной диффузии различных мембранных или цитоплазматических составляющие.Родственный метод, потеря флуоресценции при фотообесцвечивании (FLIP), может определить, происходит ли поток между двумя отсеками или нет. FRAP и FLIP ценны для изучения транспорта Golgi/ER в клетках животных (Cole et al., 1996). С развитием новых модальностей FRET, таких как гомоперенос или миграция энергии FRET, фотохромный FRET (Giordano et al., 2002), биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) (www.lifesciences.perkinelmer.com) и новый класс люминофоров, называемые длинноволновыми люминофорами с большим квантовым выходом и длительным сроком службы, будущее FRET светлое. Более конкретно, будущие биологические приложения микроскопии изображений FRET могут включать клеточные события, связанные со специфическими молекулярными сигнальными процессами, и одновременное наблюдение ряда обратимых молекулярных процессов в живых клетках (Truong and Ikura, 2001).

Анализ данных FRET

Микроскопия FRET на основе интенсивности имеет ряд недостатков, включая аутофлуоресценцию, шум детектора, оптический шум и фотообесцвечивание. Кроме того, серьезной проблемой является спектральное просачивание (SBT) или вклад донорной и акцепторной флуоресценции в канал FRET.Из-за этих эффектов наблюдаемый сигнал FRET выше фактического сигнала. Для решения этих проблем были разработаны различные методы анализа данных FRET для широкопольной микроскопии (Гордон и др., 1998; Крайнов и др., 2000; Ся и Лю, 2001). Эти методы корректируют SBT и зависимость FRET от концентраций доноров и акцепторов.

Недавно был разработан новый алгоритм, который устраняет проблемы SBT как донора, так и акцептора, а также корректирует различия в уровне экспрессии флуорофора для всех методов FRET, основанных на интенсивности (широкое поле, конфокальный и MP), для расчета эффективности FRET (в процентах). ) и оценить расстояние (в ангстремах) между молекулами донора и акцептора в клетке с двойной меткой.Поправки на уровень экспрессии как SBT, так и флуорофора включены в математические расчеты (Elangovan et al., 2003). Из собранных данных компонент просачивания оценивается на основе отдельных образцов донора и акцептора, а затем исключается из данных FRET, пиксель за пикселем, чтобы получить истинный (или прецизионный) сигнал FRET ().

Применение FRET в клеточной биологии

Визуализация FRET с использованием спектральных мутантов GFP позволяет локализовать и контролировать связывание ионов и межбелковые взаимодействия в живых клетках.Например, FRET-микроскопия с парой CFP/YFP FRET позволяет обнаруживать прямые межмолекулярные взаимодействия интегринов in vivo. Интегрины являются важными трансмембранными рецепторными белками, участвующими в клеточной передаче сигналов и адгезии. Исследования активации и локализации Rac на основе FRET показали, что интегрины индуцируют локальное взаимодействие Rac-эффектор, направляя Rac к мембранам и отделяя его от Rho-GDI (ингибиторы диссоциации гуаниновых нуклеотидов), а также что, несмотря на его гомогенное распределение в клетке, конститутивно активный Rac избирательно взаимодействует с эффекторами в определенных областях клеточного края (Pozo et al. , 2002) ().

Начало и прекращение передачи сигналов Ca ²⁺ в определенных клеточных компартментах, таких как цитоплазма, ядро или эндоплазматический ретикулум, можно наблюдать, измеряя изменение соотношения интенсивностей флуоресценции акцепторных и донорных молекул в живых клетках (Truong и др., 2001). Cameleons, класс флуоресцентных индикаторов Ca ²⁺ на основе GFP и кальмодулина (CAM), являются полезными инструментами для измерения концентраций свободного Ca ²⁺ в живых клетках.Традиционный желтый камелеон состоит из слияния CFP, CAM, CAM-связывающего пептида киназы легкой цепи миозина (MLCKp) и YFP. С увеличением количества свободного Ca ²⁺ в растворе САМ-модуль камелеона связывает Ca ²⁺ и оборачивается вокруг слитого MLCKp. Это конформационное изменение уменьшает расстояние между CFP и YFP. Поскольку FRET зависит как от близости донорных и акцепторных флуорофоров, так и от ориентации их относительных диполей, взаимодействие камелеонов с Ca ²⁺ приводит к изменению степени FRET между CFP и YFP. После калибровки ответа FRET на известные концентрации Ca ²⁺ степень FRET in vivo теоретически может отражать абсолютные уровни Ca ²⁺, присутствующие в клеточных компартментах.

Помимо внутриклеточного восприятия ионов, конструкции FRET использовались для исследования нижестоящих событий передачи сигналов вторичных мессенджеров (Adams et al., 1991). Для нацеливания на сигнальный путь цАМФ была разработана сенсорная конструкция, в которой индуцируемый киназой домен белка, связывающего цАМФ-чувствительный элемент, образует линкер между синим флуоресцентным белком и GFP.Известно, что цАМФ-индуцированное РКА-зависимое фосфорилирование вызывает конформационные изменения в киназо-индуцируемом домене, и эффективность FRET изменяется в ответ на передачу сигналов цАМФ.

FRET устанавливает возможность изучения в локализованном пространственном масштабе взаимодействий между парой рецептор-лиганд, димеризации отдельных рецепторов, а также трансбислойного распределения флуоресцентных аналогов липидов и белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. Изменения эффективности FRET, вызванные жирными кислотами, фосфолипидами и холестерином, привели к идентификации дискретных сайтов связывания липидов на мембраносвязанном белке никотинового ацетилхолинового рецептора (www.kenes.com/cholinergic). FRET используется для обнаружения димеризации рецептора EGF (EGFR) и его конформационного состояния (Gadella and Jovin, 1995). Флуоресцентно меченные молекулы EGF с донором флуоресцеина и акцептором родамина позволяли связывать EGFR, присутствующий на клетках. Степень олигомеризации рецепторов контролировали по эффективности FRET с пространственным разрешением в зависимости от соотношения донор/акцептор и условий лечения. Увеличение средней эффективности FRET указывало на минимальную димеризацию рецепторов для субпопуляции высокоаффинных рецепторов.Эти результаты доказывают, что связывание EGF приводит к быстрой и зависящей от температуры микрокластеризации EGFR, который присутствует в предварительно димеризованном или олигомеризованном состоянии.

FRET также используется для изучения структуры, конформации, гибридизации и автоматического секвенирования нуклеиновых кислот. Хромосомный FISH, основанный на гибридизации фрагмента нуклеиновой кислоты с его комплементом, стал чрезвычайно важным для картирования генов, идентификации мутаций, клинической диагностики и изучения хромосомной и ядерной архитектуры.Для обнаружения мутаций и высокопроизводительного анализа генома был разработан диагностический анализ гомогенной ДНК, основанный на направленном на матрицу удлинении праймера, обнаруженном с помощью FRET, названный направленным на матрицу анализом включения красителя-терминатора (Chen et al., 1997).

Более современный подход к характеристике экспрессии генов включает использование «флуоресцентного таймера», мутанта флуоресцентного белка dsRed, который со временем меняет цвет с зеленого на красный. Зеленая флуоресценция указывает на недавно транслированный белок, который в течение нескольких часов подвергается кислородзависимой автокаталитической реакции с образованием красной флуоресценции, обозначающей созревший белок. Поскольку белок-таймер переключает флуоресценцию с течением времени, его можно использовать в качестве таймера для экспрессии генов. Таким образом, ткань указывает на историю своего флуоресцентного таймера по соотношению зеленой и красной флуоресценции; ткани, которые недавно инициировали экспрессию гена, выглядят зелеными, ткани с непрерывной экспрессией — от желтого до оранжевого, а те, экспрессия которых прекратилась, — полностью красными.

FRET также находит широкое применение в анализах слияния мембран и ПЦР в реальном времени. В анализах смешения липидов, основанных на переносе энергии NBD-родамина (Struck et al., 1981), мембраны, меченные комбинацией FRET-донорных и акцепторных липидных зондов, смешивают с немечеными мембранами. FRET уменьшается, когда среднее пространственное разделение зондов увеличивается при слиянии меченых мембран с немечеными мембранами. В ПЦР в реальном времени отслеживают количество испускаемой флуоресценции в каждом цикле как показатель продукции ампликона. Флуоресцентный мониторинг ПЦР для обнаружения и количественного определения стал стандартным методом со многими приложениями, включая анализ экспрессии и обнаружение патогенов.

Иммуноанализы FRET, включающие меченый на конце фосфопептид Cy5 NH ₂, который распознается первичным мышиным антителом против фосфотирозина, за которым следует меченное Cy3 вторичное антитело, полезны для измерения специфических взаимодействий антитело-антиген. FRET возникает, когда компоненты последовательно связаны друг с другом, и возбуждение на длинах волн Cy3 приводит к излучению на длинах волн Cy5. Нарушение взаимодействия между фосфопептидом и первичным антителом приведет к уменьшению наблюдаемого сигнала FRET.FRET также используется при разработке и синтезе субстратов флуорогенных ферментов на основе FRET, полезных для мониторинга ферментативной активности.

Заключение

Биология, визуализация и спектроскопия недавно были объединены, чтобы предоставить мощные инструменты для исследований и клинических приложений. Методы FRET и флуоресцентные реагенты, такие как GFP, которые широко используются для исследования присутствия и активности генов, клеточных компонентов и метаболических или сигнальных путей, могут стать более мощными и гибкими при использовании инструментов мультиспектральной визуализации.Спектральная визуализация начала улучшать методы хромосомного анализа и генотипирования благодаря легкому и точному обнаружению хромосомных перестроек, связанных с раком и генетическими аномалиями. Методы оптической биопсии используют спектроскопическую информацию, присутствующую во внутренних или экзогенных хромофорах и флуорофорах, для дифференциации опухолей и дисплазий от нормальных тканей. Потенциальные приложения для FRET-визуализации тканей также расширяются. Благодаря последним достижениям в области флуоресцентных зондов, инструментов и методологий FRET, несомненно, произведет революцию в научных исследованиях в ближайшем будущем.

Дополнительные материалы

[Указатель дополнительных материалов]

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Drs. Ричарду Дэю и Мартину Шварцу за полезные обсуждения. Мы благодарим Колтена Ноукса и г-жу Йе Чен за их квалифицированную помощь.

Работа выполнена при поддержке W.M. Фонд Кека.

Примечания

Электронная версия этой статьи содержит дополнительные материалы.

Сноски

^* Сокращения, используемые в данной статье: CAM, кальмодулин; EGFR, рецептор EGF; FRET — резонансный перенос энергии флуоресценции; МП, мультифотон; SBT, спектральное просачивание.

