Лада в будущем: Официальный сайт LADA

АВТОВАЗ: главные достижения 2020 года

Фото: АВТОВАЗ

Ведущий российский автопроизводитель АВТОВАЗ, входящий в Госкорпорацию Ростех, подвел итоги уходящего года. В 2020 году предприятие продолжило модернизацию производства, выпустило 30-миллионный автомобиль, внедорожник Niva снова стал выпускаться под маркой LADA, появились новые модификации во всех семействах автомобилей – все это стало весомым ответом на вызовы уходящего года, ставшего самым сложным в современной истории для мировой автомобильной индустрии. 

Развитие бренда LADA 

LADA 4х4 с новым интерьером

Год открылся стартом продаж обновленной LADA 4х4: заслуженный автомобиль стал значительно комфортней. Здесь были улучшены сиденья, панель приборов, обивки салона, расширен пакет шумоизоляции. Таким образом инженеры реализовали актуальный запрос рынка. Немаловажна и безопасность, поэтому все LADA 4х4 получили систему ЭРА-ГЛОНАСС.

Примечательно, что новый интерьер гармонично сочетается с классическим, узнаваемым стилем LADA 4х4. 

XRAY Cross: первая LADA с сервисами Яндекс.Авто

XRAY Cross получил специальную версию Instinct, оснащенную системой Яндекс.Авто. Ситуация на дорогах, навигация, музыка и видео, социальные сети и подкасты, голосовой помощник Алиса – теперь водителю доступно множество сервисов. Для удобства пользования экран мультимедиа увеличен с 7 до 8 дюймов. Не забыт стиль автомобиля – XRAY Cross Instinct получил черную крышу и контрастную отделку в черном глянце. Наконец, LADA XRAY Cross Instinct стал первой LADA, продажи которой стартовали в онлайн-режиме. Наряду с противопандемийными мерами на производстве и в автосалонах, это стало еще одной противовирусной программой LADA: при желании автомобиль можно заказать, купить и получить, не выходя из дома. 

LADA Largus Cross и Granta Cross в специальной серии Quest

Специальная модификация, ориентированная на любителей путешествий, появилась сразу в двух семействах. LADA Largus Cross Quest отличается новыми сиденьями с трехступенчатым подогревом, улучшенной шумоизоляцией, а на LADA Granta Cross Quest применена контрастная отделка, а также практичная водоотталкивающая обивка сидений. Непременный атрибут специальной серии – контрастный стиль и шильды с названием Quest. 

Спецсерия [BLACK]: энергия черного цвета

Сразу три модели получили специальное исполнение [BLACK]: Vesta Cross, XRAY Cross и 4×4. Все автомобили специальной серии отличаются черными акцентами интерьера и экстерьера в сочетании с оригинальными деталями и бейджами с надписью [BLACK], а также выгодной ценой на пакеты опций. LADA Vesta Cross [BLACK] создана на базе комплектации Comfort c «зимним» пакетом, включающим такие опции, как подогрев лобового стекла, передних сидений и рулевого колеса в практичной отделке из экокожи. Также предусмотрены черная крыша, контрастный рисунок колесных дисков, черная обивка потолка и специальная ткань сидений.

 

LADA XRAY Cross [BLACK], помимо стильных черных элементов дизайна, оснащена мультимедиасистемой с популярными сервисами Яндекс.Авто, 4G-модемом и камерой заднего вида. 

4х4 [BLACK] был создан на базе комплектации Urban, но теперь его черные корпуса зеркал выгодно дополняют полностью черные колесные диски и темная обивка потолка и сидений. 

LADA Niva Travel: популярный внедорожник вернулся в семью

Летом модель Niva cнова стала выпускаться под маркой LADA, а уже декабре было запущено серийное производство новой LADA Niva Travel. Внедорожник получил новый оригинальный дизайн кузова, защитного обвеса и светотехники. При этом LADA Niva остается настоящим внедорожником с системой постоянного полного привода, возможностью механической блокировки межосевого дифференциала и включения понижающего ряда передач. 

