На что влияет впр: В чём смысл Всероссийских проверочных работ. И почему их так не любят учителя

CAS PubMed Google ученый

CAS PubMed Google ученый

CAS PubMed Google ученый

Дифференциальные эффекты Vpr на одноцикловые и распространяющиеся инфекции ВИЧ-1 в CD4 + Т-клетках и дендритных клетках

Abstract

Белок Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) способствует репликации вируса в неделящихся клетках, особенно в клетках миелоидной линии. Однако влияние Vpr на усиление инфицирования ВИЧ-1 в дендритных клетках широко не исследовалось.Здесь мы оценили роль Vpr во время инфицирования высокопермиссивных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) и CD4 ⁺ T-клеток и сравнили ее с ролью дендритных клеток, полученных из моноцитов (MDDC), которые менее восприимчивы к ВИЧ-инфекции. 1 инфекция. Заражение делящихся PBMC и неделящихся MDDC осуществляли одноцикловым и репликационно-компетентным ВИЧ-1, кодирующим интактные Vpr или Vpr-дефектные мутанты. В отличие от предыдущих результатов, мы наблюдали, что одноцикловая инфекция ВИЧ-1 как PBMC, так и MDDC значительно усиливалась в присутствии Vpr, когда вирусные запасы были тщательно охарактеризованы и титрованы.Количественная оценка ДНК ВИЧ-1 показала, что Vpr только усиливает процессы обратной транскрипции и ядерного импорта в одноцикловых ВИЧ-1-инфицированных MDDC, но не в Т-клетках CD4 ⁺ . Однако значительное усиление экспрессии мРНК ВИЧ-1 gag наблюдалось как в Т-клетках CD4 ⁺ , так и в MDDC в присутствии Vpr. Кроме того, комплементация Vpr в вирионы ВИЧ-1 не влияла на вирусную инфекцию MDDCs с одним циклом, что позволяет предположить, что вновь синтезированный Vpr играет значительную роль в облегчении инфицирования ВИЧ-1 с одним циклом.В ходе распространения инфекции Vpr значительно усиливал репликационно-компетентную инфекцию ВИЧ-1 в MDDC, в то время как он умеренно способствовал вирусной инфекции в активированных PBMC. Количественная оценка вирусной ДНК в компетентных к репликации ВИЧ-1-инфицированных PBMC и MDDC выявила аналогичные уровни продуктов обратной транскрипции, но увеличенный ядерный импорт в присутствии Vpr независимо от типов клеток. Взятые вместе, наши результаты показывают, что Vpr оказывает различное влияние на однократные и распространяющиеся инфекции ВИЧ-1, которые зависят от вседозволенности клетки-мишени.

Цитирование: de Silva S, Planelles V, Wu L (2012) Дифференциальные эффекты Vpr на одноцикловые и распространяющиеся инфекции ВИЧ-1 в CD4 ⁺ Т-клетках и дендритных клетках. PLoS ONE 7 (5): e35385. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035385

Редактор: Bassel E. Sawaya, Temple University, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 19 января 2012 г .; Принята к печати: 15 марта 2012 г .; Опубликовано: 3 мая 2012 г.

Авторские права: © 2012 de Silva et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантом (AI068493) L.W. от NIH и программой готовности общественного здравоохранения к инфекционным заболеваниям Университета штата Огайо. Л.В. и С. были частично поддержаны грантами AI078762 и AI098524 L.W. из NIH. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Среди четырех дополнительных белков ВИЧ-1 вирусный белок R (Vpr) широко исследовался благодаря его эффективному включению в частицу вириона, его способности изменять клеточный цикл и его цитопатической природе (см. [1], [2], [3]).Vpr представляет собой небольшой белок из 96 аминокислот, который экспрессируется в инфицированной клетке из провируса в виде продукта позднего вирусного гена из однократно сплайсированной мРНК [4], и эффективно включается в вирусную частицу за счет своего взаимодействия с C- концевой участок p6 предшественника Gag [5]. Благодаря его способности взаимодействовать с многочисленными клеточными белками [6], [7], Vpr было приписано несколько функций. К ним относятся индукция остановки клеточного цикла в фазе G2 [8], трансактивация длинных концевых повторов (LTR) [9], [10], [11], [12], индукция апоптоза [13], усиление верности обратной транскрипции [14] и нарушения иммунной функции хозяина для уклонения от ВИЧ-1 [15], [16].Например, Vpr-связывающий белок (VprBP), также называемый DDB1 (поврежденный ДНК-связывающий белок 1) и Cullin-4 (Cul4) -ассоциированный фактор 1 (DCAF1), важен для регуляции клеточного цикла [7]. Текущая рабочая модель предполагает, что Vpr может быть способен воздействовать на неизвестный регуляторный фактор клеточного цикла для протеасомной деградации посредством рекрутирования комплекса DDB1 / DCAF1 / Cul4A, который позволяет Vpr-опосредованную остановку клеточного цикла в фазе G2 делящихся клеток [17 ], [18], [19], [20]. Однако роль DCAF1 в инфицировании ВИЧ-1 еще предстоит изучить.

Другой ключевой функцией Vpr является его потребность в инфицировании ВИЧ-1 в неделящихся клетках, таких как макрофаги in vitro [21], [22], [23], [24], [25]. Он делает это главным образом за счет того, что играет шапероноподобную роль для импорта пре-интеграционного комплекса, содержащего обратную транскрибируемую вирусную ДНК, в ядро ​​неделящейся клетки, функция, которая, как считается, является избыточной в пролиферирующих клетках, таких как активированный CD4 ⁺ Т-клетки, в которых происходит растворение ядерной оболочки для облегчения интеграции вирусного генома [26].Несколько сообщений предполагают, что другие вирусные компоненты, такие как капсид (CA) [27], [28], интеграза (IN) [29], и центральный лоскут ДНК, который содержит последовательность терминации центрального тракта полипурина (cPPT-CTS) [ 30], [31], необходимы для ядерного импорта вирусной ДНК, особенно в неделящихся клетках. Однако существуют расхождения в отношении участия некоторых из этих вирусных факторов в ядерном импорте [32], [33]. Недавно Rivière et al. выполнили всесторонний анализ, чтобы определить, какой вирусный компонент среди IN, Vpr, MA и cPPT-CTS является жизненно важным для ядерного импорта ДНК ВИЧ-1 в делящиеся и неделящиеся типы клеток [30].Используя псевдотипированный гликопротеин везикулярного стоматита (VSV-G), одноцикловый вектор ВИЧ-1, лишенный всех дополнительных генов, при этом вирусные гены находятся под транскрипционной регуляцией промотора цитомегаловируса, они пришли к выводу, что cPPT-CTS лоскута ДНК был наиболее критичным для ядерного импорта вирусной ДНК в лимфоцитах периферической крови, дендритных клетках, полученных из моноцитов (MDDC) и макрофагах [30]. Они также сообщили, что мутантный вектор ВИЧ-1 с удаленным Vpr был подобен своему Vpr-экспрессирующему аналогу в трансдукции трех первичных типов клеток, которые были протестированы, и не влиял на процесс ядерного импорта.Однако важно отметить, что использование вектора ВИЧ-1, модифицированного промотором, не может полностью отражать управляемую промотором LTR репликацию вируса и экспрессию генов в инфицированных клетках.

Чтобы лучше понять влияние Vpr на инфекцию ВИЧ-1 в условиях высоко пермиссивного и менее пермиссивного типа клеток, мы исследовали роль Vpr в активированных мононуклеоцитах периферической крови (PBMC), CD4 ⁺ T-клетках и MDDC в контекст одноцикловых и репликационно-компетентных инфекций ВИЧ-1.Наши результаты показывают, что Vpr значительно усиливает одноцикловую инфекцию ВИЧ-1 в PBMC, CD4 ⁺ T-клетках и MDDC. Напротив, Vpr значительно усиливает репликацию распространяющейся инфекции ВИЧ-1 в MDDC, но не в PBMC. Наши данные свидетельствуют о явных различиях в роли Vpr в одноцикловой и репликационно-компетентной инфекции ВИЧ-1, которые зависят от пермиссивности и статуса клеточного цикла клетки-мишени.

Результаты

Характеристика Vpr

Чтобы оценить продукцию и инфекционность ВИЧ-1 в присутствии или отсутствии Vpr, мы провели тщательную характеристику и титрование исходных вирусов Vpr ⁺ и Vpr ^—.Люциферазные репортерные провирусные векторы ВИЧ-1 NL-Luc-E ^— R ⁺ (Vpr ⁺ ) и NL-Luc-E ^— R ^— (Vpr ^— ) были использованы для одиночных -цикл вирусной продукции, которые содержат интактную открытую рамку считывания (ORF) Vpr или мутант Vpr со сдвигом рамки, соответственно [21]. Перед получением вируса мы подтвердили, что мутация со сдвигом рамки считывания в ORF Vpr не повлияла аберрантно на экспрессию репортерного гена люциферазы путем трансфекции клеток HEK293T с помощью pNL-Luc-E ^— R ⁺ и pNL-Luc. -E ^— R ^— провирусных плазмид и измерение экспрессии репортера люциферазы.Наши результаты показали, что управляемая LTR экспрессия репортерного гена люциферазы из провирусной плазмиды, удаленной vpr , была аналогична ее экспрессирующей vpr аналогу (фиг. 1A). Затем провирусные плазмиды использовали для создания одноциклового ВИЧ-1, псевдотипированного оболочкой VSV-G, из клеток HEK293T. Сходные уровни капсидного белка p24 были обнаружены в двух вирусных базах (фиг. 1B и таблица 1), что указывает на то, что недостаток Vpr не оказывает значительного влияния на продукцию вируса.Иммуноблоттинг лизированных вирусных частиц ВИЧ-1 Vpr ⁺ и Vpr ^— подтвердил, что Vpr был включен в Vpr ⁺ ВИЧ-1 только из-за интактной ORF, содержащейся в NL-Luc-E ^— R ⁺ вектор (рис. 1Б).

Рисунок 1. Характеристика Vpr ⁺ и Vpr ^— однократных, VSV-G-псевдотипированных запасов ВИЧ-1, полученных из клеток HEK293T.

(A) Количественная оценка экспрессии люциферазы (Luc) из pNL-Luc-E ^— R ⁺ (HIV-1 Vpr ⁺ ) и pNL-Luc-E ^— R ^— (HIV -1 Vpr ^—) конструкции провирусной ДНК в клетках HEK293T.Люциферазную активность определяли через 48 часов после трансфекции плазмиды и нормализовали по содержанию белка. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего значения трех независимых экспериментов. (B) Запасы VSV-G с псевдотипом, HIV-1 Vpr ⁺ и HIV-1 Vpr ^—, полученные из pNL-Luc-E ^— R ⁺ и pNL-Luc-E ^— R ^{. —} были проанализированы иммуноблоттингом на включение Vpr в частицы вириона.

https: // doi.org. каждый вирусный запас. Клетки GHOST / R5 представляют собой клетки остеосаркомы человека, которые экспрессируют CD4 и CCR5 и содержат ген GFP под контролем промотора LTR ВИЧ-2, который экспрессируется во время инфекции ВИЧ-1 посредством трансактивации Tat, действующей как индикатор инфекции [34], [35], [36].Наши результаты подтвердили, что ВИЧ-1 Vpr ⁺ и ВИЧ-1 Vpr ^— были одинаково заразны в линии индикаторных клеток GHOST / R5 (Таблица 1). Сходные активности люциферазы были получены, когда клетки HEK293T были инфицированы этими одноцикловыми вирусами (данные не показаны). Таким образом, экспрессия Vpr не оказывает значительного влияния на однократную продукцию ВИЧ-1 и инфекционность вириона.

Vpr усиливает одноцикловую инфекцию ВИЧ-1 активированных PBMC, первичных CD4

Чтобы изучить роль Vpr в инфицировании ВИЧ-1, мы сравнили инфицирование двумя вирусами на PHA-активированных PBMC, первичных CD4 ⁺ T-клетках и MDDC.Клетки отдельно инфицировали одноцикловым ВИЧ-1 Vpr ⁺ и Vpr ^— при MOI, равном 1, и уровень инфекции отслеживали в течение 7-дневного периода путем измерения экспрессии репортера люциферазы. Инфекция ВИЧ-1 Vpr ⁺ была устойчивой в высоко пермиссивных, активированных PBMC и CD4 ⁺ T-клетках, и пик экспрессии люциферазы был достигнут через 3 дня после инфицирования (dpi) и резко снизился при 5 dpi. (Рис. 2A и 2B). Ранее сообщалось о таком резком снижении экспрессии люциферазы в первичных Т-клетках CD4 ⁺ , инфицированных за один цикл Vpr ⁺ , и его связывают с индуцированным Vpr ингибированием роста и / или гибели клеток [37].Напротив, ВИЧ-1 Vpr ^— не смог установить стойкую инфекцию в обоих первичных типах клеток, о чем свидетельствует количество люциферазы, экспрессируемой из инфицированных клеток при 3 и 5 dpi. При 3 dpi уровень инфицирования ВИЧ-1 Vpr ⁺ был в 5-7 раз выше ( P <0,05), чем у ВИЧ-1 Vpr ^— в PBMC и CD4 ⁺ Т-клетках, соответственно (рис. 2А и 2Б). В менее разрешающих, неделящихся MDDC инфицированность ВИЧ-1 Vpr ⁺ была в 28 раз выше ( P <0.05), чем у HIV-1 Vpr ^— при 7 dpi (рис. 2C). Кроме того, экспрессия люциферазы в MDDC, инфицированных ВИЧ-1 Vpr ⁺ , стабильно увеличивалась в течение 7-дневного периода (фиг. 2C). Однако общая инфекция ВИЧ-1 Vpr ⁺ в PBMC была примерно в 8 раз выше ( P <0,05), чем в MDDC (рис. 2A и 2C). Эти результаты предполагают, что Vpr необходим для эффективного однократного инфицирования ВИЧ-1 как пермиссивных, так и менее пермиссивных типов клеток-мишеней ВИЧ-1.

Рисунок 2. Vpr усиливает однократное инфицирование ВИЧ-1 активированных PBMC, первичных CD4 ⁺ Т-клеток и MDDC.

(A) PHA-активированные мононуклеоциты периферической крови (PBMC), (B) PHA-активированные CD4 ⁺ Т-клетки и (C) дендритные клетки, полученные из моноцитов (MDDC), были инфицированы при MOI 1,0 с помощью одного — цикл ВИЧ-1 Vpr ⁺ / VSV-G и ВИЧ-1 Vpr ^— / VSV-G для проверки роли Vpr в инфекции ВИЧ-1. Экспрессию люциферазы интегрированного провируса в инфицированных клетках оценивали в указанное время и нормализовали по содержанию белка (10 мкг / образец).Представленные данные представляют собой один из трех независимых экспериментов, проведенных для каждого типа клеток от трех разных доноров. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего значения трех образцов. Статистически значимые различия отмечены звездочками ( P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035385.g002

Vpr-опосредованное усиление одноцикловой инфекции ВИЧ-1 не зависит от VSV-G и конвертов Ampho, используемых для вирусного псевдотипирования

Затем мы оценили, потребуется ли для трансформированной линии Т-клеток, такой как клетки CD4 ⁺ HuT / CCR5 [34], присутствие Vpr для установления устойчивой одноцикловой инфекции ВИЧ-1, как это наблюдается с PBMC и первичные CD4 ⁺ Т-клетки.Соответственно, клетки HuT / CCR5 инфицировали VSV-G-псевдотипом Vpr ⁺ и Vpr ^— одноциклового ВИЧ-1 при MOI, равном 1, и инфекцию контролировали по экспрессии люциферазы в течение 7-дневного периода. Подобно тому, что наблюдалось с первичными Т-клетками CD4 ⁺ , инфицирование клеток HuT / CCR5 Vpr ⁺ HIV-1 было в 15 раз выше ( P <0,05) по сравнению с Vpr ^— HIV- 1 инфекция (рис. 3А). Эти результаты были неожиданными, поскольку предыдущее исследование показало, что Vpr не требуется для однократного инфицирования ВИЧ-1 в делящихся клетках [21].

Рисунок 3. Vpr-опосредованное усиление одноцикловой инфекции ВИЧ-1 не зависит от конвертов VSV-G и Ampho, используемых для псевдотипирования вируса.