Ссылки

Адамс С.Р., А.Т. Харотунян, Ю.Дж. Бюхлер, С.С. Тейлор и Р.Ю. Циен. 1991. Визуализация коэффициента флуоресценции циклического АМФ в одиночных клетках. Природа. 349: 694–697. [PubMed] [Google Scholar]
Бастианс, П.И., и А. Сквайр. 1999. Микроскопия времени жизни флуоресценции: пространственное разрешение биохимических процессов в клетке. Тенденции клеточной биологии. 9:48–52. [PubMed] [Google Scholar]
Chen, X., B. Zehnbauer, A. Gnirke, and P. Y. квок. 1997.Обнаружение переноса энергии флуоресценции как метод диагностики гомогенной ДНК. проц. Натл. акад. науч. США. 94:10756–10761. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Clegg, R.M. 1996. Резонансный перенос энергии флуоресценции. Флуоресцентная визуализирующая спектроскопия и микроскопия. Том. 137. Х.Ф. Ван и Б. Герман, редакторы. John Wiley & Sons Inc., Нью-Йорк. 179–251.
Коул, Н.Б., К.Л. Смит, Н. Скиаки, М. Терасаки, М. Эдидин и Дж. Л. Шварц. 1996. Диффузионная подвижность белков Гольджи в мембранах живых клеток.Наука. 273: 797–801. [PubMed] [Google Scholar]
Day, R.N. 1998. Визуализация взаимодействия фактора транскрипции Pit-1 в ядре живой клетки с помощью флуоресцентной резонансной микроскопии с переносом энергии. Мол. Эндокринол. 12:1410–1419. [PubMed] [Google Scholar]
душ Ремедиос, К.Г., М. Мики и Дж.А. Барден. 1987. Измерения переноса энергии флуоресцентного резонанса на расстояния в актине и миозине: критическая оценка. Дж. Мускул Рез. Селл Мотил. 8:97–117. [PubMed] [Google Scholar]
Элангован, М., Р.Н. Дэй и А. Периасами. 2002. Наносекундная флуоресцентная резонансная флуоресцентная микроскопия с переносом энергии и флуоресцентной визуализацией для локализации белковых взаимодействий в одной живой клетке. Дж. Микроск. 205:3–14. [PubMed] [Google Scholar]
Элангован М., Х. Валлрабе, Ю. Чен, Р.Н. Дэй, М. Баррозу и А. Периасами. 2003. Характеристика одно- и двухфотонного возбуждения флуоресцентной резонансной микроскопии переноса энергии. Методы. 29:58–73. [PubMed] [Google Scholar]
Фёрстер, Т.1965. Делокализованное возбуждение и передача возбуждения. Современная квантовая химия. Том. 3. Синаноглу О., редактор. Academic Press Inc., Нью-Йорк. 93–137.
Гаделла, Т.В.Дж., младший, и Т.М. Джовин. 1995. Олигомеризация рецепторов эпидермального фактора роста на клетках A431 изучалась с помощью флуоресцентной микроскопии с временным разрешением. Стереохимическая модель активации рецептора тирозинкиназы. Дж. Клеточная биология. 129: 1543–1548. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Джордано, Л., Т.М.Джовин, М. Ири и Э.А. Джарес-Эриджман. 2002. Дигетероарилетены как термостабильные фотопереключаемые акцепторы в фотохромной флуоресцентной резонансной передаче энергии (pcFRET). Варенье. хим. соц. 124:7481–7489. [PubMed] [Google Scholar]
Gordon, G.W., G. Berry, X.H. Лян, Б. Левин и Б. Герман. 1998. Количественные измерения передачи энергии флуоресцентного резонанса с использованием флуоресцентной микроскопии. Биофиз. Дж. 74:2702–2713. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Hanson, M.Р. и Р. Х. Колер. 2001. Визуализация GFP: методология и применение для исследования клеточных компартментов у растений. Дж. Эксп. Бот. 52:529–539. [PubMed] [Google Scholar]
Хейм Р. и Р.Ю. Циен. 1996. Разработка зеленого флуоресцентного белка для улучшения яркости, увеличения длины волны и передачи резонансной энергии флуоресценции. Курс. биол. 6: 178–182. [PubMed] [Google Scholar]
Herman, B. 1998. Флуоресцентная микроскопия. 2-е изд. Springer-Verlag New York Inc., Нью-Йорк. 170 стр.
Крайнов В.С., Чемберлен К., Г.М. Бокох, М.А. Шварц, С. Слабо и К.М. Хан. 2000. Локализованная динамика активации Rac, визуализированная в живых клетках. Наука. 290:333–337. [PubMed] [Google Scholar]
Lakowicz, JR 1999. Принципы флуоресцентной спектроскопии. 2-е изд. Plenum Publishing Corp., Нью-Йорк. 692 стр.
Мияваки, А., Дж. Ллопис, Р. Хейм, Дж. М. МакКаффери, Дж. А. Адамс, М. Икура и Р.Ю. Циен. 1997. Флуоресцентные индикаторы для Ca ²⁺ на основе зеленых флуоресцентных белков и кальмодулина.Природа. 388: 882–887. [PubMed] [Google Scholar]
Периасами, А. 2001. Методы клеточной визуализации. Издательство Оксфордского университета, Нью-Йорк. 434 стр.
Поллок, Б.А., и Р. Хейм. 1999. Использование GFP в приложениях на основе FRET. Тенденции клеточной биологии. 9:57–60. [PubMed] [Google Scholar]
Pozo, M. A.D., W.B. Киоссес, Н.Б. Алдерсон, Н. Меллер, К.М. Хан и М.А. Шварц. 2002. Интегрины регулируют локализованные эффекторные взаимодействия GTP-Rac посредством диссоциации Rho-GDI. Нац. Клеточная биол.4: 232–239. [PubMed] [Google Scholar]
Roessel, PV, and AH Brand. 2002. Визуализация в будущее: визуализация экспрессии генов и взаимодействия белков с флуоресцентными белками. Нац. Клеточная биол. 4: Е15–Е20. [PubMed] [Google Scholar]
Struck, D.K., D. Hoekstra, and R.E. Пагано. 1981. Использование резонансной передачи энергии для мониторинга слияния мембран. Биохимия. 20:4093–4099. [PubMed] [Google Scholar]
Труонг К. и М. Икура. 2001. Использование микроскопии визуализации FRET для обнаружения межбелковых взаимодействий и конформационных изменений белков in vivo.Курс. мнение Структура биол. 11: 573–578. [PubMed] [Google Scholar]
Truong, K., A. Sawano, H. Mizuno, H. Hama, K. Tong, T.K. Мал, А. Мияваки и М. Икура. 2001. На основе FRET визуализация in vivo Ca ²⁺ с помощью новой слитой молекулы кальмодулин-GFP. Нац. Структура биол. 8:1069–1073. [PubMed] [Google Scholar]
Тинг, А.Ю., К.Х. Каин, Р.Л. Клемке и Р.Ю. Циен. 2001. Генетически закодированные флуоресцентные репортеры активности протеинтирозинкиназы в живых клетках.проц. Натл. акад. науч. США. 98:15003–15008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
Xia, Z., and Y. Liu. 2001. Надежное и глобальное измерение переноса энергии резонанса флуоресценции с использованием флуоресцентных микроскопов. Биофиз. Дж. 81:2395–2402. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Резонансный перенос энергии флуоресценции — Химия LibreTexts

Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) — это специальный метод измерения расстояния между двумя хромофорами, называемый донорно-акцепторным. пара.Ограничение FRET состоит в том, что этот процесс переноса эффективен только тогда, когда разделяющее расстояние пары донор-акцептор меньше 10 нанометров. Однако FRET — это явление, сильно зависящее от расстояния, и поэтому оно стало популярным инструментом для измерения динамической активности биологических молекул в наномасштабе.

Введение

FRET — это аббревиатура от Förster (флуоресцентная) резонансная передача энергии. Перенос энергии Фёрстера — это явление, при котором возбужденный донор передает энергию (не электрон) группе акцептора посредством безызлучательного процесса.Этот процесс сильно зависит от расстояния, что позволяет исследовать биологические структуры. Одним из распространенных применений является простое измерение расстояния между двумя интересующими позициями на большой молекуле, обычно биологической макромолекуле, путем присоединения соответствующих донорно-акцепторных групп к большой молекуле. Если большая молекула включает только одну донорную и одну акцепторную группу, расстояние между донором и акцептором можно легко измерить, если в этом процессе не происходит конформационного изменения.Кроме того, если молекула имеет огромное конформационное изменение, можно также измерить динамическую активность между двумя участками этой макромолекулы, например, белковые взаимодействия. Сегодня этот метод широко применяется во многих областях, таких как эксперименты с одиночными молекулами, молекулярные моторы, биосенсоры и механические движения ДНК. FRET также называют «спектроскопической линейкой» из-за его внутреннего удобства.

Теоретический анализ был хорошо разработан Теодором Фёрстером. Этот безызлучательный механизм переноса схематично показан на рисунке \(\PageIndex{1}\).Донорная группа (D) возбуждается фотоном, а затем релаксирует в низшее возбужденное синглетное состояние S ₁ (по правилу Каши). Если акцепторная группа не слишком далеко, энергия, высвобождаемая при возвращении электрона в основное состояние (S ₀ ), может одновременно возбудить донорную группу. Этот безызлучательный процесс называется «резонансом». После возбуждения возбужденный акцептор испускает фотон и возвращается в основное состояние, если других гасящих состояний не существует.

Рисунок \(\PageIndex{1}\): Схематическая диаграмма резонансной передачи энергии Фёрстера.

(CC BY; LibreTexts)

Резонансный механизм связан с кулоновским взаимодействием между электронами. Таким образом, относительное расстояние кулоновского взаимодействия между донорно-акцепторной парой может быть больше, чем передача энергии электронного обмена, которая требует перекрытия волновых функций, а именно передача энергии Декстера. Кулоновское взаимодействие нуждается только в перекрытии спектра, что означает идентичность энергии резонанса. Рисунок \(\PageIndex{2}\) здесь должен дать представление о механизме резонанса.(Обратите внимание, что щель HOMO-LUMO не равна разности энергий между основным состоянием и нижним S ₁ возбужденным состоянием молекулы.)

Рисунок \(\PageIndex{2}\): Схематическая диаграмма кулоновских взаимодействий. (CC BY; LibreTexts)

Факторы, влияющие на FRET

Эффективность FRET (\(E\)) — квантовый выход перехода с переносом энергии; т. е. доля событий переноса энергии, происходящих на одно событие возбуждения донора. Эффективность FRET определяется как

\[\ E = \dfrac{k_{ET}}{k_f + k_{ET}+\sum k_i} \label{1}\]

, где \(k_{ET}\) – скорость FRET, \(k_f\) – скорость радиационной релаксации (т.6} \метка{2}\]

, где \(r\) — расстояние между донорными и акцепторными хромофорами, а \(R_o\) — характерное расстояние (расстояние Фёрстера или радиус Фёрстера) с эффективностью переноса 50%.

Перекрытие спектра

Для повышения эффективности FRET группа доноров должна иметь хорошие способности поглощать фотоны и излучать фотоны. Это означает, что донорная группа должна иметь высокий коэффициент экстинкции и высокий квантовый выход. Перекрытие спектра излучения донора и спектра поглощения акцептора означает, что энергия, теряемая из возбужденного донора в основное состояние, может возбудить группу акцептора.4 \,d\лямбда \метка{3}\]

, где \(F_D(λ)\) — нормированный спектр излучения донора, \(\epsilon_{A}\) стандарты молярного коэффициента поглощения акцептора, а \(λ\) — длина волны.

Рисунок \(\PageIndex{3}\): Схема спектрального перекрытия.

(CC BY; LibreTexts)

Ориентация переходных диполей

На механизм резонансной передачи энергии также влияет ориентация диполя эмиссионного перехода донора и диполя поглощения акцептора.{-4} \метка{4}\]

Таблица \(\PageIndex{1}\): расстояния Фёрстера для различных пар донор-акцептор. Сокращения: БФЭ, В-фикоэритрин; CY5, карбоксиметилиндоцианин; дансил, просто дансильная группа; EM, малеимид эозина; FITC, флуорцеин-5-изотиоцианат; LY, люцифер желтый; ODR, октадецилродамин; ТНП-АТФ, тринитрофенил-АТФ.
Донор	Акцептор	Расстояние Ферстера (\(R_0\), нм)
Нафталин	Дансил	2.2
ЛЕ	ТНП-АТП	3,5
Дансил	ОДР	4,3
ЛЕ	ЭМ	5,3
ФИТЦ	ЭМ	6,0
БПЭ	CY5	7. 2

Заключение и ограничения FRET

FRET обеспечивает эффективный способ измерения расстояния между донорным и акцепторным хромофором. На эффективность передачи энергии сильно влияет соотношение \(R\) и \(R_0\) из-за показателя степени 6. Таким образом, измеряя эффективность FRET, можно легко получить точное расстояние между донором и акцептором. При правильном выборе донора и акцептора этот эксперимент также можно провести in vivo .Однако FRET дает информацию только о расстояниях. Если происходит резкое конформационное изменение, такое как удлинение или перегиб, он не может знать точное движение донора и акцептора. Кроме того, важно также прикрепление хромофоров к точным участкам макромолекулы, как по количеству хромофоров, так и по положению макромолекулы, иначе FRET может давать шумовые сигналы. (см. вопрос 5)

Упражнение \(\PageIndex{1}\)

Филамент F-актина состоит из мономеров G-актина.Присоединив донорный (D) или акцепторный (A) хромофор к мономеру G-актина и измерив эффективность переноса энергии, можно измерить среднее расстояние между мономерами G-актина в пленке F-актина (при условии, что мономеры хорошо расположены в последовательности ДАДАДАДА. …), и можно обнаружить, что средняя эффективность передачи энергии составляет 23%. Если \(R_0\) равно 4,5 нм, каково среднее расстояние между мономерами в нити?