Новый LADA Largus: будущее уже рядом

Обновленная LADA Largus выйдет в 2021 году, но в конце 2020 года было показано первое изображение этого универсала. Автомобиль приобрел узнаваемый X-дизайн, а также новый салон с улучшенной эргономикой. 

50 лет первому автомобилю 

Выпуская новые модели, АВТОВАЗ бережно сохраняет историю марки LADA. 19 апреля исполнилось 50 лет с момента сборки первых ВАЗ-2101 – этот юбилей отметили заводчане и любители марки LADA. Поздравил сотрудников АВТОВАЗа и президент России Владимир Путин. 

ВАЗ-2101 стал самой массовой моделью за историю автопрома России (4,8 млн машин). За 50 лет освоено более 50 серийных моделей LADA. 

В 2020 году юбилею LADA было посвящено ежегодное ГУМ-Авторалли. 100 автомобилей ВАЗ-2101, 2102, 2103 и 2106 1970-х годов производства стартовали от стен Кремля и проехали 80-километровый маршрут ретроралли по самым красивым местам столицы. 

Символично, что именно в год 50-летия выпуска первых LADA был изготовлен 30-миллионный автомобиль LADA. Юбиляром стала LADA Granta, и в этом торжестве заслужено принял участие ВАЗ-2101 из заводского музея.  

Признание экспертов 

LADA Vesta занимает второе место по результатам продаж в России (после Granta), но первое по количеству отраслевых наград. 

В 2020 году LADA Vesta SW Cross стала лауреатом Ежегодной профессиональной премии «Внедорожник года». Автомобиль выиграл в номинации «Компактные моноприводные кроссоверы». LADA Vesta SW Cross отличается динамичным стилем с внедорожными элементами – это черный пластиковый обвес кузова и 17-дюймовые колеса с контрастным рисунком спиц. Также LADA Vesta SW Cross обладает дорожным просветом в 203 мм, системами антипробуксовки и помощи при старте на склоне, что делает автомобиль приспособленным к сложным дорожным условиям. 

Также в 2020 году LADA Vesta снова получила звание автомобиль года в России. По итогам голосования флагман модельного ряда LADA стал победителем в номинации «Малый класс». 

Спортивные достижения 

Пилоты команды LADA Sport ROSNEFT провели свой лучший сезон, став чемпионами в личном и командном зачетах во всех классах и дисциплинах, где принимали участие – в кольцевых гонках, ралли и картинге.  

Основные успехи гонщиков заводской команды связаны с Российской серией кольцевых гонок, где Кирилл Ладыгин за рулем отечественного седана LADA Vesta Sport TCR впервые стал чемпионом в самом престижном классе «Туринг». В классе «Супер-Продакшн» быстрейшей стала турбированная Vesta Владислава Незванкина, а в «Туринг-Лайте» восемь побед и чемпионский титул завоевал Владимир Шешенин. Во всех трех классах LADA Sport ROSNEFT стала лучшей командой сезона. 

Не менее успешно год сложился у пилотов раллийной и картинговой команд. Дмитрий Воронов и Кирилл Еникеев стали авторами уникального достижения – они выиграли все гонки Кубка России по ралли, в которых участвовали, а Артем Северюхин и Иван Чубаров завоевали титул чемпионов страны в самых быстрых категориях российского картинга.

АвтоВАЗ рассказал о будущем Lada Vesta и Xray

В этот непростой год российский рынок успел пережить серьёзный спад продаж. Пандемия, неопределённость на рынке и нестабильность рубля заставляют автопроизводителей корректировать объёмы производства, прайс-листы и планы. Несмотря на сложную ситуацию LADA продолжает развиваться, трансформируясь под реалии.