(A) Клетки HuT / CCR5 были инфицированы при MOI 1,0 одноцикловыми вирусами Vpr ⁺ / VSV-G ВИЧ-1 и Vpr ^— / VSV-G ВИЧ-1. Экспрессию люциферазы интегрированного провируса в инфицированных клетках оценивали в указанное время и нормализовали по содержанию белка (10 мкг / образец). Показанные данные представляют собой один из трех независимых экспериментов, а полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение среднего значения трех образцов.(B) Амфотрофная (Ampho) конверт MLV, псевдотипированная, запасы HIV-1 Vpr ⁺ и HIV-1 Vpr ^—, полученные из pNL-Luc-E ^— R ⁺ и pNL-Luc-E ^— R ^{— Провирусные конструкции} анализировали иммуноблоттингом на наличие Vpr. (C) Клетки HuT / CCR5 были инфицированы при MOI 1,0 с помощью ВИЧ-1 Vpr ⁺ / Ampho и ВИЧ-1 Vpr ^— / Ampho. Экспрессию люциферазы интегрированного провируса в инфицированных клетках оценивали через 3 дня после инфицирования и нормализовали по содержанию белка.Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение среднего значения трех образцов. Статистически значимые различия обозначены звездочками ( P < 0,05) и значением P .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035385.g003

Чтобы исключить возможность того, что Vpr-опосредованное усиление инфекции ВИЧ-1 зависело от типа оболочки, используемой для проникновения вируса, NL-Luc- Запасы вируса одного цикла E ^— были созданы с использованием тех же векторов ВИЧ-1, но с псевдотипом амфотрофной оболочки MLV (Ampho), которая использовалась в предыдущих исследованиях функции Vpr [21], [37].Штаммы вирусов HIV-1 Vpr ⁺ / Ampho и HIV-1 Vpr ^— / Ampho оценивали на включение Vpr в вирион с помощью иммуноблоттинга (фиг. 3B). Исследовали концентрацию капсида p24 ВИЧ-1, инфекционный титр и специфическую инфекционность (таблица 1). Оба запаса вируса содержали одинаковые уровни p24 и инфицировали индикаторные клетки GHOST / R5 аналогичным образом. Затем мы инфицировали клетки HuT / CCR5 с помощью запасов ВИЧ-1 Vpr ⁺ / Ampho и ВИЧ-1 Vpr ^— / Ampho с MOI, равным 1, и оценили экспрессию люциферазы при 3 dpi, поскольку пик инфицирования был достигнут в это время — точка с заражением вирусом псевдотипа VSV-G (рис.3А). Наши результаты показали, что инфицирование ВИЧ-1 Vpr ⁺ / Ampho было примерно в 10 раз выше ( P = 0,00004), чем ВИЧ-1 Vpr ^— / Ampho (рис. 3C). Эти данные предполагают, что одноцикловая инфекция ВИЧ-1 значительно усиливается в присутствии Vpr независимо от типа оболочки гетерологичного вируса, используемой для опосредованного эндоцитозом проникновения вируса.

Количественная оценка уровней видов вирусной ДНК ВИЧ-1, образующихся в клетках-мишенях после одноцикловой инфекции

Чтобы определить, на каком этапе жизненного цикла вируса Vpr играет значительную роль в усилении одноцикловой инфекции ВИЧ-1 как в высоко пермиссивных, так и в менее пермиссивных типах клеток, мы выполнили анализ ПЦР в реальном времени и количественно определили позднюю обратную транскрипцию (поздняя RT ) продукты, круги 2-LTR и интегрированные копии провируса после инфицирования двух типов клеток.Поздние продукты ОТ представляют собой полную вирусную ДНК с обратной транскрипцией. Хотя круги 2-LTR, полученные из полностью подвергнутой обратной транскрипции ДНК ВИЧ-1, являются абортивными продуктами, их можно использовать в качестве суррогатных маркеров для ядерного импорта вирусной ДНК [38]. Количество интегрированной провирусной ДНК в инфицированных клетках определяли с помощью ПЦР в реальном времени на основе Alu-gag [38]. Поскольку мы наблюдали явный дефицит Vpr ^— одноцикловой инфекции ВИЧ-1 в клеточной линии HuT / CCR5 (рис. 3A), который был подобен тому, что наблюдалось в первичных Т-клетках CD4 ⁺ (рис.2Б), мы провели количественный ПЦР-анализ на инфицированных клетках HuT / CCR5 и MDDC.

Наши результаты показывают, что количества продуктов поздней ОТ, которые образуются после завершения процесса обратной транскрипции, были одинаковыми в клетках HuT / CCR5, инфицированных ВИЧ-1 Vpr ⁺ и Vpr ^—, и снижались с аналогичной кинетикой в ​​течение 48-часовой период времени, начинающийся через 24 часа после заражения (рис. 4А). Однако небольшое, но не статистически значимое увеличение ( P = 0.09) в количестве 2-LTR кругов наблюдали через 24 ч после инфицирования в клетках HuT / CCR5, инфицированных ВИЧ-1 Vpr ⁺ (фиг. 4B). Эти данные предполагают, что ядерный импорт ДНК ВИЧ-1 может быть до некоторой степени более эффективным в этих активно делящихся клетках в присутствии Vpr. Однако количество интегрированных копий провирусной ДНК было сходным в клетках HuT / CCR5, инфицированных ВИЧ-1 Vpr ⁺ и Vpr ^—, через 24 и 48 часов после инфицирования с небольшим увеличением через 72 часа в присутствии Vpr ( Инжир.4С).

Рисунок 4. Сравнение профилей вирусной ДНК в одноцикловых клетках, инфицированных Vpr ⁺ / VSV-G ВИЧ-1 и Vpr ^– / VSV-G ВИЧ-1.

Клеточная ДНК была выделена из одноцикловых ВИЧ-1 Vpr ⁺ / VSV-G и ВИЧ-1 Vpr ^— / VSV-G инфицированных клеток HuT / CCR5 (AC) и MDDC (DF) в 24, 48 и Через 72 часа после инфицирования и подвергнутые количественному ПЦР-анализу в реальном времени с использованием наборов праймеров / зондов на основе Taqman, специфичных для количественного определения уровней продуктов поздней обратной транскрипции (Late-RT), 2-LTR кругов и интегрированных копий провирусов.Количество геномной ДНК, используемой для ПЦР, указано на каждой панели. Для каждого образца проводили ПЦР-амплификацию в реальном времени гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы для нормализации количества вводимой ДНК в каждой из реакций амплификации. Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего значения повторяющихся образцов. UD; невозможно обнаружить в текущих экспериментальных условиях. Статистически значимые различия обозначены значениями P . Показанные данные MDDC представляют собой один из трех независимых экспериментов с использованием клеток от трех разных доноров.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035385.g004

В случае MDDC наблюдалось устойчивое увеличение количества продуктов поздней ОТ в инфицированных клетках ВИЧ-1 Vpr ⁺ в течение 72 -h период времени после инфицирования по сравнению с клетками, инфицированными ВИЧ-1 Vpr ^—, где поддерживался постоянный, относительно низкий уровень продуктов поздней ОТ (фиг. 4D). В то время как круги 2-LTR и количество интегрированной провирусной ДНК были выше предела обнаружения (10 копий) только через 72 часа после заражения, это результат более медленной кинетики инфекции и относительно более низкого уровня инфекции в MDDC по сравнению с клетками HuT / CCR5. уровень 2-LTR и интегрированных видов вируса был выше в присутствии Vpr (рис.4E и 4F). Эти результаты предполагают, что Vpr играет более важную роль в усилении процессов обратной транскрипции и ядерного импорта однократной инфекции ВИЧ-1 в MDDC по сравнению с клетками HuT / CCR5.

Vpr значительно увеличивает уровни мРНК

Vpr является известным трансактиватором экспрессии вирусных генов, управляемой LTR [9], [12], и поэтому мы поставили под сомнение увеличение экспрессии репортерного гена люциферазы от интегрированного одноциклового провируса Vpr ⁺ по сравнению с Vpr ^{— Провирус} также может быть связан с Vpr-опосредованным увеличением транскрипции вирусного гена.С этой целью общую клеточную РНК экстрагировали из ВИЧ-1 Vpr ⁺ и Vpr ^— инфицированных клеток HuT / CCR5 и MDDC и подвергали ПЦР в реальном времени для количественного определения уровней мРНК ВИЧ-1 gag , продуцируемых из инфицированные клетки. Мы количественно определили уровни мРНК gag через 3 дня после заражения в клетках HuT / CCR5 и через 4 дня после заражения в MDDC. Эти временные точки были выбраны на основании того, что пик инфицирования одноцикловым ВИЧ-1 произошел в эти временные точки или раньше этих моментов в двух типах клеток (рис.2Б и 2С). Мы наблюдали значительное увеличение (в 7 раз, P <0,05) количества копий gag мРНК в ВИЧ-1 Vpr ⁺ инфицированных клетках HuT / CCR5 и в MDDC по сравнению с ВИЧ-1 Vpr ^— инфицированных клеток (фиг. 5A и 5B, соответственно), что позволяет предположить, что Vpr-опосредованная трансактивация LTR является вероятной причиной усиления экспрессии репортера люциферазы из инфицированных клеток HuT / CCR5 и MDDC.

Рисунок 5. Vpr значительно увеличивает уровни мРНК ВИЧ-1 gag в клетках HuT / CCR5 и MDDC.

Суммарная клеточная РНК была выделена из одноцикловых Vpr ВИЧ-1 ⁺ / VSV-G и ВИЧ-1 Vpr ^— / VSV-G инфицированных клеток HuT / CCR5 (A) и MDDC (B) в точках 3 и 4. дней после инфицирования, соответственно, и подвергали ОТ-ПЦР для количественной оценки уровней gag копий мРНК ВИЧ-1 в каждом типе клеток. Амплификацию гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы также проводили для каждого образца для нормализации количества введенной кДНК в каждой из реакций амплификации.Данные представлены как кратное изменение количества копий мРНК gag относительно образца, инфицированного ВИЧ-1 Vpr ^— / VSV-G, в каждом типе клеток. Статистически значимые различия отмечены звездочками ( P < 0,05). Показанные данные MDDC представляют собой один из двух независимых экспериментов с использованием клеток от двух разных доноров.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035385.g005

Нокдаун DCAF1 в клетках HuT / CCR5 не влияет на одноцикловую инфекцию ВИЧ-1

Чтобы проверить, вовлекает ли Vpr-опосредованное усиление одноцикловой инфекции ВИЧ-1 комплекс DDB1 / DCAF1 / Cul4A и протеасомную деградацию, DCAF1 временно подавлялся в клетках HuT / CCR5 с использованием лентивирусных векторов, экспрессирующих shRNA, специфичных для DCAF1 и Скремблированный вектор shRNA использовали в качестве контроля (рис.6А). Частичное снижение уровней DCAF1 не повлияло на инфицирование Vpr ⁺ ВИЧ-1 и Vpr ⁺ ВИЧ-1 (фиг. 6A и 6B), что позволяет предположить, что Vpr-опосредованное усиление инфекции в клетках HuT / CCR5 не вовлекали рекрутирование комплекса DCAF1 / DDB1 / Cul4A и протеасомную деградацию. Наш результат согласуется с недавним отчетом Pertel и его коллег, в котором они продемонстрировали, что одноцикловая ВИЧ-1-инфекция MDDCs Vpr ⁺ не зависела от DCAF1 [39].

Рисунок 6. Нокдаун DCAF1 в клетках HuT / CCR5 не влияет на одноцикловую инфекцию ВИЧ-1.

Клетки HuT / CCR5 трансдуцировали концентрированным лентивирусом, экспрессирующим либо кшРНК, нацеленную на DCAF1, либо скремблированную кшРНК (контроль). Через три дня после трансдукции фракцию клеток анализировали иммуноблоттингом для подтверждения нокдауна DCAF1 (A), и каждая клетка была инфицирована с MOI 0,5 либо ВИЧ-1 Vpr ⁺ / VSV-G, либо ВИЧ-1 Vpr ^— / VSV-G, чтобы проверить, участвует ли DCAF1 в Vpr-опосредованном усилении инфекции ВИЧ-1 (B).Экспрессию люциферазы в инфицированных клетках оценивали через 3 дня после инфицирования.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035385.g006

Комплементация Vpr не влияет на Vpr-дефектную ВИЧ-1-инфекцию MDDC

Поскольку высокие уровни Vpr могут быть включены в вирионы ВИЧ-1 [5], мы задались вопросом, является ли усиление инфицирования ВИЧ-1 MDDC результатом включения Vpr в вирионы или вновь синтезированного Vpr в инфицированных клетках. Чтобы ответить на этот вопрос, в тестах на инфекцию использовали одноцикловый ВИЧ-1 с комплементацией Vpr.Высокие уровни Vpr были эффективно дополнены Vpr-отрицательным одноцикловым HIV-VSV-G, что подтверждено иммуноблоттингом (фиг. 7A). Однако комплементация Vpr не влияла на однократный цикл инфицирования ВИЧ-1 в MDDC (рис. 7B), что позволяет предположить, что вновь синтезированный белок Vpr в инфицированных MDDC необходим для эффективного инфицирования ВИЧ-1.

Рисунок 7. Комплементация Vpr не влияет на Vpr-дефектную однократную инфекцию ВИЧ-1 в MDDC.

(A) Включение Vpr в VSV-G-псевдотип, одноцикловый HIV-Vpr + и Vpr-комплементарный HIV-Vpr-.Осадки вириона анализировали иммуноблоттингом с анти-Vpr и анти-p24 соответственно. (B) Комплементация Vpr не влияет на однократную ВИЧ-Vpr-инфекцию MDDC. Инфицированные клетки лизировали в указанные сроки после инфицирования для обнаружения инфекции ВИЧ-1 путем измерения активности люциферазы и нормализовали по содержанию белка (20 мкг / образец). cps, отсчетов в секунду. Представленные данные представляют собой один из трех независимых экспериментов, проведенных с тремя отдельными донорами.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0035385.g007

Vpr значительно усиливает репликационно-компетентный ВИЧ-1

Затем мы оценили, может ли Vpr репликационно-компетентного ВИЧ-1 усиливать вирусную инфекцию PBMC и MDDC во время нескольких раундов инфекции. Учитывая, что MDDC более восприимчивы к R5-тропному ВИЧ-1, чем к X4-тропному ВИЧ-1 [40], [41], R5-тропный штамм ВИЧ-1 _NLAD8 был использован для сравнения роли Vpr в ВИЧ. -1 инфекция.Отдельные запасы вируса оценивали на включение Vpr в вирион (фиг. 8A), концентрацию капсида p24, инфекционный титр и относительную инфекционность (таблица 1). Сопоставимые уровни капсидного белка p24 были обнаружены в исходных материалах HIV-1 _NLAD8 WT и ΔVpr, а анализ инфекционности с ограниченным разведением на индикаторных клетках GHOST / R5 подтвердил, что вирус ΔVpr сравним по своей инфекционности с его аналогом WT (Таблица 1) .

Рисунок 8. Vpr значительно усиливает репликационно-компетентную инфекцию ВИЧ-1 _NLAD8 в MDDC.

(A) Исходные вирусы ВИЧ-1 _NLAD8 и ВИЧ-1 _NLAD8ΔVpr , полученные из клеток HEK293T, анализировали иммуноблоттингом на наличие Vpr. (B) PHA-активированные PBMC и (C) MDDC были инфицированы 5 нг и 20 нг p24, соответственно, из вируса HIV-1 _NLAD8 и HIV-1 _NLAD8ΔVpr и уровнями капсида p24, высвобожденного в среду в течение репликацию вируса анализировали в течение 10 дней и 7 дней после инфицирования для PBMC и MDDC соответственно.Показанные данные представляют собой один из трех независимых экспериментов, проведенных с тремя отдельными донорами, а столбики ошибок представляют собой стандартное отклонение трех повторностей инфекций. Статистически значимые различия отмечены звездочками ( P < 0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035385.g008

Для оценки вклада Vpr во время нескольких раундов инфицирования ВИЧ-1, стимулированные PHA PBMC и MDDC были инфицированы 5 нг и 20 нг p24. от каждого типа вируса, соответственно, и уровень инфекции контролировали в течение 7- или 10-дневного периода путем количественного определения продукции p24 в культуральном супернатанте с помощью ELISA.В активированных PBMC вирус ΔVpr реплицировался с несколько меньшей скоростью по сравнению с вирусом WT при 3 и 5 dpi ( P <0,05), причем оба вируса демонстрировали устойчивые инфекции в активированных PBMC при 10 dpi (фиг. 8B). Однако несоответствие между вирусом WT и ΔVpr было более значительным в MDDC, где наблюдалось 3-кратное увеличение ( P <0,05) инфицирования вирусом WT по сравнению с вирусом ΔVpr при 5 dpi (рис. 8C), что обычно является пиком инфекции WT HIV-1 в MDDC [42], [43].Эти результаты предполагают, что во время распространения инфекции действие Vpr по усилению репликации ВИЧ-1 в MDDC по сравнению с PBMC наблюдается более легко.

Сравнение профилей вирусной ДНК в ВИЧ-1

Чтобы лучше понять механизмы, с помощью которых Vpr усиливает распространение инфекции, мы выполнили количественный ПЦР-анализ ДНК, выделенной из PBMC и MDDC, инфицированных WT или ΔVpr HIV-1, для определения уровней поздней RT, 2-LTR кругов и созданных интегрированных копий провирусов. в инфицированных клетках в течение нескольких раундов заражения.Поздние продукты RT достигли пика при 3 dpi как в PBMC, так и в MDDC с умеренным увеличением в присутствии Vpr ( P <0,05) (фиг. 9A и 9D). В обоих типах клеток уровни кругов 2-LTR были выше в присутствии Vpr при 3 dpi (фиг. 9B и 9E). Кроме того, мы измерили интегрированные копии провирусов при 3 dpi в PBMC и наблюдали увеличение в 1,8 раза ( P = 0,04) числа интегрированных копий в клетках, инфицированных вирусом WT, по сравнению с клетками, инфицированными вирусом ΔVpr (рис. 9C). ).Аналогичным образом количество интегрированных копий провирусов было выше в присутствии экспрессии Vpr в MDDC (2,5 раза, P = 0,03) (фиг. 9F). Как и ожидалось, количество интегрированных копий провирусов в MDDC было в 15-20 раз ниже, чем в активированных PBMC (фиг. 9C и 9F). В совокупности наши данные показывают, что Vpr увеличивает ядерный импорт и интеграцию ДНК ВИЧ-1 в PBMC и MDDC, хотя последующая продукция вируса значительно усиливается только в менее разрешающих MDDC.

Рисунок 9.Сравнение профилей вирусной ДНК в клетках, инфицированных ВИЧ-1 _NLAD8 и ВИЧ-1 _NLAD8ΔVpr .