Ответить: 5.5 нм.

Упражнение \(\PageIndex{2}\)

Основываясь на вопросе 1, если последовательность нити состоит из 8 мономеров в порядке DADADADA, сколько видов эффективности можно обнаружить, если нить не изгибается и \(R_0\) достаточно велик, чтобы увидеть все их?

Ответить: Будет обнаружено 4 вида эффективности.

Упражнение \(\PageIndex{3}\)

Пара cy3-дорнор и cy5-акцептор прикрепляются к концам последовательности ДНК.Если пренебречь ориентацией переходных диполей донора и акцептора, нарисуйте зависимость между отношением (\(R/R_0\)) и эффективностью передачи энергии.

Ответить: Пожалуйста, посетите веб-сайт профессора Тэкджип Ха. https://netfiles.uiuc.edu/tjha/www/newTechnique.html

Упражнение \(\PageIndex{4}\)

Используйте пример из вопроса 3, а теперь рассмотрите ориентацию переходных диполей.Пожалуйста, постройте зависимость между разделяющим расстоянием пары донор-акцептор и эффективностью передачи энергии. (Помните, что при удлинении ДНК путем добавления пар оснований ориентация донорных и акцепторных хромофоров изменится) (Вопросы 3 и 4 переработаны из статьи, в которой измерялась ориентационная зависимость в процессе FRET с использованием спирали ДНК.

Ответить: См. PNAS, август 2008 г., 105(32), 11176-11181, doi:10.1073/пнас.0801707105

Упражнение \(\PageIndex{5}\)

Одной из самых сложных проблем в области ионных каналов является наблюдение за тем, как канал работает in vivo и конформационным изменением канала, встроенного в клеточную мембрану. Если ученый хочет исследовать движение ворот ионного канала с помощью FRET, какие факторы следует учитывать? Например, как правильно прикрепить донора и акцептора к точным положениям ворот канала.

Ответить: Открытый вопрос. Пожалуйста, обратитесь к этому вводному документу об использовании FRET для исследования движения ионных каналов. Биофизический журнал, январь 2003 г., 84(1), 1-2, doi:10.1016/S0006-3495(03)74827-9

Сноски

PNAS, 2006 Dec., 103(49), 18458-18463, doi: 10.1073/pnas.0605422103
PNAS, ноябрь 2008 г., 105(47), 18337-18342, doi: 10.1073/pnas.0800977105
Nature Biotechnology 2003, 21, 1387-1395, doi:10.1038/nbt896
PNAS, 2009 Oct., 106(42), 17741-17746, doi: 10.1073/pnas.07106
Природа, 1997 авг., 388, 882-887
PNAS, 2006 Dec., 103(51) 19217-19218, doi: 10.1073/pnas.0609223103
PNAS, август 1967 г., 58(2), 719-26. doi:10.1073/pnas.58.2.719
Analytical Biochemistry, 1994 Apr., 218(1), 1-13, doi:10.1006/abio.1994.1134
Nature Protocols, 1 августа 2006 г. , 911–919, doi:10.1038/nprot.2006.122
PNAS, август 2008 г., 105(32), 11176-11181, doi:10.1073/пнас.0801707105
Биофизический журнал, январь 2003 г., 84(1), 1-2, doi:10.1016/S0006-3495(03)74827-9

Резонансный перенос энергии флуоресценции – обзор

2.1 Разработка зонда FRET для мониторинга активации каспаз

Технология FRET может предоставить ценную информацию о динамике и характере активности фермента. Ранние зонды FRET для активации каспазы использовали гибридный белок, то есть белок с усиленной голубой флуоресценцией (ECFP) в качестве донора FRET и белок с усиленной желтой флуоресценцией (EYFP) в качестве акцептора FRET, связанные пептидами, содержащими расщепление каспазы-3. последовательность, DEVD (Luo, Yu, Pu, & Chang, 2001; Rehm et al., 2002; Тиас и др., 2000). Наиболее важной характеристикой зонда FRET является специфичность к молекуле-мишени. Молярный коэффициент экстинкции акцепторного белка является важным фактором для определения эффективности FRET; однако молярный коэффициент экстинкции EYFP, обычного флуоресцентного белка в акцепторах FRET, демонстрирует высокую чувствительность к протонам и ионам хлора, особенно в физиологических условиях (Jayaraman, Haggie, Wachter, Remington, & Verkman, 2000; Llopis, McCaffery, Miyawaki, Фаркуар и Цзянь, 1998). В нескольких сообщениях предполагается, что подкисление происходит во время апоптоза (Matsuyama, Llopis, Deveraux, Tsien, & Reed, 2000; Perez-Sala, Collado-Escobar, & Mollinedo, 1995; Vincent, TenBroeke, & Maiese, 1999) и что хлорид/ бикарбонатный обменник участвует в апоптотических событиях (Araki et al., 2002; Maeno, Ishizaki, Kanaseki, Hazama, & Okada, 2000). Поскольку изменение концентрации хлорида также происходит в нейронах, было бы крайне важно использовать нечувствительный к хлориду индикатор для мониторинга активации каспазы в нейронах.Из-за этих особенностей исследователи должны с осторожностью использовать EYFP в качестве рецептора FRET, особенно для визуализации апоптоза in vivo .

Чтобы преодолеть эти ограничения, Венера была использована в качестве акцептора FRET в зонде SCAT3 (рис. 12.1; Takemoto et al., 2003), поскольку она демонстрирует низкую чувствительность к протонам и ионам хлора (Nagai et al., 2002). Действительно, SCAT3 показал высокую стабильность in vitro и в живых клетках по сравнению с ранее описанным зондом ECFP-EYFP (Takemoto et al. , 2003). Разработка индикаторов SCAT3 позволила исследователям отслеживать активацию каспазы в живых клетках и в естественных условиях в режиме реального времени (Campbell & Okamoto, 2013; Koto, Kuranaga, & Miura, 2009; Kuranaga et al., 2011; Nakajima, Kuranaga, Sugimura, Miyawaki, & Miura, 2011; Ohgushi et al., 2010; Takemoto et al., 2007; Yamaguchi et al., 2011).

FRET — Основной центр проточной цитометрии

Флуоресцентный резонансный перенос энергии или FRET можно использовать, чтобы показать, что молекулы находятся в пределах 10 нм друг от друга по характеру передачи энергии через механизм диполь-дипольной связи на большие расстояния.Молекула флуоресцентного донора возбуждается источником света, энергия безызлучательно передается молекуле-акцептору, см. рисунок Принципы FRET.

Эффективность этой передачи энергии зависит от расстояния между акцептором и донором, степени спектрального перекрытия между спектрами излучения донора и спектра поглощения акцептора и относительной параллельной ориентации диполей донора и акцептора. Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Форстера (Ro).Величина радиуса Форстера для каждого флуорофора также зависит от относительного квантового выхода флуорофора.

Пары ладов

Таким образом, выбор флуорофоров для эксперимента FRET или пар FRET донорных и акцепторных молекул важен, учитывая диапазон спектральных свойств флуорофоров. Первоначально FITC и TRITC использовались как пары FRET. Совсем недавно красители Cy использовались в качестве пар FRET 90–178 e.г. Cy2-Cy3 или Cy3-Cy5. Красители Alexa Fluor также действуют как пары FRET , например. Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 546. Флуоресцентные белки, такие как CFP-YFP, GFP-YFP и GFP-mRFP, также действуют как пары FRET, см. таблицу для получения более подробной информации.

Обнаружение БрДУ на основе FRET

FRET можно использовать для измерения включения BrdU с помощью красителей ДНК PI и ToPro-3.

Генные репортерные системы на основе FRET

В репортерной системе генов, разработанной Invitrogen, используются флуоресцентные субстраты на основе FRET, CCF2 и CCF4.

FRET на основе флуоресцентного белка

Флуоресцентные белки (FP) также можно использовать для обнаружения белковых взаимодействий или биологических процессов, таких как фосфорилирование. Наиболее часто используемыми парами FRET FP являются CFP-YFP, но GFP-YFP и GFP с DsRED, mRFP или RFP также могут использоваться для обнаружения FRET методом проточной цитометрии. Развитие генной трансфекции для отдельных белков, экспрессирующих CFP и YFP на концевых концах белка, позволяет FRET происходить, когда белок претерпевает конформационные изменения под действием определенного биологического процесса 90–178 e.г. фосфорилирование. CFP-YFP FRET может быть обнаружен с помощью анализатора LSR II Core Facilities и сортировщика клеток Aria, позволяющего сортировать клетки, экспрессирующие FRET.

Сортировка ЛАД

Клетки, трансфицированные флуоресцентными белками (FP) с наиболее часто используемыми парами FRET, представляют собой CFP-YFP, но GFP-RFP также можно использовать для обнаружения FRET методом проточной цитометрии. Такие культуры клеток, используемые для визуализации FRET, могут иметь различные уровни клеток, демонстрирующих FRET.В показанном здесь примере клетки были отсортированы в соответствии с высокими уровнями CFP и YFP, которые показали уровень FRET 26% по сравнению с исходной культурой с 10% FRET. Визуализация FRET методом сенсибилизации значительно упростилась за счет предварительной сортировки клеток, экспрессирующих более высокие уровни FRET.

Гибридома FRET

Липофильные карбоцианиновые красители DiO и DiI действуют как донорная и акцепторная пары FRET. Это явление можно использовать для обнаружения слитых клеток, когда два исходных типа клеток ранее были помечены DiO и DiI. Усиленный сигнал DiI позволяет обнаруживать слитые гибридомные клетки.

Mcab Fluorochrome FRET

Димерные составляющие рецепторов также можно определить, будь то гомодимеры или гетеродимеры, с помощью FRET. В случае гомодимерных рецепторов, антител против, например, CD8 альфа-альфа, используется один и тот же клон антитела с двумя парными флуорофорами FRET , например. Pacific Blue и Alex Fluor 488. Одновременное мечение двумя антителами, Pacific Blue в качестве донора и Alexa Flour 488 в качестве акцептора, позволяет обнаруживать любой FRET в канале фиолетового лазера 530 нм, в данном случае обнаруживая гомодимерные рецепторы CD8 альфа-альфа. .Аналогичным образом можно обнаружить и гетеродимерные рецепторы.

Кинетический лад

Антитела, конъюгированные с красителями Alexa Fluor, такими как Alexa Fluor 488 и, например, 555, также могут действовать как донорные и акцепторные флуорофоры для обнаружения FRET. Такое мечение Alexa Fluor 3-фосфоинозитид-зависимой протеинкиназы 1 (PDK1) и фосфолипазы Cg1 (PLCg1) на фиксированных клетках позволяет динамически измерять FRET в канале аргонового лазера 575 нм (PE) во времени, обеспечивая простое и значимое отображение сигнала FRET из-за к взаимодействию PDK1 с PLCg1.Стимуляция EGF временно трансфицированных эпителиальных клеток молочной железы MDA-MB-231 может показать, что протеинкиназы, такие как PDK1, регулируют фосфолипазу C, PLCg1, которая участвует в инвазии раковых клеток.

Публикации FRET

С. Раймонди, А. Чих, А. П. Уилер, Т. Маффуччи, М. Фаласка . Новый регуляторный механизм связывает PLCg1 с PDK1. J Cell Sci Epub18 мая 2012.

Г Уорнес. Применение проточной цитометрии FRET — перенос энергии резонансного флуоресценции. The Biomedical Scientist , 53(2) p119-121, февраль 2009 г.

А. Фоссенкампер, О. Марчес, П. Д. Фэйрклаф, Г. Уорнс, А. Дж. Стэгг, Дж. О. Линдсей, П. С. Эванс, Л. А. Луонг, Н. М. Крофт, С. Найк, Г. Франкель, Т. Т. Макдональд. Ингибирование передачи сигналов NF-kB в дендритных клетках человека энтеропатогенным Escherichia coli эффекторным белком NIeE. J Иммунол 185: 4118-4127, 2010.