Как сообщает РГ со ссылкой на пресс-службу АвтоВАЗа, из-за роста курса валют, который привел к увеличению стоимости запчастей и логистических издержек, в 2020 году производитель 5 раз поднимал цены на весь модельный ряд LADA, в среднем на 1,5%.

Ходили слухи, что из-за слабого спроса кросс-хэтч Lada Xray могут снять с конвейера, но в пресс-службе автозавода заявили, что модель заняла свою нишу и достаточно стабильна в продажах. Кроме того, семейство Xray привлекает молодую и женскую аудиторию. Предприятие не планирует прекращать производство модели, которая скоро отметит 5-летний юбилей.

Еще одна новая модель LADA — Vesta, в сентябре отметила свое пятилетие. Семейство построено на собственной платформе Lada B/С и постоянно расширяется и дополняется новыми версиями. Что касается возможного появления хэтчбека или купе Vesta, то, по словам пресс-службы, эти проекты являются экономически невыгодными.

Что касается Lada Largus, который выпускается АвтоВАЗом с 2012 года, универсалу уже давно требуется рестайлинг. В Сети всё чаще появляются шпионские фотоснимки прототипов Largus Facelift, и, как сообщает пресс-служба российской марки, работы проводятся по плану. О сроках выхода модели компания традиционно умолчала.

«Конструкция Lada 4×4 достаточно сбалансирована, поэтому заметные улучшения внедряются порционно, и с вниманием к наиболее важным вещам. Именно это и было сделано в прошлом году, когда автомобиль получил новый интерьер. Пользоваться машиной стало заметно удобней. При этом передняя панель хорошо вписалась в классический стиль Lada 4×4», — рассказали в компании о внедорожниках Lada 4×4 и Niva, отметив, что новое поколение 4×4 появится не раньше 2023 года.

В 2018 году АвтоВАЗ подписал СПИК с Минпромторгом, в котором были прописаны планы по производству новых моделей, включая два компактных кроссовера, новое семейство автомобилей B-класса, а также модель нижнего С-сегмента. Однозначно АвтоВАЗ не планирует выпуск кабриолетов, минивэнов, спорткаров и других редких типов кузова, которые вряд ли когда-либо окупятся.

Что касается метановых и водородных версий автомобилей, а также электрокаров, российский автопроизводитель ответил следующее: «АвтоВАЗ, являясь частью Groupe Renault, обладает доступом ко всем современным технологиям по применению альтернативных силовых установок. Когда рынок в массовом сегменте покажет экономически целесообразный спрос на такие решения, Lada займёт свою нишу и на нём. Тоже касается и метановых моделей — в настоящий момент предложение адекватно состоянию рынка».

На АвтоВАЗе рассказали о дизайне новых моделей Lada :: Autonews

Смена главного дизайнера отразится на внешности новых автомобилей Lada, но при этом модели сохранят свои основные фирменные черты. Об этом во время ежегодной пресс-конференции «АвтоВАЗа» рассказал исполнительный вице-президент по продажам и маркетингу предприятия Оливье Морне, отвечая на вопрос о будущем Х-дизайна Lada, созданном покинувшим компанию шеф-дизайнером Стивом Маттином.

«Стив Маттин работал на «АвтоВАЗе» девять лет. Это было возрождение дизайна Lada и Маттин провел огромную работу, — рассказал Морне. — Теперь он решил сделать небольшой перерыв в карьере и заняться чем-то другим. И мы приветствуем Жана-Филиппа Салара, это очень опытный дизайнер, который работал с брендами Renault, Dacia в разных странах Восточной Европы, а также в Корее и в Индии. И сейчас он приезжает в Россию».

По словам Морне, стиль, разработанный Маттином, «внес огромный вклад в развитие и рост бренда Lada». Он отметил, что созданный язык дизайна оставит свой след и элементы ДНК во внешности автомобилей, которые будут представлены в ближайшие месяцы и годы. Тем не менее, изменений не избежать.