Количественный анализ ПЦР был проведен для определения уровней продуктов поздней обратной транскрипции (Late-RT), 2-LTR кругов и интегрированных провирусных копий в течение 7 дней после инфицирования активированных PBMC (AC) и MDDC (DF) после заражения. инфицирование ВИЧ-1 _NLAD8 и ВИЧ-1 _NLAD8ΔVpr . Для каждого образца проводили ПЦР-амплификацию в реальном времени гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы для нормализации количества вводимой ДНК в каждой из реакций амплификации.Планки погрешностей представляют собой стандартную ошибку среднего значения повторяющихся образцов. Статистически значимые различия обозначены звездочками ( P < 0,05) и P значениями. Представленные данные представляют собой один из трех независимых экспериментов, проведенных для каждого типа клеток от трех разных доноров.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035385.g009

Обсуждение

В текущем исследовании мы сравнили роль вспомогательного белка ВИЧ-1, Vpr, во время одноцикловой и репликационно-компетентной ВИЧ-1 инфекции PBMC, CD4 ⁺ T-клеток и MDDC, типов клеток, которые различаются по статусу клеточного цикла и восприимчивости к ВИЧ-1 инфекции.Одноцикловая инфекция ВИЧ-1 позволяет изучать вирусные и клеточные факторы, влияющие на жизненный цикл вируса ВИЧ-1, вплоть до интеграции вирусной ДНК с последующим образованием вирусных частиц, в которых отсутствует гликопротеин оболочки, тем самым устраняя второй виток заражения внутри организма. клетки-мишени. Во время однократного инфицирования ВИЧ-1 первичных ФГА-активированных PBMC и CD4 ⁺ Т-клеток мы наблюдали, что Vpr значительно усиливает вирусную инфекцию, что противоречит ранее опубликованным результатам Connor et al [21].В этом первоначальном исследовании использовались те же провирусные конструкции, что и в нашем исследовании, но использовалась амфотрофная оболочка MLV для псевдотипирования вируса. Они показали, что в присутствии полибрена, катионного полимера, который используется для усиления ретровирусной инфекции in vitro , вирус Vpr ^— ВИЧ-1 способен инфицировать активированные PBMC, аналогично вирусу Vpr ⁺ ВИЧ-1. как определено экспрессией репортера люциферазы. Напротив, мы не использовали полибрен и тщательно титровали запасы вируса при наших инфекциях.Расхождение в результатах может быть связано с разными экспериментальными подходами, включая титрование вирусов.

Учитывая, что PBMC составляют смешанную популяцию мононуклеарных клеток, таких как CD4 ⁺ и CD8 ⁺ T-клетки, B-клетки, моноциты, дендритные клетки и т. Д., Мы выделили первичные CD4 ⁺ T-клетки из PBMC. и инфицированы одноцикловыми Vpr ⁺ и Vpr ^— ВИЧ-1. Результаты, полученные на первичных CD4 ⁺ Т-клетках, подтвердили наши данные о PBMC и предоставили подтверждающие доказательства того, что Vpr усиливает одноцикловую инфекцию ВИЧ-1 (рис.2Б). Кроме того, псевдотипирование одноциклового вектора Vpr ^— ВИЧ-1 с амфотропной оболочкой MLV показало аналогичный дефект инфекции по сравнению с вирусом Vpr ⁺ / Ampho ВИЧ-1. Наши результаты показали, что отсутствие инфекционности, проявляемое одним циклом, Vpr ^— ВИЧ-1, было связано с пост-проникновением, независимым от типа гетерологичной вирусной оболочки, используемой для опосредованного энодоцитозом проникновения вируса в клетку-мишень.

На основании нашего количественного ПЦР-анализа профилей вирусной ДНК в инфицированных клетках HuT / CCR5 выяснилось, что Vpr не оказывает значительного влияния на уровни продуктов поздней ОТ, 2-LTR кругов и интеграцию вирусной ДНК.В соответствии с хорошо известной способностью Vpr трансактивировать экспрессию вирусных генов, управляемую LTR [9], [10], [25], мы наблюдали, что уровни мРНК gag были значительно увеличены в ВИЧ-1 Vpr ⁺ инфицированных HuT / CCR5. клеток по сравнению с клетками, инфицированными Vpr ^— ВИЧ-1, что, по-видимому, является основным фактором, способствующим усилению инфицирования одноцикловым ВИЧ-1, экспрессирующим Vpr. Более того, наши данные показали, что DCAF1 не требуется для Vpr-усиленной инфекции ВИЧ-1 в клетках HuT / CCR5, что согласуется с недавним отчетом, демонстрирующим, что однократная инфекция ВИЧ-1 в MDDCs не зависит от DCAF1 [39].

DCs имеют общий миелоидный клон, как макрофаги, которые также являются типом клеток-мишеней ВИЧ-1 при начальной вирусной инфекции, и были вовлечены в качестве возможных вирусных резервуаров, содержащих латентный вирус ВИЧ-1 [44]. Подобно DC, макрофаги являются неделящимися клетками, но более восприимчивы к ВИЧ-1 при условии, что Vpr экспрессируется из генома ВИЧ-1 [21], [22], [25]. Макрофаги были исходным типом миелоидных клеток, которые использовались в исследованиях, которые показали, что Vpr необходим для эффективного ядерного импорта ДНК ВИЧ-1 в неделящиеся типы клеток [23], [25].Таким образом, неудивительно, что DC разделяют одинаковую потребность в Vpr для эффективной инфекции ВИЧ-1. Интересно, что мы обнаружили, что в MDDC, инфицированных ВИЧ-1 Vpr ⁺ , количество продуктов поздней ОТ неуклонно увеличивалось в течение оцениваемого времени по сравнению с инфицированными клетками ВИЧ-1 Vpr ^— (фиг. 4D). Учитывая медленную кинетику инфицирования в DCs, можно предположить, что процесс обратной транскрипции происходит более эффективно в присутствии Vpr. Кроме того, на основании низкого уровня инфекции, достигнутого в MDDC, количество кругов 2-LTR и интегрированных провирусных копий превысило предел обнаружения только через 72 часа после инфицирования с результатами, указывающими на увеличение обоих продуктов вирусной ДНК в ВИЧ-1. Vpr ⁺ инфицированных клеток.Подобные результаты были получены ранее для макрофагов, что привело к заключению, что Vpr усиливает ядерный импорт вирусной ДНК в неделящихся клетках [23], [25]. Однако мы также наблюдали повышение уровней мРНК gag в MDDC ВИЧ-1, инфицированных Vpr ⁺ , по сравнению с инфицированными клетками ВИЧ-1 Vpr ^—, что указывает на то, что Vpr способен способствовать экспрессии вирусных генов, управляемой LTR. для усиления однократного инфицирования ВИЧ-1 в ДК. Более того, комплементация Vpr в вирионы ВИЧ-1 не влияла на одноцикловую инфекцию ВИЧ-1 в MDDC, что позволяет предположить, что Vpr-опосредованное усиление инфекции ВИЧ-1 в MDDC осуществляется за счет белка Vpr, синтезируемого при установлении инфекции, но не из-за белок Vpr, связанный с вирусными частицами.Наши результаты согласуются с предыдущим исследованием Vpr в содействии инфицированию ВИЧ-1 первичных моноцитов и макрофагов [21].

Дальнейшее подтверждение роли Vpr в инфицировании ВИЧ-1 в DC было получено с использованием репликационно-компетентных ВИЧ-1 NLAD8 (WT) и NLAD8 (ΔVpr). Однако, по-видимому, Vpr не значительно усиливает репликацию вируса в активированных PBMC, которые более восприимчивы к распространению инфекции по сравнению с MDDC. Это согласуется с более ранним исследованием Rey et al., В котором они сообщили о нарушении ядерного импорта вирусной ДНК в стимулированных PBMC в отсутствие Vpr, что привело к незначительному эффекту производства вируса [45].

Клетки миелоидной линии по своей природе невосприимчивы к ВИЧ-1 инфекции, что объясняется наличием факторов клеточной рестрикции (см. Обзоры в [46], [47]). Недавнее открытие SAMHD1 как клеточного фактора ограничения ВИЧ-1 в миелоидных клетках дает доказательства в пользу такого мнения [48], [49]. SAMHD1-опосредованному ограничению ВИЧ-1 может противодействовать белок SIVmac / HIV-2 Vpx, который отсутствует в ВИЧ-1. SIV / HIV-2 Vpx, но не HIV-1 Vpr, эффективно усиливает трансдукцию лентивирусным вектором, происходящим из SIV / HIV-1, человеческих моноцитов, макрофагов или MDDC (обзор в [46]).HIV-1 и SIVmac Vpr не могут связывать и деградировать SAMHD1 [49], указывая тем самым, что Vpr не способен противодействовать SAMHD1-опосредованной рестрикции HIV-1 в миелоидных клетках. Подобно нескольким линиям Т-клеток CD4 ⁺ [48], клетки Hut / CCR5 не экспрессируют детектируемый белок SAMHD1 (данные не показаны). Несмотря на структурное сходство между Vpx и Vpr из SIVmac, только Vpx, но не Vpr, может эффективно способствовать ВИЧ-1-инфекции макрофагов человека, а аминоконцевой домен Vpx важен для усиления ВИЧ-1-инфекции [50].Остается определить, является ли аминоконцевой домен Vpr ВИЧ-1 критическим для усиления вирусной инфекции. Более того, недавно сообщалось, что APOBEC3A является ингибитором инфекции ВИЧ-1 в миелоидных клетках [51]. Следовательно, ограничение ВИЧ-1 в типах миелоидных клеток может быть связано с множеством факторов хозяина, что еще предстоит подтвердить.

Наши результаты показывают, что Vpr усиливает одноцикловую и репликационно-компетентную инфекцию ВИЧ-1 в MDDC. Остается неясным, связано ли усиление MDDC с противодействием клеточному фактору рестрикции с помощью Vpr, хотя анализ различных ДНК ВИЧ-1 в инфицированных клетках четко не указал точку рестрикции.Более того, многочисленные клеточные взаимодействующие партнеры Vpr были идентифицированы на протяжении многих лет, но ни один из них не был обнаружен как ограничивающий ВИЧ-1 инфекцию (rev. [7], [52]). Возможно, что Vpr-опосредованное усиление ВИЧ-1-инфекции в MDDC происходит не за счет противодействия клеточному рестрикционному фактору с помощью Vpr, а просто за счет синергетического эффекта на различных стадиях жизненного цикла вируса, начиная с обратной транскрипции и заканчивая обратной транскрипцией. с регуляцией вирусных генов. Дальнейшее изучение механизмов, с помощью которых Vpr усиливает инфекцию ВИЧ-1, предоставит новое понимание функции Vpr в вирусном патогенезе.

Материалы и методы

Запасы ВИЧ-1

Одноцикловые запасы репортера люциферазы ВИЧ-1 были получены путем трансфекции клеток HEK293T на основе фосфата кальция с помощью вектора провирусной ДНК pNL-Luc-E ^— R ⁺ , который содержит интактный ген vpr или ген Мутант со сдвигом рамки считывания гена vpr (pNL-Luc-E ^— R ^— ) вместе с конструкцией, экспрессирующей гликопротеин вируса везикулярного стоматита (pVSV-G) [35] или амфотрофный вирус мышиного лейкоза (MLV) гликопротеин оболочки (Амфо).Обе конструкции провирусной ДНК были любезно предоставлены доктором Натаниэлем Ландау (Нью-Йоркский университет). Компетентные к репликации запасы ВИЧ-1 _NLAD8 и ВИЧ-1 _NLAD8ΔVpr были созданы в клетках HEK293T с помощью кальций-фосфатной трансфекции pNLAD8 и pNLAD8 (ΔVpr) соответственно [33], как описано [43]. Уровень p24 во всех исходных вирусах определяли с использованием набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (SAIC-Frederick), а инфекционность каждого исходного вируса, представленного в виде титра инфекционных единиц, определяли ограничивающим разведением на ВИЧ-1. индикатор ячеек GHOST / R5, как описано ранее [35].

Иммуноблоттинг

Для подтверждения включения Vpr в частицу вириона в каждый вирусный запас эквивалентные объемы вирусосодержащей среды (1 мл) ультрацентрифугировали при 35000 об / мин в течение 2 часов при 4 ° C в роторе SW55. Осадок вируса лизировали в 1-кратном буфере для лизиса клеток (Cell Signaling Technology) и подвергали иммуноблоттингу с использованием поликлональных кроличьих антител против Vpr (Программа исследований и эталонных реагентов AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH). Иммуноблоттинг на капсидный белок p24 был также проведен с использованием моноклонального мышиного антитела против p24, как описано [43] (клон № 24-2, Программа исследования и сравнения реагентов AIDS, NIH).

Культура клеток

PBMC и моноцитов были выделены из лейкоцитарной пленки от здоровых доноров крови путем центрифугирования в градиенте гистопака и перколла, как описано ранее [40]. MDDC были получены обработкой моноцитов интерлейкином-4 (50 нг / мл) и фактором, стимулирующим колонии гранулоцитов / макрофагов (50 нг / мл) в течение 5 дней в культуре. Первичные CD4 ⁺ Т-клетки выделяли из PBMC с использованием магнитных шариков, покрытых антителами против CD4 (BD Biosciences). Клеточные линии HEK293T, GHOST / R5 и Hut / CCR5 [34], [53] были любезно подарены Vineet KewalRamani (Национальный институт рака) и поддерживались в определенных средах, как описано ранее [34].

Инфекция ВИЧ-1

Для инфекций вирусами-репортерами одноциклической люциферазы ВИЧ-1 MDDC (2,5 × 10 ⁵ ) инфицировали с множественностью инфекции (MOI) 1 в течение 2 ч при 37 ° C. После этого клетки дважды промывали DPBS и культивировали в течение 7-дневного периода. Активацию PBMC и CD4 ⁺ Т-клеток проводили фитогемагглютинином (PHA; 5 мкг / мл) и IL-2 (20 Ед / мл) в течение 24 ч до инфицирования одноцикловым репортером люциферазы ВИЧ-1 при MOI — 1.На 1, 3, 5 и 7 день после инфицирования клетки собирали, лизировали в 1 × репортерном буфере для лизиса (Promega) и определяли активность люциферазы с использованием коммерчески доступного набора (Promega). Заражение MDDC репликационно-компетентным вирусом HIV-1 _NLAD8 проводили аналогично одноцикловой вирусной инфекции 2,5 × 10 ⁵ PHA-активированных PBMC или MDDC, инфицированных 5 нг и 20 нг p24, соответственно. . Gag p24, высвобожденный в супернатант культуры во время периода инфицирования, оценивали с помощью ELISA, как описано ранее [40].

Количественный анализ ПЦР

Уровни продуктов поздней обратной транскрипции, 2-LTR кругов и интегрированных копий провируса в инфицированных MDDC и активированных PBMC количественно оценивали с помощью количественного ПЦР-анализа в реальном времени на основе Taqman с использованием праймеров и наборов зондов и протоколов, описанных ранее [38]. В частности, 50 нг геномной ДНК из инфицированных ВИЧ-1 клеток использовали в качестве входных данных для обнаружения продуктов поздней обратной транскрипции и 150-250 нг для обнаружения кругов 2-LTR и интегрированной провирусной ДНК.Все исходные вирусы обрабатывали ДНКазой (40 Ед / мл; Ambion) перед инфекциями, чтобы избежать контаминации плазмидной ДНК. ДНК из инфицированных клеток в различные моменты времени выделяли с использованием набора DNeasy Blood and Tissue (QIAgen).

ОТ-ПЦР Обнаружение

клеток HuT / CCR5 и MDDC (2,5 × 10 ⁵ клеток) были инфицированы либо Vpr ВИЧ-1, ⁺ / VSV-G, либо Vpr ВИЧ-1 ^— / VSV-G (MOI 1) и собраны. на 3 день (для клеток HuT / CCR5) и на 4 день (для MDDC) после инфицирования.Полную клеточную РНК выделяли с использованием набора RNeasy Mini (Invitrogen), и 250 нг РНК использовали в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК с использованием набора для синтеза первой цепи Superscript III и праймеров олиго-dT (Invitrogen). Анализ ПЦР в реальном времени на основе Sybergreen был выполнен с использованием gag -специфичных праймеров [38] для количественной оценки уровней копий мРНК gag ВИЧ-1 в каждом типе клеток. В качестве стандартов для ПЦР в реальном времени использовали серийные разведения (от 10 ⁶ до 10 ² копий) плазмиды pNLAD8 для реакции gag .Амплификацию кДНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы также проводили для каждого образца для нормализации количества введенной кДНК в каждой из реакций амплификации.

Опосредованный лентивирусом нокдаун DCAF1 в клетках Hut / CCR5

Лентивирус, необходимый для shRNA-опосредованного нокдауна DCAF1, был получен путем котрансфекции на основе фосфата кальция клеток HEK293T лентивирусным вектором, экспрессирующим кшРНК, специфичным к DCAF-1 (pFG.12.3590) вместе с упаковывающим вектором (pCVM) и вектор, экспрессирующий VSV-G (p-VSV-G).Через два дня после трансфекции среды, содержащие лентивирус, собирали, центрифугировали для удаления клеточного мусора и концентрировали в 5 раз, используя концентратор VIVASPIN 20 с пороговой мощностью 300000 МВт (Sartorius Stedim). После этого концентрированный лентивирус инкубировали с 2 × 10 ⁶ клеток HuT / CCR5 вместе с 10 мкг / мл полибрена в течение 2 ч при 37 ° C. После инкубации клетки дважды промывали 1X DPBS и повторно высевали в клеточную среду HuT / CCR5 и культивировали в течение 3 дней, и нокдаун уровня белка DCAF1 был подтвержден иммуноблоттингом с использованием кроличьих поликлональных антител против VPRBP (DCAF-1). (Proteintech).