Применение к датчику Epac cAMP в качестве примера

Образец цитирования: van der Krogt GNM, Ogink J, Ponsioen B, Jalink K (2008) Сравнение пар донор-акцептор для генетически кодируемых датчиков FRET: применение к Epac cAMP Датчик как пример. ПЛОС ОДИН 3(4): е1916. https://doi.org/10.1371/журнал.pone.0001916

Редактор: Карл-Вильгельм Кох, Ольденбургский университет, Германия

Получено: 21 февраля 2008 г. ; Принято: 26 февраля 2008 г .; Опубликовано: 2 апреля 2008 г.

Авторские права: © 2008 van der Krogt et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: При поддержке Голландского онкологического фонда (KWF) и материальных грантов от NWO и Фонда Жозефины Нефкенс. Финансирующие агентства не участвовали ни в одной части исследования.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), безызлучательный перенос энергии от донорного флуорофора к акцептору, стал важным инструментом в клеточной биологии, поскольку он позволяет визуализировать белок-белковые взаимодействия с помощью световой микроскопии. FRET также идеально подходит для считывания так называемых «сенсоров», то есть генетически сконструированных конструкций, которые сообщают о конформации или состоянии активации белков. Ранее мы сообщали о CFP-Epac-YFP [1], сенсорной конструкции, состоящей из части цАМФ-связывающего белка Epac1, расположенного между голубым и желтым флуоресцентными белками. Конструкция разворачивается при связывании вторичного мессенджера цАМФ с фрагментом Epac, и, таким образом, за увеличением цАМФ легко следует снижение FRET. В то время как цАМФ-индуцированное изменение FRET в CFP-Epac-YFP уже достаточно устойчиво (отношение выбросов CFP/YFP изменяется примерно на 30%), недавнее введение ряда новых флуоресцентных белков побудило нас к дальнейшей оптимизации диапазона FRET и других свойств. сенсора систематическим изменением донорно- и акцепторных флуоресцентных белков.

Физические требования для резонансной передачи энергии резюмируются в 2 уравнениях: Как видно из обратной зависимости мощности 6 ^th в уравнении 1, эффективность переноса E резко зависит от расстояния (r) между донором и акцептором по сравнению с характеристикой Радиус Ферстера (R ₀ , расстояние, на котором передача является полумаксимальной для этой конкретной пары FRET). R ₀, в свою очередь, зависит от нескольких факторов, включая κ ² , который описывает выравнивание флуоресцентных диполей донора и акцептора, и J(λ), который представляет собой перекрытие спектра излучения донора и спектра возбуждения акцептора.Более того, квантовый выход донора (ϕ _d) и коэффициент поглощения акцептора (ε _a) являются важными детерминантами R ₀ . Почему эти соображения важны для конструкций FRET, станет ясно ниже.

Изменения

FRET могут быть обнаружены с помощью нескольких микроскопических методов [4], наиболее важными из которых являются сенсибилизированное излучение (SE) и визуализация времени жизни флуоресценции (FLIM). В SE донор возбуждается светом подходящей длины волны, и передача энергии количественно определяется по соотношению излучения донора и акцептора.При правильной коррекции спектрального просачивания и перекрестного возбуждения можно получить полностью количественные результаты [5]. Напротив, измерения FLIM основаны только на сигнале донора. В этих измерениях характерное затухание флуоресценции донора при возбуждении отслеживается с временным разрешением менее нс. Тогда FRET проявляется как сокращение времени распада донора, по существу, как: E = 1−τ _D+A /τ _D , где τ _D+A и τ _D — время жизни в возбужденном состоянии. донора в присутствии и в отсутствие акцептора соответственно.

В последние годы наблюдается огромный рост количества доступных флуоресцентных белков (FP). Практически каждый месяц добавляются новые версии, отличающиеся цветом, яркостью или другими характеристиками. Многие из них имеют потенциал для использования в парах FRET. Что делает хорошую пару FRET для датчиков in vivo ? Продолжая пример CFP-Epac-YFP, даже если мы проигнорируем соображения дизайна ядра, воспринимающего цАМФ, и сосредоточимся только на FP, ответ уже будет сложным.Свободно сгруппированные, мы можем различать фотофизические, биологические и детектирующие соображения.

Фотофизика

Очевидно, что для оптимальной визуализации FRET необходимо созвездие, которое максимизирует диапазон FRET при изменении уровня цАМФ. Таким образом, в уравнение входят радиус Фёрстера пары FRET, яркость и ориентация диполя. К другим важным фотофизическим свойствам относятся фотостабильность (например, скорость обесцвечивания и фотохромизм [6]), нечувствительность к условиям микроокружения, таким как pH или ионная сила [7], и, в случае экспериментов без клеток, нечувствительность к ультрафиолетовому излучению.Наконец, FP должны эффективно сворачиваться при 37°C и быстро приобретать свои окончательные спектральные свойства (созревание).

Биология

Поскольку сенсоры должны быть биологически инертными, флуоресцентные фрагменты могут не влиять на клеточную функцию и локализацию меченого белка. При этом размер прикрепленных флуорофоров должен быть минимальным, а их склонность к димеризации или агрегации исключена [8]. Как правило, более длинные волны возбуждения предпочтительнее возбуждения в ближнем ультрафиолете или синем свете по причинам фототоксичности [9] [10] [11], проникновения в ткани и автофлуоресценции. К сожалению, многие красные FP начинают свою жизнь как незрелый зеленый белок, что может затруднить их использование в приложениях FRET [12]. Очевидно, что это делает быстрое созревание чрезвычайно важным параметром.

Обнаружение

Чтобы еще больше усложнить ситуацию, разные методы обнаружения подчеркивают разные качества FP. Например, низкое перекрестное возбуждение и высокая яркость акцептора (т. е. высокий квантовый выход и высокое поглощение) важны для определения SE, тогда как для обнаружения FLIM эти факторы менее важны.На самом деле высокий квантовый выход акцептора может быть даже неблагоприятным для FLIM [13]. И наоборот, SE нечувствителен к мультиэкспоненциальному затуханию флуоресцентного донора, тогда как анализ FLIM сильно затруднен, когда присутствует более одной константы затухания [14]. В качестве другого примера, детекторы фотоумножителей, обычно используемые в установках конфокальной визуализации, наиболее чувствительны в синем диапазоне спектра, тогда как детекторы с зарядовой связью (CCD) или лавинные фотодиоды (APD), используемые в большинстве установок FLIM, предпочитают красные цвета.

В целом, огромное количество конструктивных соображений поражает начинающего конструктора FRET. В этой статье мы описываем результаты исследования, направленного на оптимизацию пар FRET для использования в биосенсорах, таких как датчик цАМФ на основе Epac. Наша стратегия заключалась в том, чтобы создать широкий выбор комбинаций FP, разделенных коротким спейсером, экспрессировать их в клетках HEK293 и протестировать эффективность FRET и другие соответствующие свойства, упомянутые выше. Помимо спектральных вариантов, в наше исследование были также включены мутанты дипольной ориентации и конструкции с дублирующими (тандемными) акцепторами.Затем наиболее многообещающие пары были клонированы в датчик Epac FRET и проверены на эффективность в качестве индикатора цАМФ в живых клетках. Основываясь на вышеупомянутых конструктивных соображениях, мы определяем два новых датчика, CFP-Epac-cp ¹⁷³ Venus и GFPΔ-Epac-mRFP, как улучшенные альтернативы для обнаружения SE и FLIM соответственно. Результаты также показывают в целом хорошую корреляцию между эффективностью пар FRET в линкерной конструкции и в сенсоре Epac. Таким образом, настоящий обзор должен быть в целом полезен при разработке новых датчиков FRET.

Результаты

Основные соображения и конструкции, включенные в исследование

Наш поиск оптимальных пар FRET руководствуется тремя основными соображениями.

(i) Оптимизация FP в части спектра CFP-YFP. Оригинальный датчик EPAC содержит CFP и YFP [15]. Эти ФП первого поколения чрезвычайно популярны для FRET, и поэтому многие лаборатории имеют оборудование и фильтры для обнаружения в этой части спектра. В то время как CFP-Epac-YFP конкурирует с лучшими датчиками FRET в отображении устойчивых изменений FRET, мы наблюдали в ходе расширенной характеристики, что этот конкретный акцептор демонстрирует некоторый обратимый фотохромизм при возбуждении УФ-светом (т.е., во время экспериментов по освобождению цАМФ). Кроме того, усиленный YFP показывает некоторую зависимость от pH и Cl ^— [16] [17] Ponsioen, неопубликованные наблюдения). Таким образом, цель этой части исследования состояла в том, чтобы оптимизировать CFP-Epac-YFP в отношении диапазона FRET, устойчивости к pH и нечувствительности к УФ-излучению. Включенные конструкции представлены на рис. 1–3. Подробности о конструкциях и молекулярном клонировании см. в разделе «Методы».

Рисунок 1. Схематический обзор конструкций, использованных в этом исследовании.

Донорный и акцепторный флуорофоры соединены пептидным отрезком (линкер А: SGLRSRYPFASEL) или доменом Epac1(ΔDEP, CD) [1]. В пределах этого участка аминокислоты PF были заменены самим доменом Epac, оставив линкеры B: SGLRSRY и C: ASEL. Для укороченных донорных конструкций (CFPΔ и GFPΔ) GITLGMDELYK был удален из донорских FP, а SGLRS — из линкера. В конструкциях тандемных акцепторов акцепторы были разделены дополнительным линкером (линкер D: PNFVFLIGAAGILFVSGEL), за исключением tdHcRed и tdTomato, которые имеют отличительные линкеры, а именно NG(GA) ₆ PVAT) и (GHGTGSTGSGSSGTASSEDNNMA) соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001916.g001

Рисунок 2. FRET в конструкциях донор-линкер-акцептор, обнаруженный с помощью FLIM в частотной области.

Указанные конструкции экспрессировали в клетках HEK293, и эффективность FRET E определяли, как подробно описано в разделе «Материалы и методы». Показаны средние (столбцы), стандартное отклонение (SD) и стандартная ошибка среднего (SEM) для 20–400 клеток. Подробнее см. в тексте.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001916.g002

Рис. 3. Диапазон FRET в сенсорах цАМФ.

Указанные конструкции экспрессировали в клетках НЕК-293 и анализировали на цАМФ-индуцированные изменения соотношения донора и акцептора на флуоресцентном микроскопе, оснащенном двойным фотометром. Эмиссия донора и акцептора считывалась одновременно, и исходное соотношение было установлено на 1,0 в начале. Диапазон FRET ΔR определяли путем расчета изменения отношения после добавления IBMX и форсколина. Это максимально повышает внутриклеточный уровень цАМФ и насыщает сенсор.Для получения дополнительной информации см. Текст и Методы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001916.g003

(ii) Широкий спектр излучения CFP значительно перекрывается со спектром YFP. Таким образом, часто слабые сигналы сенсибилизированного излучения могут быть скрыты утечкой CFP в несколько раз больше ее величины. Для ратиометрии FRET это особенно неблагоприятно, потому что увеличение FRET приведет к противоположным сигналам в акцепторном канале: увеличивается сенсибилизированное излучение акцептора, но это частично маскируется сопутствующим снижением утечки CFP.Поэтому в этой части нашего исследования мы стремились максимизировать диапазон FRET за счет минимизации спектрального перекрытия между излучением донора и акцептора. Мы протестировали ряд акцепторов с красным смещением на предмет их эффективности в сочетании с донором CFP (рис. 2–3).

(iii) Наконец, мы протестировали серию конструкций, которые содержали GFP в качестве флуоресцентного донора. Обоснование состоит из четырех причин: во-первых, GFP почти в два раза ярче, чем CFP, а во-вторых, его более длинная оптимальная длина волны возбуждения (489 нм против 432 для CFP) хорошо соответствует лазерным линиям 488 нм, присутствующим в большинстве конфокальных микроскопов.В-третьих, возбуждение с длиной волны 488 нм значительно менее жестко для клеток. В-четвертых, GFP по своей природе лучше подходит для измерений FLIM, поскольку его флуоресценция затухает моноэкспоненциально, в отличие от двойных постоянных времени затухания, наблюдаемых для CFP [18] [14].

Во всех случаях первоначальные эксперименты проводились на конструкциях, состоящих из флуоресцентных доноров и акцепторов, разделенных небольшим гибким спейсером (13 аминокислот; рис. 1). Эффективность FRET была протестирована с помощью FLIM в частотной области на широкопольном микроскопе (рис. 2).Затем выбранные пары FP были вставлены в датчик Epac и проверены на работоспособность с помощью логометрии FRET (рис. 3), подробности см. в разделе «Методы».