«Дизайн — это живой организм, его невозможно заморозить на 10-20 лет. Думаю, что Салар сможет придать дизайну Lada свою собственную интерпретацию. И он также сможет предвидеть будущие потребности на рынке, следить за желаниями покупателей и, возможно, даже создать некие новые тренды. В дизайне это совершенно нормально. Сейчас у нас очень хорошая база в плане дизайна, это подтверждают и коммерческие результаты», — поделился планами на видение будущего дизайна Lada главный маркетолог АвтоВАЗа.

Напомним, что в конце 2020 года главный дизайнер АвтоВАЗа Стив Маттин покинул свой пост.

Маттин начал работать на Волжском автозаводе в 2011 году и с того момента кардинально изменил внешность отечественных автомобилей. Он решил полностью отказаться от советского наследия и создать принципиально новый так называемый «икс-дизайн»: с характерными X-образными элементами в передней части кузова, визуально объединяющими оптику, бампер и радиаторную решетку, а также рельефными чертами на бортах. 

Необычная внешность вызвала немало споров, но в итоге пришлась по вкусу россиянам. Опросы показали: раньше при выборе моделей АвтоВАЗа самыми важными параметрами была цена и практичность, однако в дальнейшем в списке главных факторов появился и внешний вид машин.

АВТОВАЗ показал первое изображение будущего поколения LADA Niva — Wylsacom

АВТОВАЗ опубликовал первое изображение будущего внедорожника Niva. Концепт получил название Niva Vision и является предвестником модели, которую запустят в 2024 году.

Главная задача концепта — стать символом изменений, о которых заявила Groupe Renault. Новая программа названа RENAULuTion и касается трёх брендов группы: Renault, Dacia и LADA. Последние два теперь объединены в одну компанию. Долго думать над её названием не стали: Dacia-Lada. Её главой назначен Дени Левот, до этого он был старшим вице-президентом и операционным директором региона Евразия группы Groupe Renault.

Дени Левот заявил, что у будущего поколения LADA Niva будет два варианта кузова. Вероятно, речь идёт о трёх- и пятидверной модели. Основой для автомобиля, как и для всех моделей LADA, станет платформа CMF-B, разработанная концерном Renault-Nissan. Она будет унифицирована с большинством моделей Dacia.

Вообще LADA и румынская Dacia в рамках альянса становятся единым бизнес-проектом:

АВТОВАЗ и Dacia останутся отдельными компаниями со своей собственной историей и стратегией, которые будут предлагать лучшие в своей истории по привлекательности и эффективности затрат продукты в рамках нового бизнес-подразделения.

LADA

По словам господина Левота, «Нива» станет глобальной моделью, которую будут продавать сразу в нескольких странах мира. И она станет одной из четырёх новых моделей, которые АВТОВАЗ выпустит до 2025 года. Пока неизвестно, о каких именно автомобилях, помимо LADA Niva, говорит Дени Левот. Одной из них должен стать кроссовер C-класса, где вполне уверенно себя чувствуют всякие «Тигуаны» и «Рав-4».

После 2025 года общее количество кузовов, выпускаемых совместно Dacia-Lada, сократится с 18 до 11. При этом Renault надеется сделать оба бренда международными компаниями, а общее количество выпускаемых автомобилей должно превысить 1,1 млн в год.

Обе марки продолжат развиваться по схожим, но всё-таки отличающимся линейкам. У Dacia, например, появятся электрические автомобили, а LADA может заняться выпуском гибридов.

Лично меня очень радует, что концепт получился очень похожим на ту самую «Ниву», показанную ещё в 1974 году. Видна преемственность поколений — путь, который выбран такими компаниями, как Mercedes-Benz с её «геликом» и Land Rover, которая отлично осовременила образ Defender. И будет очень круто, если в ряд с этими автомобилями встанет и «Нива» — также легендарный внедорожник.