Комплементация Vpr в Vpr-дефектном одноцикловом ВИЧ-1

Для создания одноциклового HIV-Luc / VSV-G, дополненного Vpr, клетки HEK293T котрансфицировали конструкцией, экспрессирующей Vpr (pcDNA-Vpr), pNL-Luc-E ^— R ^— и pVSV-G для дополнения Vpr к Vpr-отрицательным вирусам, как описано ранее [21]. Пустой вектор pcDNA использовали в качестве отрицательного контроля при трансфекции.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием теста Стьюдента t с программой Excel.Статистическая значимость была определена как P <0,05.

Благодарности

Мы благодарим доктора Эрика Фрида за конструкции pNLAD8 и pNLAD8 (ΔVpr), доктора Натаниэля Ландау за pNL-Luc-E ^— R ⁺ , pNL-Luc-E ^— R ^— и pcDNA-Vpr конструкции и доктор Винит Кевал Рамани для клеточных линий HEK293T, Hut / CCR5 и GHOST / R5, а также вектор, экспрессирующий амфотрофную оболочку MLV. Мы благодарим Хизер Хой и доктора Кристофера Коулмана за техническую помощь, а также сотрудников лаборатории Ву за полезные обсуждения.Следующие реагенты были получены в рамках Программы исследований и референсных реагентов по СПИДу, Отделение СПИДа, NIAID, NIH: моноклональные антитела p24 к ВИЧ-1 (# 24-2) от доктора Майкла Малима, антисыворотка к Vpr к ВИЧ-1 от доктора Джеффри Коппа. .

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: SdS LW. Проведены эксперименты: SdS. Проанализированы данные: SdS LW. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: VP. Написал статью: SdS VP LW.

Ссылки

1. 1.Le Rouzic E, Benichou S (2005) Белок Vpr из ВИЧ-1: различные роли на протяжении жизненного цикла вируса. Ретровирология 2: 11.
2. 2. Андерсен JL, Planelles V (2005) Роль Vpr в патогенезе ВИЧ-1. Curr HIV Res 3: 43–51.
3. 3. Majumder B, Venkatachari NJ, Srinivasan A, Ayyavoo V (2009) Опосредованный ВИЧ-1 иммунный патогенез: внимание к роли вирусного белка R (Vpr). Curr HIV Res 7: 169–177.
4. 4. Schwartz S, Felber BK, Pavlakis GN (1991) Экспрессия мРНК vif и vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 является Rev-зависимой и регулируется сплайсингом.Вирусология 183: 677–686.
5. 5. Пакстон В., Коннор Р. И., Ландау Н. Р. (1993) Включение Vpr в вирионы вируса иммунодефицита человека типа 1: потребность в области p6 gag и мутационного анализа. J Virol 67: 7229–7237.
6. 6. Lama J, Planelles V (2007) Факторы хозяина, влияющие на восприимчивость к ВИЧ-инфекции и прогрессирование СПИДа. Ретровирология 4: 52.
7. 7. Planelles V, Benichou S (2009) Vpr и его взаимодействия с клеточными белками.Актуальные темы микробиологии и иммунологии 339: 177–200.
8. 8. Rogel ME, Wu LI, Emerman M (1995) Ген vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 предотвращает пролиферацию клеток во время хронической инфекции. Журнал вирусологии 69: 882–888.
9. 9. Gummuluru S, Emerman M (1999) Опосредованная клеточным циклом и Vpr регуляция экспрессии вируса иммунодефицита человека типа 1 в первичных и трансформированных линиях Т-клеток. J Virol 73: 5422–5430.
10. 10. Goh WC, Rogel ME, Kinsey CM, Michael SF, Fultz PN, et al.(1998) Vpr ВИЧ-1 увеличивает вирусную экспрессию путем манипулирования клеточным циклом: механизм отбора Vpr in vivo. Природная медицина 4: 65–71.
11. 11. Agostini I, Navarro JM, Rey F, Bouhamdan M, Spire B и др. (1996) Трансактиватор Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1: взаимодействие с активаторными доменами, связанными с промотором, и связывание с TFIIB. J Mol Biol 261: 599–606.
12. 12. Zhu Y, Gelbard HA, Roshal M, Pursell S, Jamieson BD и др. (2001) Сравнение остановки клеточного цикла, трансактивации и апоптоза, индуцированных генами вируса иммунодефицита обезьян SIVagm и вируса иммунодефицита человека типа 1 vpr.J Virol 75: 3791–3801.
13. 13. Arokium H, Kamata M, Chen I (2009) Связанный с вирионом Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 запускает активацию апоптотических событий и усиливает индуцированный fas апоптоз в Т-клетках человека. J Virol 83: 11283–11297.
14. 14. Mansky LM, Preveral S, Selig L, Benarous R, Benichou S (2000) Взаимодействие vpr с урацил-ДНК-гликозилазой модулирует скорость мутации вируса иммунодефицита человека типа 1 In vivo. J Virol 74: 7039–7047.
15. 15. Маджумдер Б., Джанкет М.Л., Шафер Э.А., Шауберт К., Хуанг XL и др. (2005) Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 нарушает созревание дендритных клеток и активацию Т-клеток: последствия для вирусного иммунного бегства. J Virol 79: 7990–8003.
16. 16. Айяву В., Махбуби А., Махалингам С., Рамалингам Р., Кудчодкар С. и др. (1997) Vpr ВИЧ-1 подавляет активацию иммунной системы и апоптоз посредством регуляции ядерного фактора каппа B. Nature Medicine 3: 1117–1123.
17. 17. Dehart JL, Planelles V (2008) Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 связывает протеасомную деградацию и активацию контрольных точек. J Virol 82: 1066–1072.
18. 18. DeHart JL, Zimmerman ES, Ardon O, Monteiro-Filho CM, Arganaraz ER, et al (2007) Vpr ВИЧ-1 активирует контрольную точку G2 посредством манипулирования протеасомной системой убиквитина. Вирол Дж 4: 57
19. 19. Belzile JP, Duisit G, Rougeau N, Mercier J, Finzi A и др. (2007) Vpr-опосредованная остановка G2 ВИЧ-1 включает убиквитинлигазу DDB1-CUL4AVPRBP E3.PLoS Pathog 3: e85.
20. 20. Hrecka K, Gierszewska M, Srivastava S, Kozaczkiewicz L, Swanson SK, et al. (2007) Лентивирус Vpr узурпирует Cul4-DDB1 [VprBP] E3 убиквитинлигазу для модуляции клеточного цикла. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 11778–11783.
21. 21. Connor RI, Chen BK, Choe S, Landau NR (1995) Vpr требуется для эффективной репликации вируса иммунодефицита человека типа 1 в мононуклеарных фагоцитах. Вирусология 206: 935–944.
22. 22. Баллиет Дж. У., Колсон Д. Л., Эйгер Дж., Ким Ф. М., МакГанн К. А. и др.(1994) Отчетливые эффекты в первичных макрофагах и лимфоцитах дополнительных генов вируса иммунодефицита человека типа 1 vpr, vpu и nef: мутационный анализ первичного изолята ВИЧ-1. Вирусология 200: 623–631.
23. 23. Хайнцингер Н.К., Букинский М.И., Хаггерти С.А., Рагланд А.М., Кевальрамани В. и др. (1994) Белок Vpr вируса иммунодефицита человека 1 типа влияет на ядерную локализацию вирусных нуклеиновых кислот в неделящихся клетках-хозяевах. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 7311–7315.
24. 24. Vodicka MA, Koepp DM, Silver PA, Emerman M (1998) ВИЧ-1 Vpr взаимодействует с путем ядерного транспорта, способствуя заражению макрофагами. Гены Дев 12: 175–185.
25. 25. Суббраманиан Р.А., Кессоус-Эльбаз А., Лодж Р., Забыть Дж., Яо XJ и др. (1998) Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 является положительным регулятором вирусной транскрипции и инфекционности в первичных макрофагах человека. J Exp Med 187: 1103–1111.
26. 26. Dedera D, Hu W, Vander Heyden N, Ratner L (1989) Вирусный белок R вируса иммунодефицита человека типов 1 и 2 незаменим для репликации и цитопатогенности в лимфоидных клетках.J Virol 63: 3205–3208.
27. 27. Ямасита М., Перес О., Хоуп Т.Дж., Эмерман М. (2007) Доказательства прямого участия капсидного белка в ВИЧ-инфекции неделящихся клеток. PLoS Pathogens 3: 1502–1510.
28. 28. Ямашита М., Эмерман М. (2009) Ограничение клеток, нацеленное на вирусные капсиды, нарушает инфекцию неделящихся клеток вирусом иммунодефицита человека 1 типа. Журнал вирусологии 83: 9835–9843.
29. 29. Gallay P, Hope T, Chin D, Trono D (1997) ВИЧ-1-инфекция неделящихся клеток через распознавание интегразы путем импорта / кариоферина.Proc Natl Acad Sci U S A 94: 9825–9830.
30. 30. Ривьер Л., Дарликс Дж. Л., Чимарелли А. (2010) Анализ вирусных элементов, необходимых для ядерного импорта ДНК ВИЧ-1. J Virol 84: 729–739.
31. 31. Ao Z, Yao X, Cohen EA (2004) Оценка роли центрального лоскута ДНК в репликации вируса иммунодефицита человека типа 1 с использованием одноцикловой системы репликации. J Virol 78: 3170–3177.
32. 32. Ямасита М., Эмерман М. (2005) Независимость клеточного цикла ВИЧ-инфекций не определяется известными кариофильными вирусными элементами.Патогены PLoS 1: e18.
33. 33. Freed EO, Englund G, Martin MA (1995) Роль основного домена матрицы вируса иммунодефицита человека типа 1 в макрофагальной инфекции. J Virol 69: 3949–3954.
34. 34. Wu L, Martin TD, Vazeux R, Unutmaz D, KewalRamani VN (2002) Функциональная оценка моноклональных антител DC-SIGN показывает, что взаимодействия DC-SIGN с ICAM-3 не способствуют передаче вируса иммунодефицита человека типа 1. J Virol 76: 5905–5914.
35. 35.Janas AM, Wu L (2009) Взаимодействия ВИЧ-1 с клетками: от вирусного связывания до передачи от клетки к клетке. Curr Protoc Cell Biol Глава 26: Раздел 26 25:
36. 36. Сесилия Д., Кевал Рамани В.Н., О’Лири Дж., Вольский Б., Ньямби П. и др. (1998) Профили нейтрализации изолятов первичного вируса иммунодефицита человека типа 1 в контексте использования корецепторов. J Virol 72: 6988–6996.
37. 37. Planelles V, Bachelerie F, Jowett JB, Haislip A, Xie Y и др. (1995) Судьба провируса вируса иммунодефицита человека типа 1 в инфицированных клетках: роль vpr.J Virol 69: 5883–5889.
38. 38. Dong C, Janas AM, Wang JH, Olson WJ, Wu L (2007) Характеристика репликации вируса иммунодефицита человека типа 1 в незрелых и зрелых дендритных клетках выявляет диссоциируемую цис- и транс-инфекцию. J Virol 81: 11352–11362.
39. 39. Pertel T, Reinhard C, Luban J (2011) Vpx спасает трансдукцию ВИЧ-1 дендритных клеток от антивирусного состояния, установленного интерфероном 1 типа. Ретровирология 8: 49.
40. 40.Wang JH, Janas AM, Olson WJ, KewalRamani VN, Wu L (2007) Коэкспрессия CD4 регулирует DC-SIGN-опосредованную передачу вируса иммунодефицита человека типа 1. J Virol 81: 2497–2507.
41. 41. Смед-Соренсен А., Лор К., Васудеван Дж., Громче М.К., Андерссон Дж. И др. (2005) Дифференциальная восприимчивость к инфекции вируса иммунодефицита человека типа 1 миелоидных и плазмацитоидных дендритных клеток. J Virol 79: 8861–8869.
42. 42. Wang JH, Janas AM, Olson WJ, Wu L (2007) Функционально отличная передача вируса иммунодефицита человека типа 1, опосредованная незрелыми и зрелыми дендритными клетками.J Virol 81: 8933–8943.
43. 43. Coleman CM, Spearman P, Wu L (2011). Тетерин существенно не ограничивает передачу ВИЧ-1, опосредованную дендритными клетками, и его экспрессия повышается за счет вновь синтезированного Nef ВИЧ-1. Ретровирология 8: 26.
44. 44. Coleman CM, Wu L (2009) Взаимодействие ВИЧ с моноцитами и дендритными клетками: латентность вируса и резервуары. Ретровирология 6: 51.
45. 45. Rey F, BouHamdan M, Navarro JM, Agostini I, Willetts K и др.(1998) Роль Vpr вируса иммунодефицита человека типа 1 при инфицировании мононуклеарных клеток периферической крови. J Gen Virol 79 (Pt 5): 1083–1087.
46. 46. Ayinde D, Maudet C, Transy C, Margottin-Goguet F (2010) Обратите внимание на два дополнительных белка ВИЧ / SIV при инфекции макрофагов: затмевает ли Vpx Vpr? Ретровирология 7: 35
47. 47. St Gelais C, Wu L (2011) SAMHD1: новый взгляд на ограничение ВИЧ-1 в миелоидных клетках. Ретровирология 8: 55
48. 48.Laguette N, Sobhian B, Casartelli N, Ringeard M, Chable-Bessia C и др. (2011) SAMHD1 представляет собой специфический для дендритных и миелоидных клеток фактор рестрикции ВИЧ-1, которому противодействует Vpx. Природа 474: 654–657.
49. 49. Hrecka K, Hao C, Gierszewska M, Swanson SK, Kesik-Brodacka M, et al. (2011) Vpx снимает подавление ВИЧ-1-инфекции макрофагов, опосредованной белком SAMHD1. Природа 474: 658–661.
50. 50. Грамберг Т., Сансери Н., Ландау Н.Р. (2010) Доказательства домена активации на аминоконце вируса иммунодефицита обезьян Vpx.Журнал вирусологии 84: 1387–1396.
51. 51. Бергер Г., Дюран С., Фаргье Г., Нгуен С. Н., Кордей С. и др. (2011) APOBEC3A — специфический ингибитор ранних фаз инфицирования ВИЧ-1 в миелоидных клетках. PLoS Pathog 7: e1002221.
52. 52. Planelles V (2011) Объяснение ограниченного доступа к миелоидным клеткам. Вирусы 3: 1624–1633.
53. 53. Wu L, Martin TD, Carrington M, KewalRamani VN (2004) В-клетки Raji, ошибочно идентифицированные как клетки THP-1, стимулируют передачу ВИЧ, опосредованную DC-SIGN.Вирусология 318: 17–23.

Vpr ВИЧ-1 вызывает остановку клеточного цикла и усиливает экспрессию вирусных генов за счет истощения CCDC137

Основные изменения

Хотя в дополнительных экспериментах нет необходимости, авторы должны прокомментировать следующие вопросы:

1) Авторы не обсуждают свои результаты полностью в контексте опубликованных данных о других целях Vpr, что должно быть сделано более полно в Обсуждении и в более подробной форме.Например, во введении утверждение, что ни одна из других потенциальных целей Vpr не влияет на задержку G2, является преувеличением. Гринвуд и др. В статье (2020, Cell Rep.) показано, что нокдаун нескольких белков, которые они идентифицировали как прямые связывающие Vpr, включая SMN1, CDCA2 и ZNF267, увеличивает количество клеток в G2. Были ли какие-либо из них среди кандидатов проверены и были признаны невоспроизводимыми?

Мы признаем, что недостаточно доверяем работе Greenwood et al.документ, который цитировался, но не обсуждался подробно. Это было рассмотрено в отредактированной рукописи, во введении и в обсуждении.

Чтобы ответить на конкретный вопрос, SMN1, CDCA2 и ZNF267, истощение которых, как сообщалось, оказывают умеренное влияние на клеточный цикл Greenwood et al., Мы котрансфицировали фиксированное количество плазмид, экспрессирующих V5-tagged ZNF267, SMN или CCDC137 с различными количествами Vpr. экспрессионная плазмида (0, 25, 50 нг) в клетках 293T (см. изображение ответа автора 1). На основании выводов Greenwood et al., SMN был наиболее интересным кандидатом, поскольку его истощение, как сообщалось, приводило к задержке около 19-30% клеток в G2 / M. Однако, как показано в прилагаемом вестерн-блоте, ни каноническая изоформа SMN (294aa), ни более короткая изоформа (282aa) не были истощены Vpr в условиях, когда CCDC137 (289aa) был глубоко истощен. Уровень экспрессии ZNF267 в трансфицированных клетках был ниже предела обнаружения WB, и поэтому трудно сделать вывод о том, контролирует ли Vpr его стабильность.Однако эффекты истощения ZNF267, описанные в Greenwood et al. бумага крайне скромная. Мы не тестировали CDCA2 (Repo-Man), поскольку он обогащен NK-клетками и Treg-клетками, но не макрофагами, и поэтому маловероятно, что он будет истощен Vpr для повышения экспрессии вирусных генов в макрофагах. Примечательно, что Trinkle-Mulcahy L et al., 2006 показали, что истощение Repo-Man (CDCA2) с использованием РНК-интерференции вызывает апоптоз с небольшим накоплением G2 / M (см. Рисунок 5 этой статьи). Более того, накопление G2M, описанное Greenwood et al.последующее истощение ZNF267 также было очень скромным.