Анализ пары CFP-YFP FRET

Эффект димеризации.

Производные GFP, такие как CFP и YFP, имеют присущую им тенденцию к образованию димеров при высоких концентрациях [19] [20]. Присутствие двух FP в однополипептидных конструкциях FRET усугубляет эту потенциальную проблему. Таким образом, мутация, нарушающая димеризацию (A206K, [19]; здесь обозначена как nd для недимеризации), была введена в оба FP в конструкции (CFP ^и-линкер-YFP ^и; фиг. 2).После экспрессии в клетках HEK293 определяли FRET путем визуализации времени жизни CFP (см. Методы). Обе конструкции показали по существу одинаковую эффективность FRET (E = 0,16). Таким образом, димеризация, по-видимому, не влияет на FRET в этих конструкциях, хотя предположительно короткий линкер из 13 ак может ограничивать свободу ориентации в этой конструкции, тем самым маскируя возможный эффект мутации.

Затем мы исследовали влияние nd-мутаций в датчике Epac. CFP ^nd -Epac-YFP ^nd получали путем вставки цАМФ-чувствительного фрагмента белка Epac(ΔDEP, CD) [1] в линкерную область. Чтобы напрямую сравнить эту конструкцию с родительским сенсором CFP-Epac(ΔDEP, CD)-YFP, оба были экспрессированы в клетках HEK293 и подвергнуты логометрии на установке с двумя фотометрами (см. Методы). После регистрации исходного уровня клетки обрабатывали смесью форсколина (25 мкМ) и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX (100 мкМ) для насыщения связывания цАМФ с EPAC [1] (рис. 4). Затем диапазон FRET ΔR был принят за относительное падение коэффициента. Примечательно, что мутации A206K очень мало влияли на размах FRET (ΔR = 0.26 и 0,25 для А206К (б) и контроля (г) соответственно; Рисунок 3). Таким образом, в обеих этих конфигурациях димеризация, по-видимому, не имеет большого значения, хотя мы предполагаем, что в других конфигурациях эффекты могут быть значительными.

Рис. 4. Типичные ответы FRET в клетках HEK293, экспрессирующих CFP ^nd -Epac-cp ¹⁷³ Venus, на стимуляцию IBMX/форсколином.

(A) Эмиссия CFP и YFP из одной клетки HEK293, экспрессирующей улучшенный сенсор цАМФ, была обнаружена при 4 образцах в секунду после добавления IBMX и форсколина. Соотношение YFP/CFP упало почти на 35% за считанные минуты. Показана типичная запись. (B) Спектральный отпечаток одной клетки, полученный до (черный) и после (серый) IBMX и форсколина с использованием спектрометра. Для получения дополнительной информации см. Методы.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001916.g004

При визуализации этих клеток с помощью конфокальной микроскопии мы отметили, что в некоторых типах клеток конструкции проявляли небольшую тенденцию к образованию сильно флуоресцентных агрегатов (спеклов) в фракция клеток (рис. 5).Удивительно, но конструкции, содержащие мутации nd, не показали лучших результатов в этом отношении. Мы предполагаем, что это может быть связано с тем, что, хотя константа димеризации для отдельных недимеризующихся FP значительно снижена [19], присутствие двух частей FP увеличивает авидность конструкций, но альтернативные объяснения также могут быть верными. Вставка также является важным фактором, определяющим агрегацию, поскольку в конструкциях, содержащих Epac(ΔDEP, CD), спекл-образование было почти полностью излечено.

Рис. 5. Формирование спекла.

Клетки HEK293 трансфицировали указанными конструкциями и далее культивировали в течение 24–36 часов. Показаны конфокальные срезы, выбранные для максимальной визуализации любых спеклов. Обратите внимание, что большинство спеклов остаются незамеченными при широкопольной флуоресцентной микроскопии. Также указаны оценочные проценты клеток, показывающих хотя бы несколько крапин. Масштабная линейка, 11 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001916.g005

Замена Венеры на YFP.

Из исследований клеток, экспрессирующих YFP, мы пришли к выводу, что как зависимость от pH, так и фотохромизм, индуцированный УФ-излучением, в CFP-линкере-YFP находятся внутри фрагмента YFP. Поэтому мы заменили его на Venus [21], вариант со значительно более низким pKa, который, следовательно, должен быть менее чувствительным к pH. Мы проверили конструкции на УФ-индуцированный фотохромизм, подвергнув клетки кратковременным вспышкам УФ-излучения ртутной дуговой лампы, отфильтрованной через куб фильтра Дапи (рис. 6). В конструкциях, содержащих YFP, это вызывало зависимое от интенсивности увеличение яркости YFP, составлявшее до 10% в акцепторном канале.Напротив, Венера оказалась полностью устойчивой к аналогичной обработке ультрафиолетом. Более того, Venus также значительно повысил эффективность FRET конструкции (E = 0,21) по сравнению с YFP (E = 0,16; рис. 2). Однако обратите внимание, что у Венеры отсутствует недимеризующая мутация.

Рис. 6. Фотохромизм, индуцированный УФ-излучением.

Изменение отношения эмиссии YFP к эмиссии CFP в CFP ^и-линкер-YFP ^и (квадраты) и CFP ^и-линкер-Venus ^d (треугольники) после воздействия УФ-излучения в течение указанного времени.CFP ^nd -linker-YFP ^nd, а также свободный YFP (данные не показаны) демонстрируют дозозависимое увеличение эмиссии, которое достигает максимума примерно на 10%, тогда как Venus и cp ¹⁷³ Venus (не показаны) нечувствительны к УФ-воздействию. См. Методы для более подробной информации.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001916.g006

Затем мы протестировали Венеру в датчике цАМФ, приготовив CFP-Epac-Venus. Ратиометрическое определение изменений FRET, вызванных цАМФ (рис. 3), показало, что Venus значительно увеличивает диапазон FRET (ΔR = 0.31, по сравнению с ΔR = 0,25 для CFP-Epac-YFP). Таким образом, как с точки зрения нечувствительности к УФ-излучению, так и с точки зрения диапазона FRET датчика Venus оказывается гораздо лучшим акцептором FRET.

Различное расстояние между донором и акцептором.

Систематические исследования влияния длины линкера на FRET ясно продемонстрировали важность минимизации расстояния между донором и акцептором для эффективности FRET [22], [23]. В общем, очень мало можно удалить с N- или C-концов FP без неблагоприятного влияния на их производительность [24].В попытке минимизировать расстояние мы удалили 11 С-концевых а.о. из CFP, а также еще 5 а. о. из линкера (CFPΔ; рис. 1). Действительно, удаление этих 16 а.о. привело к значительному повышению эффективности FRET (E = 0,31 по сравнению с E = 0,21 для контрольной конструкции Venus; рис. 2). Обратите внимание, однако, что помимо сближения донора и акцептора, эта делеция может также уменьшить свободу вращения.

Будет ли делеция CFPΔ полезной для какой-либо конкретной сенсорной конструкции FRET, конечно, будет зависеть от третичной конформации и свободы вращения внутри этих химер.Эквивалентная делеция в Epac-сенсоре привела к небольшому снижению, а не к увеличению диапазона FRET (ΔR = 0,29 по сравнению с ΔR = 0,31 для контрольной конструкции CFP-Epac-Venus; рис. 3). Таким образом, включение мутации CFPΔ не дает преимуществ для сенсора Epac.

Выравнивание диполя.

FRET зависит не только от спектрального перекрытия и донорно-акцепторного расстояния, но также сильно зависит от ориентации флуоресцентного диполя [3]. Затем мы решили систематически изменять ориентацию Венеры по отношению к CFP, заменяя акцептор YFP набором мутантов ориентации, так называемыми версиями FP с круговой перестановкой (cp) [25] [26]. У этих мутантов наклон диполя достигается перемещением амино- и карбоксильных концов акцепторного флуорофора в альтернативные места на поверхности цилиндра FP. Все 6 версий cpVenus [27] были вставлены в конструкцию линкера. FLIM-анализ клеток, экспрессирующих эти конструкции, показал, что только вставка cp ¹⁷³ Venus приводила к значительному улучшению (E = 0,27), тогда как другие перестановки давали сопоставимые (cp ¹⁵⁷) или даже худшие (cp ^{49/145/195/ 229} ) значения FRET, чем у предшественника (E = 0.21; Фигура 2).

Поскольку ориентация диполя в сенсоре цАМФ может отличаться от таковой в линкерной конструкции, выборку мутантов cpVenus также тестировали в конструкции Epac. Чтобы исследовать эффект вращения диполя вдоль двух осей, мы протестировали cp195, N-конец которого находится на той же стороне ствола, что и wtVenus, и cp173, N-конец которого находится на противоположной стороне ствола. . Размах ладов ¹⁹⁵ Венеры (ΔR = 0,33) и ¹⁷³ Венеры (ΔR = 0,33). 36) оба превышали показатели конструкции CFP-Epac-Venus (ΔR = 0,31; рис. 3). Также было проверено, что cp173 сохраняет благоприятную нечувствительность к УФ-излучению (фиг. 6). В заключение, как в линкерной конструкции, так и в датчике цАМФ включение ^cp173 Venus значительно повышает производительность.

Тандемные акцепторы.

Наконец, мы изучили эффект презентации флуоресцентных доноров дубликатами (тандемными) акцепторами. Можно ожидать, что это увеличит FRET за счет увеличения эффективного поглощения акцептора, хотя и за счет увеличения размера конструкции.Два флуорофора в тандемном акцепторе также, вероятно, будут ориентированы по-разному, тем самым ослабляя требование выравнивания диполей донор-акцептор. Двойные акцепторы ранее использовались для минимизации эффектов димеризации, вызванных FP [28] [29]. Для увеличения возможности предъявления акцепторов под благоприятным углом были изготовлены три типа тандемных акцепторов: тандемная Венера, тандемная КП ¹⁷³ Венера и тандемная КП ¹⁷³ Венера с Венерой. По сравнению с контрольной конструкцией CFP-линкер-Венера (E = 0.21), каждый из тандемных рецепторов давал значительно более высокую эффективность FRET (диапазон: E = 0,26–0,27; рис. 2), при этом CFP-linker-cp ¹⁷³ Venus-Venus дает наилучшие результаты. Это говорит о том, что стратегия представления донора с акцепторами под разными углами может быть в некоторой степени плодотворной. Поэтому мы также объединили тандемы cp ¹⁷³ Венера-Венера и Венера-Венера с эффективной делецией 16аа. Полученные конструкции еще раз показали повышенную эффективность FRET (E = 0.28 и 0,31 соответственно), хотя и не превосходили конструкцию CFPΔ-линкер-Венера (E = 0,31). Таким образом, в этих случаях увеличенный размер конструкции не уравновешивается улучшенной эффективностью FRET. Однако стоит отметить, что эти тандемные акцепторные конструкции не проявляли тенденции к образованию агрегатов в клетках (рис. 5).

Наконец, мы протестировали подмножество этих пар FRET в датчике Epac. В этих конструкциях 12аа С-концевая делеция CFP сочеталась с тандемными акцепторами cp ¹⁷³ Venus-Venus и cp ¹⁷³ Venus-cp ¹⁷³ Venus.Полученные датчики цАМФ показали изменения FRET, вызванные цАМФ, ΔR = 0,36 и ΔR = 0,29 соответственно (рис. 3). Таким образом, увеличенный размер конструкции снова не компенсируется значительным увеличением размаха FRET.

В целом, наши данные показывают значительную, хотя и не идеальную корреляцию между эффективностью пар FP в конструкции линкера и в датчике Epac. В линкерной конструкции положительные эффекты проявлялись в результате изменения расстояния (C-концевая делеция CFPΔ), ориентации (cp ¹⁷³ Venus), а также удвоения акцептора.

Важно отметить, что включение Venus в датчик цАМФ излечило чувствительность к pH и УФ. Несколько дополнительных изменений увеличили диапазон FRET, в том числе cp ¹⁷³ Venus и версии с тандемным акцептором. Для будущих экспериментов первый вариант (CFP-EPAC-cp ¹⁷³ Venus) сочетает в себе хороший диапазон FRET с небольшим размером. CFPΔ-Epac-cp ¹⁷³ Venus-Venus является подходящим кандидатом, если образование спеклов является проблемой.