Как сообщают многие авторы, а также Greenwood et al. И др., Многие белки могут быть истощены с помощью Vpr, что отражает тот факт, что Vpr захватывает CRL4 убиквитин-лигазный комплекс, который управляет стабильностью сотен белков. Тем не менее, CCDC137 является единственным белком, который, как было продемонстрировано, обеднен чрезвычайно низкими уровнями Vpr.Истощение ряда белков может способствовать остановке клеточного цикла в различной степени, особенно в условиях сверхэкспрессии Vpr. Однако мы подчеркиваем, что эффективность, с которой Vpr индуцирует истощение CCDC137, и глубокие эффекты истощения CCDC137 на клеточный цикл и экспрессию гена ВИЧ-1, особенно в макрофагах, делают эту мишень Vpr уникальной.

2) Похожий момент заключается в том, что в первом разделе результатов: CCDC137 уже был идентифицирован в Greenwood et al.бумага в качестве прямого связующего как для ВИЧ-1, так и для ВИЧ-2 Vpr. Эта статья была опубликована в апреле 2019 года и была размещена на сайте bioRxiv с июля 2018 года. Это не умаляет прекрасной работы в настоящей статье, которая подтверждает этот успех, но авторы должны заранее признать, что их экран обнаружил тот же белок, что и другой обширный один, и теперь они следят за тем, что было общим. Были ли еще какие-то общие хиты этих двух экранов?

Мы признаем, что недостаточно доверяем работе Greenwood et al.документ, который цитировался, но не обсуждался подробно. Это было рассмотрено в Обсуждении исправленной рукописи. Гринвуд и др. В документе CCDC137 не идентифицирован как связывающий белок Vpr, скорее сообщается, что уровни многих белков (одним из которых был CCDC137) были снижены в клетках, инфицированных ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Гринвуд и др. Не сообщали о последующих экспериментах с CCDC137. и было невозможно различить, было ли снижение уровней CCDC137 причиной или следствием остановки G2 / M.

белков, которые были обнаружены как в нашем скрининге BirA, так и в исследовании Greenwood et al. документ (2019) включает GNL2 (высокий балл), CCNT1 (циклин T1, высокий балл), UTP14A (низкий балл), DNTTIP2 (низкий балл) и PINX1 (низкий балл). Мы протестировали хиты с высокими показателями (GNL2 и CCNT1), но эти белки не были проверены как настоящие мишени Vpr в наших последующих экспериментах. Сообщалось, что нокдаун UTP14A вызывает арест G1, о существовании которого мы не знаем, для DNTTIP2.

3) Проверялась ли мутация Vpr R80A на взаимодействие и деградацию CCDC137? Этот мутант Vpr не вызывает остановки клеточного цикла и действует как доминантно-негативный, что устраняется мутацией Q65R, которая блокирует связывание с DCAF1.Другими словами, Vpr-80A не должен связывать ключевой клеточный белок, участвующий в остановке клеточного цикла. Если это не было проверено, пожалуйста, объясните в тексте любые потенциальные оговорки к настоящему анализу.

Предварительно мы обнаружили, что Vpr R80A сохранил некоторую способность истощать CCDC137 в тестах на временную сверхэкспрессию в клетках 293T, но не в тестах на инфекцию в макрофагах. В соответствии с этим открытием, Vpr R80A не смог усилить экспрессию вирусных генов в макрофагах. Обширный анализ мутантов Vpr находится в процессе (но не может быть завершен в настоящее время) и будет предметом будущих исследований.

Мы не можем формально исключить возможность того, что дополнительные белки, уровень которых снижается при высоком уровне экспрессии Vpr, могут вносить вклад в фенотип остановки G2 / M в трансфицированных клетках. Мы изменили Обсуждение, чтобы принять это предостережение. Тем не менее, мы отмечаем, что наши результаты убедительно свидетельствуют о том, что преимущество, предоставляемое Vpr, заключается в усилении экспрессии вирусных генов, а не в остановке клеточного цикла в G2 / M.

4) Подраздел «Истощение эндогенного CCDC137 в инфицированных ВИЧ-1 клетках»: Вызвал ли SIVmac Vpr остановку G2 в этих клетках? Вызвал ли Vpr ВИЧ-2 уменьшение остановки G2? Важно связать фенотип с эффектами каждого Vpr на уровни CCDC137.

Рецензенты справедливо высказываются. SIVmac Vpr оказывает минимальное влияние на клеточный цикл в инфицированных клетках U2OS человека. ВИЧ-2 Vpr в некоторой степени вызывал остановку G2. Эти данные показаны на Рисунке 4 — приложении 2 к пересмотренной рукописи и согласуются с предыдущими наблюдениями. Важно отметить, что эффекты белков Vpr SIVmac и ВИЧ-2 на уровни CCDC137 действительно коррелируют с их способностью индуцировать клеточный цикл в клетках человека.

5) Рис. 6. Эксперимент, показывающий, что Vpr-устойчивая версия CCDC137 ослабляет Vpr-опосредованную задержку G2, хорош.Однако для того, чтобы эти данные были убедительными, они нуждаются в количественном анализе и некоторой статистике (особенно потому, что эктопическая экспрессия WT CCDC137, по-видимому, имеет эффект относительно «нет»).

Уступил. Количественная и статистическая оценка эффектов сверхэкспрессии мутанта CCDC137, устойчивого к WT и Vpr, на Vpr-индуцированную остановку клеточного цикла показаны на фиг. 6C пересмотренной рукописи.

6) Использование первичных клеток в представленных исследованиях заслуживает одобрения, но вирус дикого типа не используется.Во всех анализах экспрессии гена ВИЧ-1 используется минимальная конструкция ВИЧ, не способная к репликации и вводимая после упаковки и псевдотипирования во многом как лентивирусный вектор. Пожалуйста, устраните этот потенциальный недостаток в тексте.

Мы изменили Обсуждение, чтобы устранить это предостережение. Тем не менее, мы хотели бы указать, что некоторые эксперименты (Рисунок 8 — рисунок в приложении 2) были выполнены с почти полноразмерными провирусными конструкциями (несущими GFP вместо Nef), которые (мы признаем) были введены в макрофаги инфекцией с использованием VSV-G. псевдотипирование.

7) Рисунок 5 — видео 1. Очень трудно оценить сообщаемые эффекты, даже если основной текст говорит вам, что искать. Пожалуйста, прокомментируйте.

Этот комментарий нас озадачил. Для нас очень ясно, что более высокая доля клеток на нижних панелях (трансдуцированных с помощью вектора shRNA, истощающего CCDC137) имеет большее количество клеток с видимым геминином mClover, что указывает на то, что они находятся в G2 (кадр из видео в ответе автора изображение 2)

Vpr ВИЧ-1 противодействует активации врожденного иммунитета, воздействуя на опосредованный кариоферином ядерный транспорт NF-κB / IRF3

Несмотря на множество исследований, изучающих функцию Vpr, четкого механизма того, как HIV-1 Vpr способствует репликации, не появилось, отчасти потому, что фенотипы репликации Vpr не были четко механистически связаны с манипуляциями со специфическими белками-мишенями. Ранние работы связывали ассоциацию Vpr с ядерной мембраной с репликацией в макрофагах, но не в Т-клетках (Connor et al., 1995; Дедера и др., 1989; Fouchier et al., 1998; Hattori et al., 1990; Машиба и др., 2015; Водичка и др., 1998). Ранние работы также отделяли влияние Vpr на клеточный цикл от его ассоциации с ядерной оболочкой с использованием мутантов Vpr, в частности, Vpr F34I, которые, как подтверждено в настоящем документе, подавляли клеточный цикл, но не рекрутировались на ядерную мембрану (Jacquot et al., 2007; Водичка и др., 1998). Мутанты Vpr, которые не локализовались на ядерной мембране, не способствовали репликации макрофагов, что привело авторов к разумному заключению, что Vpr вносит вклад в ядерный транспорт самого вируса.Это наблюдение согласуется с мнением, что Vpr-опосредованная поддержка входа в ядро, как ожидается, будет более важной для неделящихся клеток (макрофагов), чем для быстро делящихся клеток (активированных Т-клеток). Vpr также обычно не требуется для инфицирования клеточных линий, даже если они не делятся (Yamashita and Emerman, 2005).

В дополнительных исследованиях Vpr был связан с антагонизмом чувствительности врожденного иммунитета в макрофагах (Harman et al., 2015), Т-клетках (Vermeire et al., 2016), а также в клетках HeLa, восстановленных для восприятия ДНК с помощью экспрессии STING (Trotard et al., 2016). Здесь мы предлагаем модель, которая объединяет роль Vpr в манипулировании проникновением в ядро ​​с его антагонизмом к передаче сигналов врожденного иммунитета. Мы предполагаем, что взаимодействие Vpr с кариоферином KPNA1 (рис. 7; Miyatake et al., 2016; Nitahara-Kasahara et al., 2007; Vodicka et al., 1998) ингибирует ядерный транспорт активированных IRF3 и NF-B (рис. 5-7 ) и последующие изменения экспрессии генов ниже чувствительности врожденного иммунитета (Рисунки 1–3).Таким образом, Vpr ВИЧ-1 противодействует последствиям активации врожденного иммунитета как производными от ВИЧ, так и не полученными от ВИЧ PAMP. Это объясняет его важность для максимальной репликации в макрофагах, поскольку активированные Т-клетки и большинство клеточных линий плохо реагируют на агонисты врожденного иммунитета, особенно на PAMP на основе ДНК (Рисунок 1; Cingöz and Goff, 2019; de Queiroz et al., 2019; Heiber, Barber, 2012; Xia et al., 2016a; Xia et al., 2016b).

Мы предполагаем, что предыдущие демонстрации Vpr-зависимой репликации ВИЧ-1 в макрофагах, которая зависела от ассоциации Vpr с NPC или с факторами ядерного транспорта, объяснялись ингибированием Vpr врожденной иммунной чувствительности и последующими противовирусными реакциями (Jacquot et al. ., 2007; Водичка и др., 1998). Действительно, теперь мы знаем, что индукция врожденного ответа ВИЧ-1, лишенного Vpr, как ожидается, подавит проникновение вируса в ядро, поскольку индукция IFN MxB в макрофагах вызывает ингибирование проникновения в ядро ​​ВИЧ-1 (Goujon et al., 2013; Kane et al. ., 2013). Таким образом, мы предполагаем, что Vpr напрямую не способствует проникновению в ядро ​​ВИЧ-1. Скорее, он предотвращает ингибирование проникновения в ядро ​​после активации врожденного иммунитета. Мы предполагаем, что Vpr обеспечивает преимущество репликации in vivo , поскольку активация IRF3 и NF-B индуцирует экспрессию воспалительных цитокинов, включая IFN типа 1, и, следовательно, факторов рестрикции, для которых ВИЧ-1 не кодирует антагонисты.Например, помимо MxB, IFN индуцирует IFITM1-3 (Foster et al., 2016) и TRIM5α (Jimenez-Guardeño et al., 2019), все из которых могут ингибировать ВИЧ-1. Соответственно, случайное заражение сотрудника лаборатории Vpr-дефектным изолятом ВИЧ-1 привело к отсроченной сероконверсии, подавлению вирусемии и нормальному количеству Т-клеток без необходимости в противовирусном лечении (Ali et al., 2018).

В большинстве экспериментов, представленных здесь, и в предыдущих исследованиях функции Vpr в клеточных линиях (Yamashita and Emerman, 2005), Vpr не влиял на инфицирование однократных VSV-G псевдотипированных векторов ВИЧ-1, кодирующих GFP.Мы предполагаем, что это связано с тем, что если противовирусные воспалительные реакции, например IFN, запускаются примерно во время инфекции, либо экзогенными сигналами, либо самим ВИЧ-1, то активированные противовирусные эффекторы слишком медленны, чтобы ингибировать эту инфекцию, что есть экспрессия GFP из интегрированного провируса. Таким образом, потребность в Vpr выявляется только путем анализа распространения инфекции в врожденных компетентных клетках, таких как макрофаги, которые могут подавлять репликацию последующих раундов инфекции.

Мы и другие утверждали, что инфекционный геном ВИЧ-1 дикого типа не эффективно воспринимается сенсорами нуклеиновых кислот или не разрушается клеточными нуклеазами, потому что капсид защищает и изолирует геном, регулируя процесс обратной транскрипции во время транспортировки. через враждебную цитоплазматическую среду до удаления оболочки на NPC или в ядре инфицированных клеток (Bejarano et al., 2019; Burdick et al., 2017; Francis et al., 2016; Jacques et al., 2016; Rasaiyaah и другие., 2013; Schaller et al., 2011; Самнер и др., 2020; Башни и Нурсадеги, 2014; Ян и др., 2010; Зила и др., 2019). В самом деле, мы обнаружили, что Vpr может способствовать репликации ВИЧ-1, даже если стимуляция врожденного иммунитета не происходит от производного от ВИЧ-1 PAMP, что здесь проиллюстрировано анализами репликации в первичных макрофагах человека, обработанных cGAMP (Рисунок 1). Мы также обнаружили, что Vpr противодействует эффектам воздействия LPS, РНК и ДНК-лигандов, а также другим вирусным инфекциям, примером которых является вирусная инфекция Сендай, которая сильно активирует чувствительность к РНК и продукцию IFN в макрофагах человека (Matikainen et al., 2000; Фигура 2). Таким образом, Vpr может подавлять сигналы активации, косвенно связанные с инфекцией. Серия недавних исследований продемонстрировала, что инфицированные клетки продуцируют широкий спектр эндогенных PAMP, происходящих из РНК и ДНК. Примеры включают индукцию ретроэлементов при инфекции гриппа (Schmidt et al., 2019), экспрессию псевдогена РНК после заражения вирусом простого герпеса (Chiang et al., 2018) и лиганды RIGI после заражения вирусом герпеса саркомы Капоши (Zhao et al., 2018). Эти исследования предполагают, что вирусы должны быть способны управлять врожденной активацией невирусных PAMP, даже если их собственные PAMP изолированы.Также было описано, что инфекция ВИЧ-1 индуцирует экспрессию ретроэлементов (Jones et al., 2013), что согласуется с потребностью в Vpr для подавления активации врожденного иммунитета ниже эндогенных PAMPs. Кроме того, сероконверсия ВИЧ связана с цитокиновым штормом (Stacey et al., 2009), противовирусный эффект которого может быть смягчен с помощью ассоциированного с частицами Vpr. Таким образом, ВИЧ-1 может использовать Vpr для репликации в среде, активированной врожденным иммунитетом, даже когда его собственные PAMP эффективно изолированы.Связь между бегством от врожденного восприятия и успешной передачей предполагает несколько линий доказательств. К ним относятся в целом низкая частота передачи ВИЧ (Shaw and Hunter, 2012), наблюдение, что передаваемые ВИЧ клоны-основатели особенно устойчивы к IFN (Iyer et al., 2017) и кодируют различные сигнатуры аминокислот Vpr по сравнению с хроническими вирусами. (Rossenkhan et al., 2016), а также сам цитокиновый шторм, связанный с передачей ВИЧ (Stacey et al., 2009). Соответственно, Vpu, Nef и Vif и Vpr противодействуют врожденному иммунитету, усиливая репликацию вируса, что описано в Sumner et al., 2020.

Vpr вызывает деградацию IRF3 (Okumura et al., 2008), но мы не обнаружили деградацию IRF3 в клетках THP-1 в условиях, когда экспрессия генов и ядерный транспорт IRF3 были сильно подавлены (Рисунок 5). Кроме того, помимо подавления ядерного транспорта IRF3, мы обнаружили, что Vpr снижает фосфорилирование IRF3 по S396, но не по S386 (Рисунок 5). Предыдущие исследования показали, что фосфорилирование IRF3 по S386 необходимо и достаточно для активации IRF3 (Lin et al., 1999; Мори и др., 2004; Ширмахер, 2015; Слуга и др., 2003; Сухара и др., 2000; Йонеяма и др., 1998). Таким образом, наши данные согласуются с более сложной картиной активации IRF3 путем фосфорилирования. Возможно, что фосфорилирование по S396 происходит кариоферин или NPC-зависимым путем, который блокируется рекрутированием Vpr в кариоферин. Фосфорилирование IRF3 по S396 было связано с усиленной ассоциацией и мультимеризацией с транскрипционным коактиватором CREB-связывающим белком (CBP / p300), что указывает на более позднюю роль, чем фосфорилирование по S386 (Chen et al., 2008). Возможно, что отсутствие фосфорилирования IRF3 S396 является следствием дефосфорилирования IRF3 по S396, поскольку предотвращается проникновение в ядро.

Ингибирование фосфорилирования IRF3 также согласуется с сообщениями об ингибировании TBK1 с помощью Vpr, хотя это исследование обнаружило ингибирование фосфорилирования TBK1, тогда как мы этого не сделали (Harman et al., 2015). В этом исследовании Vpr способствовал инфицированию макрофагов и дендритных клеток, несмотря на то, что ВИЧ-индуцированное образование сигнальных комплексов врожденного иммунитета, содержащих TBK1, IRF3 и TRAF3, визуализировалось с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.Таким образом, ингибирование TBK1 с помощью Vpr может происходить в дополнение к активности Vpr в отношении ядерного транспорта, потому что TBK1 наблюдается в цитоплазме, а не в ядерной оболочке этих ВИЧ-инфицированных клеток (Harman et al., 2015). В этом исследовании не было обнаружено деградации IRF3, и ВИЧ-1 не индуцировал фосфорилирование IRF3, хотя влияние инфекции на IRF3 с помощью ВИЧ-1 дикого типа и ВИЧ-1, удаленных для Vpr, не сравнивали.