Анализ пары CFP-RFP FRET

Как указывалось ранее, спектральное перекрытие CFP и YFP усложняет количественные измерения FRET и уменьшает диапазон FRET логометрических датчиков.Акцепторы с красным смещением могли бы устранить эти недостатки, но они также, вероятно, будут иметь меньшее спектральное перекрытие с CFP и, следовательно, меньшее FRET. Будь то проклятие или благословение, зависит от датчика FRET под рукой.

Эффективный FRET от CFP до Discosoma RFP (DsRed) [30] был продемонстрирован ранее [31] [32] [33]. Однако DsRed является несколько громоздким акцептором, поскольку он образует тетрамеры и демонстрирует очень медленное созревание от зеленого до красного [12]. Поэтому мы протестировали некоторые из новых красных FP, особенно mRFP1 [28], mCherry, mOrange [8] и HcRed [34].Также тестировались тандемные версии Tomato ([8]; мономер не тестировался), а также HcRed [35] и mCherry.

Мономерные красные акцепторы.

В линкерной конструкции CFP-линкер-YFP замена акцепторной части мономерными красными акцепторами mRFP1, mCherry и mOrange (рис. 2) дала значения E 0,16, 0,12 и 0,04 соответственно по сравнению с E = 0,16 для родительская конструкция. Значительный FRET в первых двух конструкциях несколько удивителен, потому что эти акцепторы с красным смещением имеют гораздо меньшее спектральное перекрытие с донором CFP, чем YFP.Обратите внимание, что «улучшенные» преемники mCherry и mOrange не превзошли своего предка mRFP1. На самом деле, из этих трех красных акцепторов mOrange является самым ярким и спектрально лучше всего соответствует CFP [8], но хуже всего работает в качестве акцептора FRET в линкерных конструкциях. Мы заметили, что стандартные отклонения в этих экспериментах были относительно большими (рис. 2 и 3). Это может быть связано с медленным созреванием красных FP от зеленого (em. 430–550) до красного (em. 550–700) [12]. Незрелые формы излучают в донорном канале, тем самым значительно смещая время жизни флуоресценции.

В сенсоре Epac мы заменили YFP на mRFP1 или mCherry соответственно. Обе конструкции продемонстрировали сильные изменения FRET, индуцированные цАМФ (ΔR = 0,24 и 0,21 соответственно; рис. 3), сравнимые с исходным материалом CFP-Epac-YFP (ΔR = 0,25). В то время как доноры и акцепторы имеют лучшее спектральное разделение, это, таким образом, не материализовалось в улучшенном диапазоне FRET в логометрическом анализе, и фактически конструкции не соответствовали сенсорам, таким как CFP-Epac-cp ¹⁷³ Venus.

Тандемные акцепторы.

Затем мы подготовили версии с тандемными повторами красных акцепторных FP. CFP-линкер-tdTomato (E = 0,16), CFP-линкер-tdmCherry (E = 0,17) и CFP-линкер-tdHcRed (E = 0,15) показали хорошую эффективность FRET, при этом последние два немного превосходили соответствующие мономерные акцепторные конструкции. Фигура 2).

Кроме того, в этих тандемно-акцепторных конструкциях делеция 16 а.о. в линкерной части снова оказалась полезной. Так, CFPΔ-линкер-tdTomato показал эффективность FRET E = 0.31 по сравнению с 0,16 для CFP-linker-tdTomato. Это представляет собой улучшение на 0,15 и показывает, что красные FP могут функционировать как очень эффективные акцепторы CFP.

Наконец, мы проверили работу tdTomato в качестве акцептора CFP в датчике Epac. CFP-Epac-tdTomato показал сильное вызванное цАМФ изменение отношения FRET (ΔR = 0,24), но опять же не наблюдалось увеличения производительности по сравнению с CFP-Epac-mRFP (рис. 3). Кроме того, в этой конструкции ясно проявлялись проблемы созревания tdTomato.Простой визуальный осмотр с использованием куба с тройным фильтром CFP/YFP/RFP ясно выявил большое разнообразие стадий созревания (рис. 7A). Важно отметить, что стадия созревания акцептора также значительно влияет на значения E, определенные с помощью FLIM (рис. 7B).

Рисунок 7. Медленное созревание tdTomato от зеленого к красному и его влияние на FRET.

(A) Клетки, экспрессирующие CFP ^nd -EPAC-tdTomato в течение 24 часов, отображают спектр цветов при визуальном наблюдении с использованием трехцветного куба Omega X154 (CFP-YFP-RFP). Из соображений воспроизведения конфокальное изображение показывает смесь зеленого (470–530 нм) и красного (570–670 нм) излучения, чтобы точно соответствовать изображению, видимому глазом. Напротив, CFP ^nd -EPAC-mRFP и CFP ^nd -EPAC-mCherry демонстрируют более однородный красный цвет. (B) Межклеточная изменчивость созревания CFP ^и -linker-tdTomato вызывает значительные отклонения во времени затухания флуоресценции, обнаруженные в канале CFP, по данным FLIM в частотной области. Масштабная линейка, 12 мкм.

https://дои.org/10.1371/journal.pone.0001916.g007

В заключение, хотя эти эксперименты показывают, что эффективный FRET от CFP к различным акцепторам красного FP возможен, улучшенное спектральное разделение не привело к превосходным логометрическим датчикам FRET в наших экспериментах. .

Анализ пары GFP-RFP FRET

Затем мы решили оценить эффективность конструкций, содержащих GFP в качестве донора FRET (рис. 2). По сравнению с CFP, лучшая яркость и более длинная длина волны возбуждения GFP (489 нм по сравнению с 432 для CFP) должны помочь в предотвращении фототоксичности, а его одноэкспоненциальное затухание хорошо подходит для измерений FLIM.

Первоначально мы подготовили линкерные конструкции GFP ^и с красными акцепторами mRFP и tdHcRed (рис. 2). Эффективность FRET, обнаруженная с помощью FLIM, составила E = 0,08 для GFP ^и-linker-mRFP и E = 0,10 для GFP ^и-linker-tdHcRed. В попытке повысить эти значения мы затем воспроизвели делецию C-конца донора, которая оказалась настолько эффективной для доноров CFP. Действительно, GFP ^и Δ-линкер-mRFP показали значительно повышенное значение Е, равное 0,21. Таким образом, делеция С-конца, по-видимому, столь же эффективна в GFP.

Мы дополнительно протестировали более новые варианты mCherry, tdTomato и mOrange на производительность с донором GFP. GFP ^и-linker-mCherry и GFP ^и-linker-tdTomato продемонстрировали хорошие показатели FRET (E = 0,18 и E = 0,20 соответственно), но значение для GFP ^и-linker-mOrange, E = 0,09, разочаровало. . Таким образом, опять же, хотя теоретически он имеет лучшее спектральное соответствие донору, mOrange не оправдал своих надежд в этих экспериментах. С другой стороны, хорошая эффективность FRET, наблюдаемая с mCherry, является многообещающей для будущей разработки датчиков FLIM, в частности, поскольку эксперименты по подсчету одиночных фотонов с временной корреляцией подтвердили, что флуоресцентный распад донора GFP в этой конструкции хорошо описывается одним показатель [36].

Наиболее многообещающие из этих пар FRET были впоследствии протестированы в датчике Epac. GFP ^и Δ-Epac-mRFP, GFP ^и-Epac-mCherry и GFP ^и-Epac-tdTomato продемонстрировали устойчивые изменения соотношения, индуцированные цАМФ, в клетках HEK293 (ΔR = 0,29, 0,23 и 0,27 соответственно; рис. 3).

Какая из этих конструкций рекомендуется в качестве сенсора цАМФ в FLIM и логометрических экспериментах? GFP ^и Δ-Epac-mRFP продемонстрировали наибольшее изменение FRET, но фотообесцвечивание mRFP происходит легче, чем два других [8]. Для экспериментов FLIM и отношения эмиссии это не должно представлять проблемы, но обесцвечивание акцептора ограничило бы полезный срок службы этой конструкции в количественных экспериментах с сенсибилизированной эмиссией [5], потому что для этого метода необходимо собирать отдельные изображения акцептора. Вторая лучшая конструкция, GFP ^и-Epac-tdTomato, демонстрирует почти такой же большой диапазон FRET и очень устойчива к фотообесцвечиванию. С другой стороны, в дополнение к большему размеру фрагмент tdTomato вызывает проблемы созревания, аналогичные тем, которые наблюдаются для CFP-Epac-TdTomato, и поэтому мы не рекомендуем его для будущих экспериментов.

Следовательно, для сенсибилизированной эмиссионной визуализации наилучшим выбором является GFP ^и-Epac-mCherry, поскольку он сочетает в себе хорошую устойчивость к созреванию и обесцвечиванию с приличным диапазоном FRET. Для FLIM и простых логометрических экспериментов предпочтительнее использовать GFP ^и Δ-Epac-mRFP.

Выводы и обсуждение

Это исследование было направлено на 1) определение оптимальных пар донор-акцептор для FRET и 2) использование этой информации для улучшения характеристик нашего датчика FRET на основе цАМФ в качестве модели для датчиков FRET однополипептидного типа в целом.Характеристики линкерных конструкций и сенсоров цАМФ оценивали с учетом различных требований для FLIM и логометрического обнаружения. Основываясь на наших результатах, мы рекомендуем CFP ^nd -Epac-cp ¹⁷³ Venus и CFP ^nd Δ-Epac-cp ¹⁷³ Venus-Venus (который несколько крупнее, но полностью лишен пятен) как лучший выбор. для логометрического, а также количественного обнаружения SE. Оба показывают увеличение на 44% по сравнению с уже устойчивым диапазоном FRET первоначально опубликованного датчика [1] и, кроме того, гораздо более устойчивы к изменениям pH и УФ-излучению.Для обнаружения на более длинных волнах и, в частности, для измерений FLIM мы представляем GFP ^и Δ-Epac-mRFP и GFP ^и -Epac-mCherry в качестве предпочтительных вариантов. В экспериментах по сенсибилизированному излучению последний превосходит первый, имея лучшую фотостабильность акцептора за счет несколько уменьшенного диапазона FRET.

Отмечая, что в это исследование был включен широкий, но далеко не исчерпывающий диапазон FP, наши дальнейшие наблюдения должны помочь в разработке датчиков FRET в будущем.Эти наблюдения можно резюмировать следующим образом.

Во-первых, в линкерной конструкции большинство комбинаций FP показали эффективность FRET от приемлемой до отличной (0,1

Во-вторых, при сравнении результатов линкерных конструкций общая тенденция заключается в том, что укорочение С-конца донора (мутанты CFPΔ/GFPΔ) благотворно влияет на эффективность FRET, особенно при введении в конструкции с умеренными базовыми значениями E. Это улучшение наблюдается независимо от вида акцептора, но подобное усечение не привело к значительному улучшению сенсоров Epac, что, скорее всего, отражает другую ориентацию и/или степень свободы вращения в последних конструкциях.

В-третьих, при введении в конструкции с умеренными уровнями FRET фрагменты двойного акцептора также значительно повышали значения E (сравните CFP-линкер-Venus с CFP-линкером-Venus-Venus и CFP-линкером-cp ¹⁷³ Venus-cp ¹⁷³ Venus; сравните CFP-linker-mCherry с CFP-linker-mCherry-mCherry; сравните CFP-linker-HcRed с CFP-linker-HcRed-HcRed). Опять же, этот эффект не наблюдался в конструкциях, которые уже демонстрировали высокие значения E (сравните CFPΔ-линкер-Венера с CFPΔ-линкером-Венера-Венера и CFPΔ-линкер-cp ¹⁷³ Venus-Venus; сравните CFP-линкер-cp ^{). 173} Venus to CFP-linker-cp ¹⁷³ Venus-cp ¹⁷³ Venus).В датчике цАМФ не наблюдалось никаких положительных эффектов (рис. 3). Однако, независимо от влияния этой модификации на значения E, стоит включить тандемные акцепторы в репертуар FP, потому что это излечивает тенденцию к образованию агрегатов, проявляемую некоторыми конструкциями, и может заменить обширное тестирование циклически пермутированных вариантов.