Ожидается, что регуляция ядерного импорта NF-B и IRF3 множественными кариоферинами будет сложной (Fagerlund et al., 2005; Fagerlund et al., 2008; Кумар и др., 2000; Лян и др., 2013). Нацеливание на кариоферины является типичной вирусной стратегией для манипулирования клеточными ответами, но различные способы, которыми вирусы выполняют эту функцию, намекают на сложность, необходимую для подавления врожденных ответов, избегая при этом остановки вирусной транскрипции. Мы предполагаем, что различные механизмы манипулирования NF-κB / IRF3 разными вирусами отражают их зависимость от активации транскрипции, одновременно зависящую от ингибирования одних и тех же факторов транскрипции, активируемых защитными процессами.Мы предполагаем, что каждый вирус специально адаптировался для облегчения репликации, подавляя активацию ингибирующих эффекторов. Неспособность расщепить кариофериновые белки предполагает, что некоторая функция импорта ядра KPNA1 может быть оставлена ​​нетронутой ВИЧ для облегчения более тонких манипуляций с биологией клетки-хозяина (рис. 7). Аналогичная модель ингибирования связывания мишени KPNA для манипулирования ядерным импортом была предложена кристаллической структурой белка VP24 вируса Эбола в комплексе с KPNA5. В этом исследовании предполагается, что VP24 нацелен на сайт связывания KPNA5 NLS, чтобы специфически ингибировать ядерный импорт фосфорилированного STAT1 (Xu et al., 2014).

Очевидно, что тип клеток также играет роль в функции Vpr. Например, в миелоидных клетках (Kogan et al., 2013; Miller et al., 2017) и Т-клетках (Ayyavoo et al., 1997) сообщалось, что Vpr ингибирует NF-B. Другие исследования Т-клеток предполагают активацию NF-B с помощью Vpr для управления вирусной транскрипцией (Liu et al., 2014; Vermeire et al., 2016). В более позднем исследовании Хоттер и его коллеги показали, что экспрессия различных Vprs вируса иммунодефицита приматов в клетках HEK293T может активировать или ингибировать активность NF-B в зависимости от анализа (Hotter et al., 2017). Например, экспрессия Vpr в клетках HEK293T активировала исходный уровень, а TNFα стимулировала экспрессию трансфицированного NF-ĸB-чувствительного репортера, но ингибировала активацию репортера трансфецированным IKKβ. Авторы предположили, что Vpr-опосредованное ингибирование NF-B имеет значение, поскольку Vpr ингибирует репортер IFNβ, активированный инфекцией вируса Сендай, что согласуется с результатами, представленными в данном документе. Мы предполагаем, что тип клетки и стадия жизненного цикла вируса влияют на эффект Vpr на активацию фактора транскрипции.Одна возможность состоит в том, что входящая частица, связанная с Vpr, активна против NF-B, чтобы уменьшить врожденное восприятие, но Vpr, экспрессируемый провирусом в инфицированной клетке, связывается с помощью Gag, который секвестрирует Vpr, снижая дальнейшее ингибирование активированного NF-B, т.е. необходим для текущей вирусной транскрипции (Belzile et al., 2010).

Наши данные также объясняют предыдущие сообщения о подавлении экспрессии котрансфицированных плазмид CMV, управляемых MIEP, с помощью Vpr (Liu et al., 2015b). Ингибирование Vpr транспорта NF-B в ядро ​​для активации MIEP, вероятно, объясняет эти данные, но другая возможность состоит в том, что фактор транскрипции, связанный с цитоплазматической плазмидной ДНК, играет роль в импорте плазмиды в ядро, и именно транспорт плазмиды ингибируется ( Mesika et al., 2001). Нечувствительность к Vpr NF-ĸB-независимого убиквитина и промоторов EF1α (фиг. 6) согласуется с этой моделью, обобщенной на фиг. 7 — приложение к рисунку 1A. Это важно, потому что ингибирование экспрессии трансфицированного плазмидного белка может объяснить эффект котрансфицированного Vpr SIV на передачу сигналов STING и cGAS, о котором недавно сообщалось (Su et al., 2019). Обратите внимание, что на экспрессию STING не влияла коэкспрессия Vpr, но STING экспрессировался с Vpr и NF-ĸB-нечувствительного промотора EF1α (фиг.6), тогда как cGAS, который не измерялся с помощью вестерн-блоттинга, экспрессировался с помощью Vpr и NF. -B-чувствительная (фиг.6) CMV-управляемая плазмида VR1012 (Hartikka et al., 1996). Некоторые эксперименты в Hotter et al., 2017 также могли быть подвержены влиянию этого явления.

Важно отметить, что наши данные согласуются с сообщениями о том, что манипулирование клеточным циклом с помощью Vpr не зависит от взаимодействия с белками кариоферина. Мутант Vpr R80A, который не останавливает клеточный цикл и не манипулирует комплексом SLX4 (Gaynor and Chen, 2001; Laguette et al., 2014), действует в отношении ингибирования врожденного восприятия (Рисунки 3, 5 и 6). Таким образом, мы предполагаем, что взаимодействие SLX4 не играет роли в проявленном здесь антагонизме врожденного иммунитета.Картирование остатков Vpr, которые важны для ингибирования врожденного иммунитета, на структуры, разрешенные с помощью ЯМР и рентгеновской кристаллографии, выявляет потенциально отличный интерфейс от того, нацеленный на UNG2, потому что остатки Vpr 34/35 удалены от сайта связывания UNG2 (Рисунок 3 — приложение к рисунку 1Б, В). Кроме того, UNG2 не был связан с восприятием врожденного иммунитета. Учитывая, что Vpr, как было показано, связывает мотив FxFG в p6 Gag во время включения вириона (Zhu et al., 2004), и мотивы FG в NPC (Fouchier et al., 1998) возможно, что взаимодействие Vpr с белками ядерных пор посредством мотивов FG способствует Vpr-опосредованному ингибированию ядерного импорта IRF3 и NF-B.

In vitro первичные миелоидные клетки ведут себя в соответствии с полученными стимулами. Таким образом, противоречивые результаты между исследованиями, например, требование здесь в cGAMP, но не в других исследованиях, чтобы вызывать Vpr-зависимую репликацию в макрофагах (рисунок 1), можно объяснить различиями в стимуляции миелоидных клеток из-за различий в очистке клеток и используемые методы дифференциации или реагенты.Способы приготовления вирусов, здесь вирусы очищали центрифугированием через сахарозу, также могут быть источником активации клеток-мишеней и экспериментальных вариаций. Мы предполагаем, что цГАМФ индуцировал зависимость Vpr в MDM (рис. 1), потому что клетки не были активированы до добавления цГАМФ, тогда как в других исследованиях базальная активация вызывала Vpr-зависимую репликацию. Репликация в активированных первичных CD4 + Т-клетках, по нашему мнению, не зависела от Vpr в присутствии и в отсутствие cGAMP, который был ингибирующим, что позволяет предположить, что Vpr не может преодолеть передачу сигналов ниже cGAMP в этих клетках.Это означает, что активированные Т-клетки по-разному реагируют на цГАМФ, чем макрофаги, что согласуется с наблюдениями, что в смешанных культурах Т-клеток / макрофагов негативные эффекты цГАМФ на репликацию ВИЧ-1 в основном опосредуются макрофагами (Xu et al., 2016). Сообщалось о Vpr-чувствительной, cGAS-зависимой продукции IFN Т-клетками, что свидетельствует о том, что при определенных обстоятельствах Т-клетки могут воспринимать ДНК ВИЧ-1 через cGAS в Т-клетках (Vermeire et al., 2016). Важно отметить, что в этом исследовании использовалось ингибирование интеграции, чтобы продемонстрировать провирус-зависимое обнаружение ВИЧ-1, что позволяет предположить, что поступающая ДНК ВИЧ-1 не является мишенью cGAS в этом исследовании.Природа PAMP в этих экспериментах остается неясной. Безусловно, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять различные требования к функции Vpr в Т-клетках и макрофагах.

Чувствительность к ВИЧ-1 явно зависит от дозы вируса и, следовательно, от дозы PAMP. Например, Cingoz et al. Сообщили о неспособности ВИЧ-1 с псевдотипом VSV-G (∆Env, ∆Nef, ∆Vpr) активировать зондирование в различных клеточных линиях (Cingöz and Goff, 2019). Однако другие исследования продемонстрировали восприятие ДНК ВИЧ-1 дикого типа с помощью cGAS (Gao et al., 2013; Lahaye et al., 2013), и здесь мы наблюдали cGAS-зависимую, Vpr-чувствительную индукцию репортера CXCL10 или NF-ĸB высокой дозой (MOI 1-3) VSV-G, псевдотипированного одинарного круглого вектора GFP ВИЧ-1 в THP. -1 ячейка (рисунки 1 и 6). Эффект дозы проиллюстрирован на рисунке 1, на котором MOI (0,1–0,3) мало влияет на экспрессию CXCL10 в клетках THP-1. Однако более высокие дозы активировали экспрессию CXCL10, если только вирионы не несли Vpr, и в этом случае индукция CXCL10 подавлялась. Cingoz использовала люциферазу для измерения инфекции, и поэтому MOI неясны, что затрудняет сравнение доз.Обратите внимание, что здесь MOI, рассчитанный по экспрессии GFP, включен в дополнительные данные для большинства экспериментов. Учитывая, что инфекция обычно зависит от воздействия на клетки более чем одной вирусной частицы, что требует десятков частиц даже по самым консервативным оценкам, вполне вероятно, что Vpr, доставляемый частицами, которые в конечном итоге не образуют провирус, способствует подавлению восприятия. Конечно, более низкий MOI требуется для активности Vpr, когда стимуляция исходит от самих вирусных частиц, несущих Vpr (требуется MOI три, рисунок 1C), по сравнению с внешним стимулом (требуется MOI 20, рисунок 1B).Трудно понять, какие MOI действительно имеют отношение к репликации in vivo , но важно отметить, что в наших экспериментах высокие MOI выше одного требуются для активации врожденного иммунитета и Vpr-зависимого антагонизма. Это говорит о том, что инфекция с низким MOI зависит от уклонения сенсора от секвестрации вирусного PAMP внутри интактных капсидов (Jacques et al., 2016), но инфекции с более высоким MOI могут зависеть от Vpr, связанного с частицами, для подавления активации любых экспонированных вирусных PAMP и любых эндогенных PAMP, которые являются индуцированный.

Таким образом, наши открытия связывают Vpr-манипуляции с ядерным транспортом с ингибированием врожденного иммунного восприятия, а не с вирусным ядерным импортом. Они подчеркивают решающую роль ассоциированного с частицами Vpr в подавлении активации врожденного иммунитета на ранних стадиях жизненного цикла вируса и объединяют серию исследований, объясняющих ранее очевидно несвязанные наблюдения. Учитывая сложность активации NF-kB и различные способы, которыми каждый вирус манипулирует защитными транскрипционными ответами, мы предполагаем, что дальнейшее изучение вирусного ингибирования воспалительных реакций, вызванных PAMP, приведет к лучшему пониманию биологии задействованных факторов транскрипции и выделить новые, поддающиеся лечению цели для терапевтических противовоспалительных разработок.

Активация транскрипции ВИЧ дополнительным белком VPR опосредуется коактиватором p300

Аннотация

Дополнительный белок, Vpr, представляет собой связанный с вирионом белок, который необходим для репликации ВИЧ-1 в макрофагах и регулирует экспрессию вирусных генов в Т-клетках. Vpr вызывает остановку развития клеточного цикла при G ₂ / M, предположительно за счет своего воздействия на активность циклина B1⋅Cdc2. Здесь мы показываем, что способность Vpr активировать транскрипцию ВИЧ коррелирует с его способностью вызывать задержку роста G ₂ / M, и этот эффект опосредуется коактиватором транскрипции p300, который способствует кооперативным взаимодействиям между субъединицей Rel A. NF-κB и циклина B1⋅Cdc2.Vpr взаимодействует с p300, который регулирует NF-κB и базальный аппарат транскрипции, чтобы увеличить экспрессию гена ВИЧ. Подобные эффекты наблюдаются в отсутствие Vpr с киназо-дефицитным Cdc2, а сверхэкспрессия p300 увеличивает уровни репликации ВИЧ Vpr ⁺ . Взятые вместе, эти данные подтверждают, что p300, посредством его взаимодействий с NF-κB, базальными транскрипционными компонентами и Cdks, модулируется с помощью Vpr и регулирует репликацию ВИЧ. Регулирование p300 с помощью Vpr обеспечивает механизм усиления вирусной репликации в пролиферирующих клетках после остановки роста за счет увеличения вирусной транскрипции.

ВИЧ очень чувствительна к изменениям клеточной стимуляции, таким как активация клеток цитокинами или прогрессирование клеточного цикла факторами роста. Регуляция клеточного цикла ВИЧ недавно стала очевидной. В частности, Vpr представляет собой кодируемый ВИЧ белок, который влияет на развитие клеточного цикла, либо индуцируя дифференцировку (1), либо вызывая остановку клеточного цикла в контрольной точке G ₂ / M (2–5). Vpr является дополнительным белком ВИЧ массой 14 кДа, который локализуется в ядре и связывается с вирионом, связываясь с карбоксильным концом вирусного белка Gag (6–9).В неделящихся клетках, таких как макрофаги, Vpr играет роль в транслокации ВИЧ в ядро ​​по механизму, отличному от кариоферинового пути, который используется белком вирусного матрикса для ядерной локализации ВИЧ (10, 11). Vpr важен для заметной стимуляции репликации вируса в макрофагах и вызывает умеренное увеличение транскрипции ВИЧ и продукции вируса в Т-лимфоцитах (12–14).

Транскрипция ВИЧ регулируется двумя сайтами κB в вирусном энхансере в длинном концевом повторе (LTR) (15).Эти сайты распознаются семейством факторов транскрипции NF-κB, которые обычно индуцируются в ответ на стресс и инфекцию (см. Ссылку 16). Транскрипционная активность NF-κB в значительной степени контролируется секвестрацией в цитоплазме семейством ингибирующих белков, IκB, и ингибирование снимается, когда IκB фосфорилируются и деградируют в ответ на различные цитокины, включая фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), рост факторы, а также бактериальные и вирусные продукты (см.17). Функция NF-κB также регулируется в ядре другими факторами транскрипции, членами основного транскрипционного аппарата (18) и коактиваторами транскрипции, такими как коактиваторы p300 и CREB-связывающего белка (CBP) (19). Недавно было показано, что активация транскрипции NF-κB регулируется модуляторами прогрессии клеточного цикла. В частности, остановка роста за счет экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы p21 усиливала функцию NF-κB (19). Этот эффект опосредован коактиватором транскрипции p300, который связывается с комплексами циклина E⋅Cdk2, ингибируемыми p21.Таким образом, казалось, что G ₁ / S-специфические регуляторные белки клеточного цикла могут модулировать активность NF-κB и тем самым увеличивать транскрипцию вирусных генов, когда прогрессирование клеточного цикла останавливается.

Механизм активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr не совсем понятен. Vpr ингибирует развитие клеточного цикла в контрольной точке G ₂ / M. Наш предыдущий вывод о том, что задержка роста G ₁ / S влияет на транскрипцию ВИЧ, повысил вероятность того, что остановка роста, вызванная Vpr, также может влиять на его трансактивацию.Поэтому мы исследовали, может ли Vpr влиять на транскрипцию ВИЧ с помощью p300 / CBP за счет его способности вызывать остановку клеточного цикла G ₂ / M. Мы демонстрируем, что Vpr влияет на экспрессию гена ВИЧ посредством своего действия на p300, и что этот эффект коррелирует со способностью Vpr останавливать развитие клеточного цикла. Мы предполагаем, что комплексы циклина B1⋅Cdc2, связанные с p300, являются медиатором этого эффекта. Репликация HIV Vpr ⁺ увеличивается, когда p300 сверхэкспрессируется в инфицированных клетках, что подразумевает коактивацию транскрипции, регулируемую Cdks, в контроле репликации ВИЧ.

МЕТОДЫ

Плазмиды, культуры клеток и ядерные экстракты.

ВИЧ-CAT, RSV-Rel A, CMV-Vpr, CMV-Vpr (ΔATG), CMV-Cdc2 (ΔK), CMV-p300, pBS-3′p300, WT 12S E1A, Δp300 12S E1A и CMV- Все плазмиды экспрессии мутанта Vpr описаны (15, 19, 20, 21, 22). Мутант Vpr, R80A, который был охарактеризован (23), был сконструирован в контексте Hx _bru Vpr (20). Β-галактозидаза вируса саркомы Рауса (RSV) или RSV-β-глобин и щелочная фосфатаза цитомегаловируса (CMV) (VCL-1012 CMV (Vical, Inc.)) векторы использовали в качестве контрольных плазмид-наполнителей для трансфекций RSV-Rel A, CMV-p300 и CMV-Cdc2 (ΔK). Ранее также сообщалось о конструкциях p300 и Rel A pBluescript, используемых для трансляции in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7 (15, 22). Плазмиду CMV-CD2 получали путем лигирования фрагмента Sal I– Hin dIII, содержащего кодирующую область для человеческого CD2, с сайтами Sal I– Eco RV в области множественного клонирования VCL-1012 CMV.Вектор CMV-CD4 получали путем лигирования фрагмента Eco RI– Bam HI, содержащего кодирующую последовательность CD4, с сайтами Pst I– Bam HI в области множественного клонирования VCL-1012 CMV.

Jurkat, UM-316, 293 почечного эпителия и NIH 3T3 (24), а ядерные экстракты получали, как описано ранее (25). Для индукции NF-κB для анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) клетки стимулировали в течение 1 часа 200 ед. / Мл рекомбинантного TNF-α (Genzyme).

Трансфекции и анализы хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT).

клеток Jurkat трансфицировали с использованием DEAE-декстрана, и анализы CAT выполняли через 48 часов после трансфекции, как описано ранее (15). Клетки 293 трансфицировали осаждением фосфатом кальция, и через 72 ч получали ядерные экстракты (25).

клеток NIH 3T3 трансфицировали gAP / DLRIE / DOPE 50/50 (Vical). В частности, клетки высевали до 40% конфлюэнтности за 1 день до трансфекции, дважды промывали Opti-MEM и трансфицировали раствором липид-ДНК, полученным путем объединения 1.5 мл Opti-MEM, содержащего 15 мкг ДНК, плюс 1,5 мл Opti-MEM, содержащего 30 мкл раствора липидов с концентрацией 2 мг / мл. Клетки инкубировали в течение 4 часов, липидный раствор удаляли, добавляли свежую среду и клетки лизировали и анализировали через 48 часов. Из-за различий в эффективности трансфекции, наблюдаемой с этими клетками, 4 мкг RSV-β-галактозидазы было котрансфицировано во всех образцах, и экстракты были нормализованы перед анализом активности CAT на основе активности β-галактозидазы (26).

UM-316 высевали до 20% конфлюэнтности в 6-луночные планшеты за 1 день до трансфекции.Клетки трансфицировали 5 мкг CMV-p300 или пустого контрольного вектора CMV и 0,5 мкг CMV-CD4 с использованием липофектамина (GIBCO / BRL) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ клеточного цикла.

клеток 293 трансфицировали 2,5 мкг CMV-CD2 плюс 7,5 мкг векторов CMV-Vpr. Через 48 часов клетки инкубировали в течение 30 минут с антителом к ​​маркеру клеточной поверхности CD2 (супернатант гибридомы ATCC HB 222), трижды промывали PBS + 2% фетальной телячьей сыворотки, инкубировали в течение 30 минут с изотиоцианатом флуоресцеина мыши. -конъюгированное антитело, и промыли еще три раза.Клетки ресуспендировали в 875 мкл ледяного PBS и фиксировали в течение 1 ч на льду, добавляя 125 мкл холодного PBS, содержащего 2% параформальдегид. Клетки промывали один раз PBS + 2% фетальной телячьей сыворотки, повышали проницаемость в течение 15 минут при 37 ° C с помощью 1 мл 2% Tween 20 в PBS и еще раз промывали. Окрашивание йодидом пропидия проводили путем инкубации клеток в течение 1 ч при 37 ° C в 960 мкл PBS, 2 единицах РНКазы и 40 мкл йодида пропидия (Boehringer Mannheim). Содержание ДНК в CD2-положительных клетках измеряли с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией.

Анализ сдвига электрофоретической подвижности.

EMSA были выполнены с 1,5 мкг ядерного экстракта из клеток 293 и двухцепочечного олигомера с концевой меткой, содержащего один сайт связывания NF-κB, как описано ранее (25). Комплексы анализировали на 5% полиакриламидных гелях в буфере 0,25 × TBE.

Анализ связывания белков и вестерн-блоттинг.

Для связывания с транслированными белками in vitro проводили иммунопреципитацию с антителом против циклина B (SC-245AC, Santa Cruz) или контрольным мышиным IgG1 (M-9269, Sigma) на 50 мкг ядерного экстракта в течение 2 часов.Иммунопреципитированные белки трижды промывали буфером для иммунопреципитации (19), инкубировали с in vitro транслированным карбоксиконцевым p300 (система транскрипции / трансляции кроличьих ретикулоцитов T7 TNT, Promega) и еще трижды промывали буфером для иммунопреципитации. Комплексы анализировали с помощью 8% SDS / PAGE.

Для обнаружения связанных p300, Rel A, циклина B1 и Cdc2 с помощью вестерн-блоттинга иммунопреципитацию проводили на 420 мкг ядерного экстракта, подвергали 8% SDS / PAGE и затем Вестерн-анализу с антителами к p300 (SC-584 и SC-585, Санта-Крус), Rel A (SC-109 и SC-372, Санта-Крус), циклин B1 (SC-245, Санта-Крус) и Cdc2 (SC-54, Санта-Крус).Антитела использовали в концентрации 0,5 мкг / мл, а соответствующее вторичное антитело против кролика или антитело против мыши, связанное с пероксидазой хрена, использовали в разведениях 1: 8000 и 1: 3000 соответственно. Белки визуализировали с помощью системы усиленной хемилюминесценции (Amersham).

ВИЧ-инфекции и анализ обратной транскриптазы.

Трансфицированные CD4-положительные клетки 293 или клетки UM-316 в 6-луночных планшетах для культивирования тканей инфицировали ВИЧ _bru Vpr ⁺ или ВИЧ _bru Vpr ^— путем инкубации клеток с вирусом в течение 4 часов при 37 ° C. при кратности заражения 0.05–0.1. После инкубации с вирусом клетки дважды промывали D-PBS и добавляли свежую DMEM до конечного объема 4 мл.

Супернатанты культур анализировали на активность обратной транскриптазы (RT), как описано ранее (27). Поли (A) / олиго (dt) использовали в качестве матричного праймера, и включение [ ³² P] dTTP измеряли после нанесения 3 мл реакционной смеси RT на бумагу DE81, сушки и четырехкратной промывки в 2 × SSC. раствор при 22 ° C. Радиоактивность анализировали на бетаскопе Betagene (Waltham, MA), и активность выражали в имп / мл супернатантов культуры.Были выполнены тройные анализы RT, и значения выражены как среднее ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Чтобы изучить механизм активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr, мы сначала определили, коррелирует ли способность Vpr вызывать остановку роста с активацией транскрипции ВИЧ. Клетки лейкемии Jurkat T трансфицировали вектором, кодирующим ген хлорамфениколацетилтрансферазы, контролируемым энхансером ВИЧ (HIV-CAT), и векторами экспрессии, кодирующими либо дикого типа, либо мутантные формы Vpr.Мутант R80A, который не может арестовывать клетки, но сохраняет способность перемещаться в ядро ​​(23), и два дополнительных мутанта, R73S и S79I / R80D, которые аналогичны ранее охарактеризованным мутантам клеточного цикла (23), были протестированы в этих условиях. эксперименты. Также была исследована мутация E25K, которая нарушает ядерную локализацию и включение вириона Vpr, но обеспечивает эффективную репликацию вируса (20). В клетках 293 E25K ингибировал развитие клеточного цикла через 48 часов, тогда как способность R80A, R73S и S79I / R80D задерживать клетки были нарушены (рис.1 А ). Клетки 293 использовали для документирования остановки роста из-за достигнутой высокой эффективности трансфекции, и было труднее оценить эти эффекты в клетках Jurkat, которые плохо трансфицированы; однако предыдущие исследования показали сходные фенотипы остановки клеточного цикла с помощью Vpr и нескольких мутантов в клетках Jurkat (3, 28). Заражение клеток Jurkat ВИЧ, содержащим мутацию R80A или E25K, также использовалось для подтверждения того, что Vpr R80A не вызывает остановки клеточного цикла и что Vpr E25K действительно задерживает клетки (R.В КАЧЕСТВЕ. и E.A.C., неопубликованные данные), что аналогично результатам для 293 клеток, представленных здесь.

Vpr транскрипции ВИЧ с помощью Rel A коррелирует с его способностью регулировать развитие клеточного цикла. ( A ) У мутантов Vpr, дефектных по G ₂ / M задержка роста, нарушена их способность активировать транскрипцию ВИЧ.Для анализа распределения клеточного цикла клетки 293 котрансфицировали pCMV-CD2, вектором экспрессии, кодирующим антиген CD2, CMV-Vpr дикого типа и указанными мутантными формами Vpr. CD2-положительные клетки анализировали с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией. Обозначены отношения популяций клеток G ₂ / M к G ₁ . Для анализа трансактивации Vpr клетки Jurkat трансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,2 мкг RSV Rel A и 1 мкг CMV-Vpr (WT), CMV-Vpr (R80A), CMV-Vpr (R73S), CMV-Vpr (S79I / R80D) или CMV-Vpr (E25K).Использовали контрольные плазмиды, так что каждая трансфекция получала 0,2 мкг RSV и 1 мкг плазмид CMV. Значения представлены как кратность активации по сравнению с базальной активностью ВИЧ-CAT, а столбики ошибок представляют собой SEM. ( B ) Vpr не может активировать энхансер ВИЧ в клетках NIH 3T3, которые не могут быть арестованы с помощью Vpr. Клетки NIH 3T3 котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,5 мкг RSV-Rel A и 1 мкг CMV-Vpr, где указано. Контрольные плазмиды использовали так, чтобы каждый образец содержал 0,2 мкг RSV и 1 мкг плазмид CMV.

Для анализа усиления транскрипции клетки Jurkat котрансфицировали каждым вектором экспрессии Vpr и Rel A для обеспечения постоянной экспрессии NF-κB и активации транскрипции ВИЧ (рис. 1). А ). И Vpr дикого типа, и мутант E25K стимулировали активность ВИЧ-CAT (рис. 1). А ; p = 0,001 для Vpr и p = 0,044 для E25K по сравнению с нетранслированным отрицательным контролем, Vpr (ΔATG), парным тестом t ), что позволяет предположить, что ядерная локализация и включение вириона Vpr не требовались для активации Транскрипция ВИЧ с помощью Vpr; однако способность R80A, R73S и S79I / R80D к трансактивации нарушена, что свидетельствует о корреляции между трансактивацией и функциями остановки клеточного цикла Vpr.Экспрессию Vpr подтверждали вестерн-блоттингом (данные не показаны).

Чтобы дополнительно изучить, коррелирует ли остановка клеточного цикла с помощью Vpr с трансактивацией энхансера ВИЧ, мы проанализировали влияние Vpr на активность ВИЧ-CAT в клетках NIH 3T3, рост которых не задерживается с помощью Vpr (3). Клетки NIH 3T3 трансфицировали HIV-CAT и CMV-Vpr в присутствии или в отсутствие Rel A. В отличие от эффектов Vpr в клетках Jurkat, не наблюдали активации HIV-LTR в клетках NIH 3T3 в присутствии Впр (рис.1 Б ). Кроме того, когда Rel A котрансфицировали для обеспечения постоянных количеств ядерной активности NF-κB, в этих клетках не наблюдали трансактивации с помощью Vpr. Таким образом, неспособность Vpr блокировать клетки NIH 3T3 в G ₂ / M коррелировала с отсутствием активации транскрипции ВИЧ, дополнительно предполагая, что активность Vpr по остановке роста G ₂ / M необходима для его функции трансактивации.

Для анализа конкретных цис -действующих элементов промотора ВИЧ, участвующих в трансактивации Vpr, мы затем исследовали, может ли Vpr влиять на базальную и TNF-индуцированную транскрипцию ВИЧ.Клетки Jurkat трансфицировали ВИЧ-CAT и увеличивающимися количествами вектора экспрессии Vpr. Затем клетки либо оставляли нестимулированными, либо стимулировали TNF-α. Vpr индуцировал дозозависимое увеличение активности CAT в присутствии или в отсутствие TNF-α (рис. 2). А ). Чтобы определить влияние Vpr на специфические области энхансера, клетки Jurkat котрансфицировали Vpr и HIV-CAT, содержащими различные мутантные cis -действующие регуляторные элементы. Несмотря на уменьшение в отсутствие сайтов κB, мутантный энхансер κB оставался чувствительным к Vpr (рис.2 B ), предполагая, что NF-κB способствует трансактивации с помощью Vpr, но не несет полной ответственности за этот эффект. Напротив, не наблюдали индукции с использованием мутантного репортера ΔκB / ΔTATA, предполагая, что базальный транскрипционный аппарат также необходим для трансактивации с помощью Vpr. Поскольку мутантный репортер ΔκB / ΔTATA реагирует на другие вирусные трансактиваторы (29), было очевидно, что и сайты κB, и TATA-бокс необходимы для ответа на Vpr.Влияние Vpr на индукцию NF-κB было проанализировано биохимически. Ядерные экстракты клеток 293, трансфицированных контрольными плазмидами или плазмидами, экспрессирующими Vpr или Tax, анализировали с помощью EMSA. Экспрессия Vpr не вызвала значительного изменения активности связывания ДНК κB, в отличие от известного активатора HTLV-1 Tax (21, 30, 31), который увеличивал комплексы NF-κB (рис. 3). А ). Вестерн-блоттинг подтвердил, что Vpr существенно не изменяет уровни ядерного Rel A (1.В 3 раза выше контроля) (рис. B ), и при иммунопреципитации не было обнаружено прямого взаимодействия с Rel A (данные не показаны).

Определение цис--действующих сайтов, которые опосредуют стимуляцию Vpr транскрипции ВИЧ. ( A ) Vpr стимулирует активность усилителя ВИЧ.Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT и указанными количествами CMV-Vpr. Контрольный вектор Vpr (ΔATG) использовали так, чтобы каждый образец получал эквивалентное количество плазмиды экспрессии CMV. Через сорок два часа после трансфекции клетки стимулировали в течение 6 часов TNF-α (+ TNF-α) или оставляли нестимулированными. ( B ) Последовательности κB и TATA необходимы для трансактивации Vpr. Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг HIV-CAT, (ΔκB) HIV-CAT или (ΔκB / ΔTATA) HIV-CAT и 1 мкг CMV-Vpr, где указано.Использовали контрольные плазмиды, так что каждый образец содержал 1 мкг векторов CMV. Значения представлены как кратная активация Vpr над базальным уровнем каждого репортера в отсутствие Vpr.

Vpr не влияет на связывание ДНК или ядерную транслокацию NF-κB. ( A ) Vpr не индуцирует связывание ДНК NF-κB.Ядерные экстракты из клеток 293, трансфицированных 7,5 мкг отрицательного контроля, CMV-Vpr с удаленным ATG (контроль) (дорожки 1–3), CMV-Vpr (дорожки 4–6), LTR-Tax (дорожки 7–9), или стимулированные TNF-α, анализировали с помощью EMSA с использованием меченного на конце ³² P двухцепочечного олигонуклеотидного κB-зонда. Немеченые мутантные ДНК и ДНК-конкуренты κB дикого типа (100 нг) были включены, как указано. ( B ) Vpr не индуцирует ядерную транслокацию Rel A. Ядерные экстракты из клеток 293, трансфицированных 7,5 мкг мутанта CMV-ATG отрицательного контроля Vpr (контроль) (дорожка 1) или CMV-Vpr (дорожка 2), анализировали на ядерную локализацию Rel A с помощью вестерн-блоттинга.Денситометрический анализ показал, что RelA было в 1,3 раза выше в клетках, трансфицированных Vpr.

Обнаружение того, что трансактивация Vpr происходит как через сайты κB, так и через TATA-бокс, позволяет предположить, что Vpr может регулировать функцию транскрипционного коактиватора, такого как p300, который связывается как с NF-κB, так и с компонентами TFIIB и TBP базальный транскрипционный аппарат (19). Чтобы исследовать роль p300 в активации энхансера ВИЧ с помощью Vpr, продукт гена аденовируса E1A был использован для ингибирования p300-зависимой активации гена.Форма 12S белка E1A аденовируса связывается и инактивирует p300 (32–36), ингибируя базальный и TNF-α-индуцированный NF-κB (37). 12S E1A дикого типа и мутант, связывающий p300 12S E1A, котрансфицировали ВИЧ-CAT и Vpr в Т-клетках Jurkat. 12S E1A дикого типа подавляла активацию с помощью Vpr; однако мутант 12S E1A, который не может связывать p300, не смог проявить этот репрессивный эффект (рис. 4). A ), предполагая, что p300 необходим для активации транскрипции ВИЧ с помощью Vpr. Чтобы определить, необходим ли p300 для активации базального транскрипционного аппарата с помощью Vpr, котрансфицировали (ΔκB) HIV-CAT, Vpr и 12S E1A дикого типа или связывающий мутант p300 12S E1A.Как наблюдалось ранее, активация (ΔκB) HIV-CAT с помощью Vpr была ниже, чем наблюдаемая с HIV-CAT; однако эффекты E1A на (ΔκB) HIV-CAT были аналогичны эффектам, наблюдаемым в случае HIV-CAT. Дикий тип, но не связывающий мутант p300 12S E1A, ингибировал Vpr-опосредованную (ΔκB) активацию HIV-CAT (рис. 4). B ), предполагая, что p300 необходим для активации транскрипции ВИЧ через базальные компоненты транскрипции.

p300 стимулирует транскрипцию ВИЧ.( A ) 12S E1A дикого типа, но не мутант, связывающий p300 12S E1A, ингибирует активацию энхансера ВИЧ с помощью Vpr. Клетки Jurkat котрансфицировали 2 мкг ВИЧ-CAT, 0,5 мкг CMV-Vpr и 2 мкг 12S E1A дикого типа или мутанта, связывающего p300 12S E1A, как указано. При необходимости использовали соответствующие контрольные плазмиды. Значения представлены как кратная активация по сравнению с базальным уровнем ВИЧ-CAT. ( B ) 12S E1A дикого типа, но не 12S E1A, связывающий мутант p300 ингибирует (ΔκB) активность HIV-CAT.Клетки Jurkat котрансфицировали 2 мкг (ΔκB) HIV-CAT, 0,5 мкг CMV-Vpr и либо 2 мкг 12S E1A дикого типа, либо мутантом, связывающим p300 12S E1A, как указано. При необходимости добавляли контрольные плазмиды. Значения представлены как активация, кратная базовому уровню активности HIV-CAT. ( C ) p300 и Vpr действуют вместе, активируя энхансер ВИЧ. Клетки Jurkat котрансфицировали 5 мкг ВИЧ-CAT, 0,2 мкг RSV-RelA, если указано, 1 мкг CMV-Vpr, если указано, и возрастающими количествами CMV-p300.При необходимости трансфицировали соответствующие контрольные векторы. Значения представляют собой процент превращения хлорамфеникола в анализе CAT.