В-четвертых, ряд конструкций CFP-redFP демонстрирует, что различные красные FP являются хорошими акцепторами для CFP. Эти конструкции были подготовлены для увеличения диапазона FRET за счет лучшего спектрального разделения между донорами и акцепторами, но в нашем датчике Epac это теоретическое преимущество не материализовалось.

В-пятых, мы наблюдали четкие положительные эффекты включения круговых перестановочных мутантов Venus в линкерные конструкции и датчики Epac. Казалось бы, это указывает на то, что выравнивание диполей имеет первостепенное значение, но сопоставление наших наблюдений с опубликованными данными может вызвать некоторые сомнения в этой интерпретации. И в линкере, и в конструкциях Epac замена Venus на cp ¹⁷³ Venus дала наибольшее улучшение. Это указывает на то, что в обеих этих конструкциях N- и С-концы вставок находятся в сравнимых местах и что свобода вращения FP одинакова.Это маловероятно, учитывая природу очень разных вставок. Еще более примечательно то, что cp ¹⁷³ также является предпочтительным акцептором в других одноцепочечных датчиках FRET, опубликованных на сегодняшний день [27], [37], [38]. Таким образом, широко распространенное предпочтение cp ¹⁷³ акцепторов Венеры вызывает подозрение, что другие качества, а не ориентация диполя, делают cp ¹⁷³ Венеры таким хорошим акцептором.

На протяжении всего этого исследования мы подчеркивали, что, помимо эффективности FRET или диапазона, для датчиков FRET в равной степени важны и другие качества.Медленное созревание от зеленого до красного остановило некоторые из наиболее многообещающих пар FRET, например. те, у кого tdTomato в качестве акцептора. Точно так же нежелательным свойством, обнаруженным в некоторых конструкциях, является склонность к образованию ярких крапин (агрегатов; везикул). Мы обнаружили, что введение недимеризующих мутаций (A206K) в FP мало влияло на образование спеклов. Тем не менее, вставка оказала значительное влияние, поскольку конструкции Epac, как правило, меньше страдали от спеклов. Ориентация доноров и акцепторов в линкерной конструкции предположительно такова, что позволяет обоим FP одного полипептида взаимодействовать с FP другого, эффективно увеличивая авидность.Важно отметить, что введение тандемных акцепторов устранило этот недостаток. Мы предполагаем, что это происходит из-за внутренней димеризации тандемных акцепторов, но это не исследовалось систематически.

Поскольку двойное экспоненциальное затухание флуоресценции CFP по своей природе плохо подходит для FLIM, мы основывали наши датчики FLIM на GFP. Однако все красные акцепторы для GFP демонстрируют некоторую степень созревания от зеленого к красному. На практике mRFP и mCherry, которые созревают относительно быстро (<1 часа и <15 минут соответственно), показали хорошие результаты в датчиках FLIM.Для будущего развития необходимо также рассмотреть другой многообещающий подход, о котором недавно сообщалось. Здесь донор комбинируется с темным (т.е. нефлуоресцентным) акцептором, называемым REACh (Resonance Energy Accepting Chromoprotein) [13]. REACh — это вариант YFP, который можно комбинировать с GFP в датчиках Epac, что позволяет проводить измерения этого одноэкспоненциального донора в течение всего срока службы и устраняет необходимость в узкоспектральной фильтрации излучения GFP.

Методы

Конструкции

Для создания всех описанных конструкций использовали ранее опубликованную конструкцию CFP ^nd-Epac1(ΔDEP, CD)-YFP ^nd [1].Линкерные конструкции были получены путем вырезания домена Epac1(ΔDEP, CD) с использованием EcoRV/NheI и замены его линкером (GATATCCTTTTGCTAGC, сайты рестрикции EcoRV-NheI подчеркнуты), с получением линкера из 13 аминокислот (SGLRSRYPFASEL) между двумя флуорофорами. CFP ^d и YFP ^d были получены введением точечной мутации K206A [19] в CFP ^nd и YFP ^nd с помощью QuikChange (Stratagene). Усечения донорного флуорофора (GFPΔ/CFPΔ) были получены с помощью ПЦР, и в них отсутствовала С-концевая часть флуорофора (GITLGMDELYK), а также N-концевая часть линкера (SGLRS).Используя HindIII/EcoRV, эти продукты ПЦР использовали для замены CFP. FP Venus и cpVenus были созданы с помощью ПЦР с использованием следующих матриц: Venus [21] и cpVenus (из Ycam 3.2, 3.3, 3.6, 3.7 и 3.9; [27]). Используя NheI/EcoRI, эти продукты ПЦР использовали для замены YFP. Тандемные версии были созданы путем расщепления EcoRI/Xba и вставки дополнительного линкера (AATTTTGTCTTCCTGATCGGCGCCGCAGGAATACTCTTCGTATCTAGAGTGAATTCCTAA, новые сайты рестрикции Xba-EcoRI подчеркнуты). Этот линкер расщепляли с помощью XbaI/EcoRI и вставляли дополнительный флуорофор с использованием NheI/EcoRI, в результате чего получали два акцепторных флуорофора, разделенных линкером 19 аминокислотных остатков (PNFVFLIGAAGILFVSGEL).Однако для замены RFP применялась идентичная стратегия с использованием дополнительных матриц mRFP1 [28], mCherry, tdTomato, mOrange [8], HcRed [34] и tdHcRed [35].

Материалы

IBMX, форсколин и иономицин были получены от Calbiochem-Novabiochem Corp. (La Jolla, CA).

Культура клеток и трансфекция

клетки HEK293 высевали на покровные стекла диаметром 25 мм в шестилуночные планшеты в среде DMEM с добавлением 10% FCS и антибиотиков. Конструкции трансфицировали с использованием осадка фосфата кальция при ~0.8 мкг ДНК на лунку.

Микроскопия

Клетки в бикарбонатно-солевом буфере (содержащем в мМ 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 глюкозу, 23 NaHCO3, 10 HEPES), рН 7,2, выдерживали при 5% CO2, при 37°C. исследовали с помощью инвертированного микроскопа Leica DM-6000 с масляным иммерсионным объективом 63x, числовая апертура 1,32. Для экспериментов, описанных на рисунке 7A, использовался трехполосный куб флуоресцентного фильтра (CFP-YFP-RFP), тип X154 (Omega). Конфокальные изображения получали с помощью конфокальной сканирующей головки TCS-SP5, прикрепленной к микроскопу DM6000 (Leica, Mannheim, Germany).Агонисты и ингибиторы добавляли из концентрированных растворов.

Для получения спектральных отпечатков пальцев спектрометр Ocean Optics Type USB2000 (Dunedin, Florida, USA) был установлен на инвертированный микроскоп. Улавливали эмиссию одиночных трансфицированных клеток (время интеграции 1–8 с). Возбуждение осуществлялось от дуговой лампы, снабженной монохроматором.

Для оценки чувствительности к УФ-излучению (рис. 6) за клетками следили с помощью покадровой визуализации. После установления базового уровня клетки подвергали кратковременной (1 с = 1000000 мкс) вспышке УФ-излучения с использованием фильтрующего куба DAPI и источника света EL-6000 (Leica) на полной мощности.Для более низких экспозиций экспозиция уменьшалась за счет различных комбинаций времени затвора и фильтров нейтральной плотности и выражалась как эквивалентное время затвора в мкс. Вызванное вспышкой изменение соотношения YFP/CFP наносили на график в зависимости от эквивалентного времени воздействия.

Динамический мониторинг FRET

Клетки на покровных стеклах помещали на инвертированный микроскоп NIKON Diaphot и возбуждали при 425 нм (CFP) или 470 нм (GFP). Излучение регистрировали с помощью следующих оптических фильтров: (полосовые фильтры) CFP, 470±20 нм; GFP, 510±30 нм; YFP, 530±25 нм; (фильтр длинного прохода) оранжевый и красный варианты FP, фильтр 590 LP.Данные от донора и акцептора собирали одновременно, оцифровывали, и FRET выражали как отношение сигналов донора к сигналам акцептора. Значение FRET базовой линии было установлено на 1,0 в начале экспериментов. Затем клетки стимулировали 25 мкМ форсколина и 100 мкМ IBMX для максимального повышения внутриклеточной концентрации цАМФ. Изменения выражаются в виде процентного отклонения от начального значения 1,0. Данные взяты из 6–20 клеток на эксперимент. Обратите внимание, что для пар FRET с сильно различающимися спектральными свойствами диапазон FRET нельзя сравнивать количественно из-за неизбежных различий в фильтрах и чувствительности детекторов.

Визуализация флуоресценции в течение всего срока службы

FLIM-эксперименты проводились на инвертированном микроскопе Leica DM-IRE2 с использованием приставки Lambert Instruments (Leutingewolde, Нидерланды) для определения времени жизни в частотной области, управляемой программным обеспечением LI-FLIM от поставщика. CFP и GFP возбуждались светом мощностью ~ 4 мВт от светодиода с длиной волны 442 нм и 470 нм соответственно, модулированного на частоте 40 МГц, а излучение собиралось при 450–490 и 500–540 нм соответственно с использованием усиленной ПЗС-камеры. Время жизни относилось к 1 мкМ раствору родамина-G6 в физиологическом растворе, значение которого было установлено на уровне 4.время жизни 11 нс. Измеренные времена жизни (рассчитанные по разности фаз) CFP и GFP в отсутствие акцепторов составили 2,7 нс. Эффективность FRET E рассчитывали как E = 1−(измеренное время жизни пары FRET)/(измеренное время жизни донора). Эффективность FRET представляет собой среднее значение 20–400 клеток на конструкцию.

Многофотонная микроскопия FRET | В.М. Центр сотовой визуализации Кека, Университет штата Вирджиния.

Общая информация

Лазерный сканирующий микроскоп с двух- или трехфотонным (или многофотонным) возбуждением (нелинейный микроскоп) работает с использованием двух или трех фотонов с красной длиной волны для получения как чувствительности, так и разрешения по глубине без конфокальной апертуры.Многофотонный метод значительно снижает автофлуоресценцию и фотоповреждение выше и ниже фокальной плоскости, а объем фокальной плоскости зависит от дифракционного пятна, создаваемого линзой объектива.

Двухфотонное поглощение было теоретически предсказано Гоппертом-Майером в 1931 г. и впервые экспериментально наблюдалось в 1961 г. при использовании в качестве источника света рубинового лазера (Кайзер и Гарретт, 1961). Первоначальная идея двухфотонной флуоресцентной сканирующей микроскопии была предложена Sheppard et al.(1977) и была экспериментально продемонстрирована для биологической визуализации Винфридом Денком и Уоттом Вебом (Science, 1990).

Физика двухфотонного возбуждения

Вероятность двухфотонного поглощения зависит от совместной локализации двух фотонов в сечении поглощения флуорофора, а скорость возбуждения пропорциональна квадрату мгновенной интенсивности. Двухфотонное возбуждение стало возможным благодаря очень высокой локальной мгновенной интенсивности, которая обеспечивается комбинацией дифракционно-ограниченной фокусировки одиночного лазерного луча в плоскости образца и временной концентрации фемтосекундного (фс) лазера с синхронизацией мод.Преимущество двух фотонов примерно пропорционально обратному рабочему циклу возбуждения, например, 100 000-кратное улучшение по сравнению с непрерывным освещением достигается при использовании импульсов длительностью 100 фс с частотой повторения 80 МГц. Использование таких коротких импульсов и малых рабочих циклов на самом деле необходимо для получения изображения за разумное время при использовании «биологически приемлемых» уровней мощности.

Преимущества микроскопии с многофотонным возбуждением (MEM)

В LSCM с однофотонным возбуждением фотообесцвечивание происходит значительно выше и ниже фокальной (объемной) плоскости; в МЭМ фотообесцвечивание значительно снижено, и засветка лазерным светом происходит только в фокальной плоскости, ограниченном дифракционным пятном.
Повторное сканирование образца в LSCM, особенно с использованием УФ-света, вызывает быструю фотоизомеризацию и высокую фоновую автофлуоресценцию. МЭМ уменьшает эти осложнения, обеспечивая лучшее проникновение инфракрасных длин волн и, таким образом, продлевая жизнеспособность клеток во время получения изображения.
Для метода LSCM требуется специальная УФ-оптика для УФ-зонда возбуждения. МЭМ использует обычную оптику микроскопа.
В LSCM длина волны излучения близка к длине волны возбуждения (около 50-200 нм).В МЭМ излучение флуоресценции происходит на длине волны, существенно меньшей длины волны возбуждения.