Для дальнейшего изучения роли p300 в трансактивации Vpr клетки Jurkat котрансфицировали Vpr, Rel A (для обеспечения постоянного ядерного NF-κB) и увеличивающимися количествами вектора экспрессии p300. p300 оказывал дозозависимую стимуляцию в комбинации с Vpr, Rel A и Vpr плюс Rel A, а комбинация Vpr / Rel A / p300 была больше, чем аддитивная (в 100 раз) по сравнению с эффектом p300 плюс Vpr (в 36 раз) или p300 plus RelA (16-кратный) (рис.4 С ). Эти данные свидетельствуют о том, что Vpr, Rel A и p300 действуют согласованно, чтобы активировать транскрипцию ВИЧ.

Затем был исследован механизм регуляции p300 с помощью Vpr. Было показано, что соактиватор p300 стимулирует транскрипцию ВИЧ в присутствии ингибитора циклинзависимой киназы p21. Rel A связывается с концом NH ₂ p300, тогда как комплексы циклин E / Cdk2 связываются с концом COOH p300. Было показано, что Vpr вызывает остановку роста благодаря своей способности ингибировать активность киназы Cdc2.Циклин B1 также был обнаружен на низких уровнях в иммунопреципитации Rel A (19), что повышает вероятность того, что циклин B1⋅Cdc2 также может взаимодействовать с p300. Поэтому мы исследовали, может ли p300 взаимодействовать с комплексами циклин B1⋅Cdc2.

Иммунопреципитации проводили с контрольными антителами или антителами к циклину B1 на ядерных экстрактах из клеток Jurkat, а in vitro транслировали COOH-терминальный р300, были связаны с циклином B1⋅Cdc2, но не для контроля иммунопреципитации (рис.5 А ). Это взаимодействие было подтверждено in vivo в стимулированных TNF ядерных экстрактах Jurkat путем иммунопреципитации циклина B1 и вестерн-блоттинга для p300 (фиг. Б ). Хотя p300 не был обнаружен с помощью контрольных антител, он легко обнаруживался в иммунопреципитатах циклина B1. Вестерн-блот-анализ для Rel A тех же иммунопреципитированных комплексов показал, что Rel A также присутствует в комплексах циклин B1⋅Cdc2⋅p300, но не в контрольных иммунопреципитациях (рис.5 Б ). Присутствие как циклина B1, так и Cdc2 в этих комплексах было подтверждено аналогичной иммунопреципитацией циклина B1 с последующим вестерн-блот-анализом с использованием антител к циклину B1 и Cdc2 (рис. С ). Таким образом, казалось, что комплексы циклина B1⋅Cdc2⋅p300⋅Rel A существуют in vivo . Vpr также, по-видимому, не влиял на общий уровень связывания циклина B1⋅Cdc2 с p300 (рис. 5). D ).

Cyclin B1⋅Cdc2, p300 и Rel A связаны в один и тот же комплекс, на который не влияет избыточная экспрессия Vpr и влияние киназо-дефицитного Cdc2 на p300-зависимую транскрипцию ВИЧ.( A ) Комплексы циклин B1⋅Cdc2 связывают p300 in vitro . Иммунопреципитации из ядерных экстрактов Jurkat с использованием контрольных антител (дорожка 2) или антител к циклину B1 (дорожка 3) инкубировали с in vitro транслированным карбоксиконцевым p300, промывали и анализировали с помощью SDS / PAGE. Дорожки 1 и 4 показывают 10% введенного in vitro , транслированного p300. ( B ) Комплексы циклин B1⋅Cdc2 связывают p300 in vivo . Иммунопреципитацию проводили на ядерных экстрактах из клеток Jurkat, которые были обработаны TNF-α в течение 1 часа контрольным антителом (дорожка 5) или антициклином B1 (дорожка 6).Комплексы промывали и подвергали вестерн-анализу с использованием антител против р300 ( верхний ) или анти-Rel A ( нижний ). Дорожка 4 содержит 10 мкг ядерного экстракта Jurkat. ( C ) И циклин B1, и Cdc2 обнаруживаются в иммунопреципитации циклина B1 из ядерных экстрактов. Иммунопреципитации контрольным антителом (дорожка 8) или антителом к ​​циклину B1 (дорожка 9) проводили на ядерных экстрактах Jurkat и подвергали вестерн-блот-анализу с использованием антител к циклину B1 ( верхний ) или Cdc2 ( нижний ).Дорожка 7 содержит 10 мкг ядерного экстракта Jurkat. ( D ) Экспрессия Vpr не влияет на связывание циклина B1-p300. Клетки 293 трансфицировали отрицательным контролем, CMV-Vpr с удаленным ATG (контроль) (дорожки 10–12) или CMV-Vpr (дорожки 13–15), и иммунопреципитацию проводили с контрольными (C) антителами (дорожки 10 и 13). антитела p300 (дорожки 11 и 14) и антитела к циклину B1 (дорожки 12 и 15). Иммунопреципитированные комплексы подвергали Вестерн-блоттингу на р300. ( E ) Экспрессия Cdc2 с дефицитом киназы активирует транскрипцию ВИЧ через клетки Jurkat p300, котрансфицированные 5 мкг HIV-CAT, 1 мкг CMV-Cdc 2 (ΔK), где указано, или 2 мкг E1A 12S дикого типа или мутант, связывающий 12S E1A p300, как показано.Значения представлены как процент ацетилированного хлорамфеникола в анализе CAT.

Поскольку считается, что Vpr оказывает свой эффект на задержку роста за счет ингибирования активности киназы Cdc2, а циклин B1⋅Cdc2 был обнаружен в связи с p300, мы затем определили, может ли мутант Cdc2 с дефицитом киназы, Cdc2 (ΔK), влиять на ВИЧ. активация транскрипции p300. Клетки Jurkat котрансфицировали HIV-CAT, экспрессионной плазмидой, кодирующей Cdc2 (ΔK), которая, как было показано ранее, блокирует клетки в фазе G ₂ / M клеточного цикла (38), и 12S E1A дикого типа или 12S E1A p300. связывающий мутант.Сверхэкспрессия Cdc2 (ΔK) стимулировала активность ВИЧ-CAT, предполагая, что прямое ингибирование Cdc2 имеет такой же эффект на транскрипцию ВИЧ, что и непрямое ингибирование Cdc2 с помощью Vpr. Котрансфекция оптимальных количеств Vpr и Cdc2 (ΔK) не обеспечивала синергетической активации, и этот эффект снижался в отсутствие сайтов κB, как видно с Vpr (данные не показаны), что свидетельствует о насыщении пути активации, общего для Vpr и Cdc2. . Кроме того, активация транскрипции ВИЧ с помощью Cdc2 (ΔK) ингибировалась 12S E1A дикого типа, но не мутантом, связывающим p300 (рис.5 E ), предполагая, что трансактивация HIV-LTR посредством ингибирования Cdc2 происходит через p300. Таким образом, ингибирование связанной с p300 активности Cdc2 усиливает активацию транскрипции с помощью Rel A и p300, и вполне вероятно, что Vpr действует посредством этого механизма.

Ингибирование Vpr-опосредованной активности энхансера ВИЧ путем секвестрации p300 с помощью E1A и участие Vpr в репликации ВИЧ предполагают, что p300 также может участвовать в репликации ВИЧ.Чтобы определить, может ли p300 регулировать репликацию ВИЧ, клетки CD4–293, высокотрансфицируемая клеточная линия, которая является высоко пермиссивной для ВИЧ, трансфицировали CMV-p300 или контрольной плазмидой CMV. Затем эти клетки инфицировали ВИЧ _bru Vpr ⁺ , и репликацию вируса измеряли в дни 0, 2 и 4 путем количественной оценки активности обратной транскриптазы (RT). В присутствии CMV-p300 наблюдалось постепенное увеличение p300 по сравнению с контрольными трансфицированными клетками с 6-7-кратным увеличением через 4 дня после заражения (рис.6 A , p = 0,041, парный тест t ), существенная разница, учитывая высокую репликацию вируса в этих клетках (39). Хотя клетки CD4–293 содержат E1A, который ингибирует функцию p300, уровни сверхэкспрессии p300 смогли преодолеть до уровней эндогенного E1A, что было исследовано с помощью окрашивания серебром и вестерн-блоттинга (данные не показаны). Чтобы подтвердить этот эффект в отсутствие E1A, использовали высокотрансфицируемую E1A-отрицательную клеточную линию меланомы, UM-316.Клетки UM-316 котрансфицировали CD4 и p300 или контрольными векторами экспрессии, а затем инфицировали ВИЧ _bru Vpr ⁺ или ВИЧ _bru Vpr ^—. Активность обратной транскриптазы была определена количественно через 4 дня после заражения и продемонстрировала, что репликация ВИЧ _bru Vpr ⁺ была в 4,3 раза выше в присутствии p300, тогда как репликация ВИЧ _bru Vpr ^— практически не изменилась в присутствии p300. (Рис. 6 Б ).Эти результаты демонстрируют, что Vpr и p300 взаимодействуют для увеличения репликации ВИЧ во время острой инфекции в пролиферирующих клетках.

p300 активирует репликацию ВИЧ _bru Vpr ⁺ . ( A ) Динамика активации p300 репликации ВИЧ, стимулированной p300. Клетки 293, экспрессирующие молекулу CD4, трансфицировали 6 мкг CMV-p300 или контрольной плазмидой CMV без вставки.Клетки заражали ВИЧ через 24 часа, и репликацию измеряли с помощью анализов RT через 0, 2 и 4 дня после заражения. Активность RT выражается в виде средних значений ± стандартное отклонение трех анализов. ( B ) p300 дифференциально регулирует репликацию ВИЧ _bru Vpr ^— и ВИЧ _bru Vpr ⁺ . Клетки UM-316 трансфицировали 0,5 мкг CMV-CD4 и либо 5 мкг контрольного вектора CMV, либо CMV-p300, как указано. Клетки инфицировали ВИЧ _bru Vpr ^— или ВИЧ _bru Vpr ⁺ через 24 часа, и репликацию вируса измеряли на 4 день с помощью анализов RT.Активность RT выражается в виде средних значений ± стандартное отклонение трех анализов.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы показываем, что активация транскрипции ВИЧ с помощью Vpr коррелирует с его способностью арестовывать клетки в G ₂ / M и опосредуется модуляцией функции транскрипционного коактиватора, которая реагирует на Cdks. Предыдущие исследования показали, что уровни РНК ВИЧ увеличиваются во время фазы G ₂ / M клеточного цикла (40), подтверждая мнение о том, что Vpr связывает вирусную транскрипцию с пролиферацией клеток.Таким образом, основная роль Vpr в Т-клетках может заключаться в координации изменений в развитии клеточного цикла с увеличением экспрессии вирусных генов через p300 / CBP.

Мы обнаружили, что Vpr оказывает свое влияние на энхансер ВИЧ через p300, поскольку ингибирование функции p300 с помощью 12S E1A, но не мутанта 12S E1A, неспособного связывать p300, устраняет способность Vpr активировать NF-κB. Кроме того, сверхэкспрессия p300 увеличивает способность Vpr активировать NF-κB и энхансер ВИЧ. Vpr, который ингибирует активность циклина B1⋅Cdc2 (3-5, 28), не связан напрямую с p300, но вместо этого регулирует активность циклина B1⋅Cdc2, которая, как мы показали, взаимодействует с COOH-концом этого соактиватора.В соответствии с этими наблюдениями, Cdc2 с дефицитом киназы стимулирует аналогичное увеличение активации транскрипции ВИЧ и ингибируется 12S E1A дикого типа, но не мутантом связывания p300 12S E1A, обеспечивая связь между Cdc2 и NF-κB посредством p300 в регуляции. транскрипции ВИЧ. Механизм, с помощью которого Vpr ингибирует активность Cdc2, полностью не изучен; однако белок Cdc25, который активирует Cdc2, неактивен в клетках, экспрессирующих Vpr (5), что позволяет предположить, что белки, которые обычно контролируют Cdc2, модулируются Vpr, что, в свою очередь, влияет на транскрипцию ВИЧ.Наши эксперименты с мутантом Vpr E25K, у которого нарушена ядерная локализация, но сохраняется способность арестовывать клетки, предполагают, что Vpr регулирует Cdc2-регуляторные белки, которые находятся в цитоплазме клетки и, кроме того, подтверждают косвенную роль Vpr в модуляции Cdk. который взаимодействует с p300 в ядре, влияя на транскрипцию NF-κB.

В прикрепленных макрофагах, которые не пролиферируют, основная роль Vpr, по-видимому, заключается в локализации преинтеграционного комплекса в ядре (10, 11).Способность Vpr влиять на транскрипцию ВИЧ в макрофагах не проверялась; однако наши результаты предполагают, что Vpr не может в дальнейшем индуцировать функцию усилителя ВИЧ в макрофагах, поскольку его способность останавливать клеточный цикл не нужна в непролиферирующих клетках, а NF-κB уже максимально индуцируется в этих клетках (41). В этих клетках, следовательно, вероятно, что NF-κB уже регулируется клеточными факторами, которые контролируют клеточный цикл и присутствуют в покоящихся клетках с помощью механизмов, независимых от Vpr.Однако, если макрофаги пролиферируют, вполне вероятно, что Vpr может влиять на транскрипцию ВИЧ посредством остановки клеточного цикла. Также недавно сообщалось, что Vpr репрессирует некоторые промоторы цитокинов, регулируемые NF-κB (42). Обобщение этих результатов, выполненных на клетках рабдомиосаркомы, неизвестно и, вероятно, будет отличаться от представленных здесь. В частности, эти эффекты затрагивали различные гены-мишени в клеточной линии, обычно не инфицированной ВИЧ.

Контроль активности NF-κB с помощью E1A хорошо изучен, и E1A стимулирует развитие клеточного цикла путем связывания и инактивации клеточных белков, таких как pRb, p107 и p300.Напротив, Vpr, по-видимому, ингибирует развитие клеточного цикла и увеличивает активность белков (p300 / CBP), которые ингибируются E1A. В отличие от E1A, Vpr, по-видимому, не связывается с p300, но активирует белок посредством непрямого механизма. Интересно, что p300, по-видимому, является молекулой, которая является точкой преобразования для этих вирусных белков, а также для путей передачи клеточного сигнала (43). Кроме того, p300 регулирует множество факторов транскрипции, не связанных с NF-κB, включая CREB (44), YY1 (45), Myb (46, 47), Jun (48), Fos (49), Sap1a (50), Stat2. (51), миогенные факторы транскрипции (52, 53), ядерные рецепторы (54) и p53 (55, 56), предположительно благодаря его способности регулировать структуру хроматина путем ацетилирования гистонов (57, 58).Также остается вероятным, что p300 может взаимодействовать с другими белками, кодируемыми ВИЧ, которые действуют на разных стадиях жизненного цикла вируса. Например, Tat также участвует в транскрипции ВИЧ и взаимодействует с основными компонентами транскрипционного комплекса. p300, благодаря своей способности реагировать на изменения клеточной пролиферации и клеточной активации, таким образом, может играть важную роль в репликации ВИЧ, координируя изменения в развитии клеточного цикла с транскрипцией специфических вирусных и клеточных генов.

Благодарности

Мы благодарим г-жу Донну Гшвенд и г-жу Нэнси Барретт за их помощь в подготовке рукописи и рисунков. Грегори Эндерс, Джим Кох и Эд Харлоу за дефицитную по киназе экспрессионную плазмиду Cdc2, д-р Ксавье Дантинн за помощь в анализе клеточного цикла и д-р. Нилу Перкинсу, Джонатану Беттсу, Марии Атанассиу и другим членам лаборатории Набель за полезные обсуждения. Работа поддержана грантами Совета по медицинским исследованиям и Fonds pour la Formation de Chercheurs et l’Aide à la Recerche (E.A.C.), Комиссии по продвижению молодых ученых и ученых Цюрихского университета, Швейцария (M.O.H.), и стипендии для докторантов из Программы обучения иммунопатологии Мичиганского университета и Института исследований рака (L.K.F.).

Сноски

• ↵ ‡ Кому следует обращаться с запросами на перепечатку: Отделения внутренней медицины и биологической химии, Медицинский институт Говарда Хьюза, Медицинский центр Мичиганского университета, 1150 W.Медицинский центр Драйв, 4520 MSRB I, Анн-Арбор, MI 48109-0650. электронная почта: gnabel {at} umich.edu.

• Этот документ был направлен напрямую (Трек II) в Proceedings Office.

• Сокращения: TNF — фактор некроза опухоли; CBP, связывающий белок CREB; LTR, длинный концевой повтор; EMSA, анализ сдвига электрофоретической подвижности; CAT, хлорамфениколацетилтрансфераза; ЦМВ, цитомегаловирус; RSV, вирус саркомы Рауса.

• Авторские права © 1998, Национальная академия наук

Доказательства Vpr-зависимой репликации ВИЧ-1 в человеческих CD4 + CEM.NKR T-клетках