Как собирать изображения FRET

При многофотонной визуализации FRET (MP-FRET) мы выбираем соответствующие фильтры и высокочувствительные фотоумножители (ФЭУ) для получения изображений донора и акцептора. Важно отметить, что для уменьшения фотообесцвечивания следует использовать соответствующую среднюю мощность.

Если длина волны возбуждения донора и акцептора неизвестна, процедура определения длины волны возбуждения для выбранной пары FRET выглядит следующим образом: Для MP-FRET титан-сапфировый лазер настраивается на обнаружение максимального и минимального сигнала. для донорных и акцепторных белков, выраженных индивидуально.Длина волны, соответствующая максимальному сигналу донора и минимальному сигналу акцептора, будет использоваться для сбора сигнала FRET от клеток с двойной экспрессией. Например, в случае клеток, экспрессирующих белок C/EBPα, помеченный Cerulean (донор) и Venus (акцептор), длину волны лазера настраивают в диапазоне 700-1000 нм. Максимальный сигнал Cerulean и минимальный сигнал Венеры видны на 820 нм. Максимальный сигнал Венеры и минимальный сигнал Церулеана видны на 920 нм. Следовательно, длина волны возбуждения 820 нм используется для получения изображений FRET из клеток с двойной экспрессией (Cerulean-Venus-C/EBPα).Этот метод выбора длин волн возбуждения донора и акцептора можно использовать для любых возможных пар флуорофоров MP-FRET. Поскольку выбранная длина волны возбуждения донора может также возбуждать (около <10%) присутствующую молекулу акцепторного флуорофора, метод требует корректировки для удаления нежелательного флуоресцентного сигнала на изображении FRET (Elangovan et al., 2003; Periasamy and Day, 2005 - глава 7). ).

Вычитание фона изображения важно для удаления автофлуоресценции, детекторного и оптического шума.Коррекция SBT должна быть реализована, как описано в разделе обработки данных. Требуется семь изображений. Вкратце, (1) одиночные меченые донорские клетки должны возбуждаться длиной волны возбуждения донорной молекулы, и получаются изображения D- и A-каналов. (2) Одна меченая акцепторная молекула должна быть возбуждена длиной волны донора и акцептора, после чего должны быть получены изображения А-канала. (3) Клетка с двойной меткой (D+A) должна быть возбуждена с длиной волны возбуждения донора и получены изображения D- и A-каналов.Длина волны возбуждения акцептора будет использоваться для возбуждения клеток, меченных D+A, и сбора изображения A-канала. Эти семь изображений используются для обработки для получения обработанного или прецизионного изображения FRET (PFRET).

Мощность лазера для возбуждения донора и акцептора может быть разной. Но как только вы отрегулируете мощность донорного лазера (скажем, 10%), это следует использовать всякий раз, когда вы используете длину волны возбуждения донора. Точно так же, как длина волны возбуждения акцептора, если вы используете, скажем, 5% или 10% для длины волны возбуждения акцептора, то та же мощность акцептора (5% или 10%) должна использоваться всякий раз, когда вы используете длину волны возбуждения акцептора.

Коэффициент усиления ФЭУ должен быть одинаковым как для донорного, так и для акцепторного каналов излучения. Важно не насыщать интенсивность пикселей.

Конфигурации фильтров для получения многофотонных изображений для выбранных пар флуорофоров

Флуорофор	Возбуждение (нм)	Эмиссия (нм)
Alexa 488 или Rhodamine	790	515/30 или 590/40
Су3	735	590/70
БФП	740	450/80
eGFP	880	515/30
CFP или Cerulean	820	485/30
YFP или Венера	920	528/50
Бирюзовый (mTFP)	820	485/30
dsRED1	780	590/70
моранжевый	740	590/70
S65T (GFP)	770	515/30

Примеры изображений

Локализация белков BFP- и RFP-C/EBP, экспрессированных в клетках мыши 3T3, с помощью микроскопии 2p-FRET

Клетки с двойной экспрессией (BFP-RFP-C/EBP) возбуждали при 740 нм, а изображения донора (A) и акцептора (B) белков, локализованных в ядре одной живой клетки, получали с помощью одиночного сканирования (медленное сканирование). ).Как поясняется в тексте, была реализована коррекция просвечивания (или перекрестных помех), а затем соотношение было получено для получения изображения FRET, показанного на C. Соответствующие гистограммы показаны под изображениями (D, E, F). Более высокое распределение интенсивности серого на рисунке C по сравнению с E указывает на важность коррекции просачивания и соотношения скорректированных изображений D и A (A/D) для локализации белков. (Донорский синий цвет, нескорректированный FRET-розовый цвет и скорректированные FRET-красные цветные точки) Адаптировано из A.Периасами, Микроскопия и микроанализ, In Press, 2001.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)

Резонансный перенос энергии флуоресценции (более известный как FRET) позволяет обнаруживать сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров.

Это взаимодействие, зависящее от расстояния, достаточно близко, чтобы позволить происходить молекулярным реакциям, и поэтому может предоставить информацию о потенциальных взаимодействиях между мечеными молекулами в клетке.

Содержание

Введение в FRET

Флуоресценция – это световой сигнал, который мы можем обнаружить, когда флуорофор поглощает энергию на определенной длине волны и возбуждается, чтобы излучать свет на более высокой длине волны, возвращаясь в свое основное состояние.

Во время FRET донорный флуорофор возбуждается источником света и передает свою энергию соседнему акцепторному флуорофору. Акцепторный флуорофор поглощает энергию, создавая обнаруживаемый сигнал излучения света.Этот процесс приводит к потере флуоресценции донора и усилению флуоресценции акцептора, оба из которых могут быть измерены. Донорный и акцепторный флуорофоры должны быть близко друг к другу, чтобы процесс FRET был эффективным. Эффективность FRET (E) определяется уравнением E = Ro6 / (Ro6 + r6), где Ro — радиус Фёрстера, а r — фактическое расстояние между двумя флуорофорами.Радиус Ферстера — это расстояние, на котором 50% энергии возбуждения передается от донора к акцептору, а значение Ro обычно лежит в пределах 10–100 Å (1–10 нм). Пары FRET со значением Ro ближе к верхнему пределу этого диапазона часто предпочтительнее из-за повышенной вероятности возникновения FRET.

Спектральное перекрытие . Спектр излучения донорного флуорофора должен перекрываться со спектром поглощения акцепторного флуорофора. Чем больше степень спектрального перекрытия, тем больше вероятность возникновения FRET.

Ориентация диполя . Перенос энергии от донорного флуорофора к акцепторному флуорофору происходит посредством межмолекулярного диполь-дипольного взаимодействия. Пространственная взаимосвязь между дипольным моментом излучения донора и дипольным моментом поглощения акцептора описывается коэффициентом ориентации ø2, который принимает значения от 0 (все диполи перпендикулярны) до 4 (все диполи параллельны). Ориентация диполей между двумя флуорофорами обычно считается случайной из-за быстрого вращения молекул и принимается равной статистическому среднему значению (значение 2/3) для большинства расчетов Ro.

Применение технологии FRET

FRET — чрезвычайно мощный метод выявления потенциальных молекулярных взаимодействий, который можно использовать в таких методах, как проточная цитометрия, иммуноцитохимия, иммуногистохимия и ELISA. FRET также идеально подходит для высокопроизводительного скрининга (HTS), поскольку он прост, чувствителен и легко автоматизируется.

Одним из популярных применений FRET является определение взаимодействия между двумя биомолекулами, например, связывание лиганда с рецептором; сигнал FRET можно обнаружить, только когда биомолекулы находятся в непосредственной близости благодаря событию связывания.

FRET полагается на использование высококачественных маркированных реагентов. В зависимости от предполагаемой установки анализа это могут быть антитела, белки или пептиды.

Оптимальные пары флюорохромов для FRET

Мы определили следующие оптимальные пары FRET, которые можно найти в нашем ассортименте антител, созданные с использованием наборов для конъюгации Lightning-Link® или изготовленные с помощью наших услуг по индивидуальной маркировке для обеспечения полной гибкости анализа:

RPE-APC
RPE-Cy5
RPE-Cy5.

Сравнение Nissan Primera и LADA (ВАЗ) 2115 по характеристикам, стоимости покупки и обслуживания. Что лучше

О таких машинах мечтали в 90-е — 6 ярких примеров — журнал За рулем

ВАЗ‑2108 по имени Caprice фирмы ­Лада-Брокер — пример довольно диковатого отечественного тюнинга раннего периода.

Клеем и скотчем

Волги: длинные и с удобствами

Вариант представительской Волги по имени Персона от компании «Самотлор-НН». Несколько таких машин сохранилось.

Салоны тюнинговых Волг обычно обшивали кожей и по возможности начиняли опциями: от кондиционера до телевизора.

Лады: еще длиннее!

Амадео‑500 — представительская вариация Лады Самары со вставкой в 500 мм.

Самую длинную Ладу — ВАЗ‑21109 Консул — нарастили в колесной базе аж на 650 мм.

В салоне Консула — все мыслимые в те времена удобства. Причем в таком количестве, что гигантского простора не осталось.

Ока: Винни и Астро

Характерный пример «плюшевой» стилистики Оки — микролитражка по имени Винни, спроектированная в Тольятти.

Астро‑11301 — вариация на тему Оки от фирмы «АстроКар» из Набережных Челнов.

Салон Астро‑11301 решили в веселенькой, яркой стилистике. Заодно поставили более удобные сиденья.

ТЮНИНГ ПО-НАУЧНОМУ

Волга-Кортеж, сделанная в конце 1990-х в НАМИ.

Волга-Престиж — обрусевший Jaguar от компании «Престиж-НАМИ».

В США новую Lada Niva поставили в пример дизайнерам Hummer. Видео

Коврики в салон Ниссан Примера 2002-2008 Lada locker

Коврики в салон Ниссан Примера 2002-2008 — Lada locker — extruzion

Автоковрики — автомобильные коврики в салон — Nissan Primera 2002-2008 — Lada locker — extruzion цена в Автошаре: от 979 до 979 грн

Автоковрики Ниссан Примера 2002-2008 — Lada locker — extruzion

Первый муж Лады Дэнс забрал у бывшей жены детей и запрещает им общаться

Флуоресцентно-резонансная микроскопия с переносом энергии (FRET) для визуализации локализации белков живых клеток

Abstract

Доступны дополнительные материалы

Визуализирующая микроскопия FRET

Другие методы визуализации FRET.

Анализ данных FRET

Применение FRET в клеточной биологии

Заключение

Дополнительные материалы

Благодарности

Примечания

Сноски

Ссылки

Резонансный перенос энергии флуоресценции — Химия LibreTexts

Введение

Факторы, влияющие на FRET

Перекрытие спектра

Ориентация переходных диполей

Заключение и ограничения FRET

Сноски

Резонансный перенос энергии флуоресценции – обзор

2.1 Разработка зонда FRET для мониторинга активации каспаз

FRET — Основной центр проточной цитометрии

Применение к датчику Epac cAMP в качестве примера

Введение

Фотофизика

Биология

Обнаружение

Результаты

Основные соображения и конструкции, включенные в исследование

Анализ пары CFP-YFP FRET

Эффект димеризации.

Замена Венеры на YFP.

Различное расстояние между донором и акцептором.

Выравнивание диполя.

Тандемные акцепторы.

Анализ пары CFP-RFP FRET

Мономерные красные акцепторы.

Тандемные акцепторы.

Анализ пары GFP-RFP FRET

Выводы и обсуждение

Методы

Конструкции

Материалы

Культура клеток и трансфекция

Микроскопия

Динамический мониторинг FRET

Визуализация флуоресценции в течение всего срока службы

Многофотонная микроскопия FRET | В.М. Центр сотовой визуализации Кека, Университет штата Вирджиния.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)

Введение в FRET

Применение технологии FRET

Оптимальные пары флюорохромов для FRET

Добавить комментарий Отменить ответ

ВАЗ‑2108 по имени Caprice фирмы Лада-Брокер — пример довольно диковатого отечественного тюнинга раннего периода.