Брутально, пугающе и очень круто: АВТОВАЗ представил прототип новой «Нивы»

Неожиданно не увидеть во внешнем облике будущей «Нивы» того самого X-стиля, который стал центральной частью всех современных моделей АВТОВАЗа. Вероятно, альянс Renault-Nissan решил отказаться от этого пути. Либо просто стало понятно, что с уходом Стива Маттина, главного дизайнера АВТОВАЗа, продолжать эту концепцию будет некому.

Новый LADA Niva Travel вызывает лишь грусть

Я очень надеюсь, что план будет выполнен, поскольку сейчас дела у завода далеко не лучшие — все проекты закредитованы, платить нечем, поставки задерживаются, из-за чего фейслифтовый Largus никак не может добраться до конвейера, а под логотипом бренда выходят лишь специальные версии уже успевших устареть автомобилей. Пора двигаться дальше. Жаль, что до 2023 года новых моделей ждать не придётся.

В будущем LADA Vesta SW Cross могут оснастить полным приводом

В будущем LADA Vesta SW Cross могут оснастить полным приводом

 

Буквально несколько лет назад российский автомобильный рынок начал официальные продажи нового универсала Lada семейства Vesta от компании АвтоВАЗ в двух разных модификациях – модели получили названия SW и SW Cross. На торжественной презентации, приуроченной к этому факту, и прошедшей в столице России, представители прессы задали несколько наиболее важных вопросов относительно будущих планов руководства компании, касающихся дальнейшего развития и совершенствования новинки.

Максим Саржин, являющийся одним из топ-менеджеров известного автомобильного производителя, и одновременно с этим ответственный за направление LADA Vesta, прокомментировал текущую ситуацию, ответив на некоторые вопросы, интересующие журналистов из СМИ. В частности, он сообщил, что модель SW Cross в дальнейшем может получить новую комплектацию с системой полного привода.

Решение о целесообразности оснащения универсала полным приводом будет зависеть от того, как на выпуск модели отреагирует отечественный рынок, и насколько активными окажутся продажи. Дело в том, что доработка машины для такого ее оснащения– задача не только непростая, но и далеко не дешевая. А значит, решение по этому вопросу требует предельно аккуратного и вдумчивого подхода, и связано с определенными финансовыми рисками.

Ответил Максим Саржин и на другой актуальный вопрос – появятся ли в линейке автомобилей LADA Vesta более мощные моторы, такие, как 2-литровые. По его словам, на ближайшее будущее такие нововведения точно не планируются, поскольку сегодняшнего ассортимента двигателей, включающего в себя 1,8-литровый со 122 лошадиными силами и 1,6-литровый со 106 лошадиными силами агрегаты, вполне хватает для полного удовлетворения нужд покупателей машин этого класса. Поэтому вопрос по увеличению мощности разработчики пока не рассматривают.

АВТОВАЗ возобновил локальное производство автомобилей LADA в Казахстане

Сегодня, 26 марта 2021 года, в присутствии премьер-министра Республики Казахстан Аскара Мамина был подписан договор о сотрудничестве между АО «АВТОВАЗ» и ГК «Аллюр» (в группу компаний Allur Group входит производственное предприятие ТОО «СарыаркаАвтоПром», дистрибьюторская и дилерская сеть Allur Auto).

Документ пока не закрепляет объемы будущего производства и линейку автомобилей LADA, которые будут выпускаться в Костанае для местного рынка, его, скорее, можно воспринимать как протокол о намерениях. Как сообщает пресс-служба АВТОВАЗа, «информация о модельном ряде и объемах производства будет сообщена дополнительно, по мере финализации дополнительных соглашений». А пока в производство запущена только одна модель — Niva Travel.

Напомним, что в феврале АВТОВАЗ приостановил сборку автомобилей LADA в Казахстане, на крупнейшем для себя экспортном рынке. Как отметили в Союзе предприятий автомобильной отрасли Казахстана «КазАвтоПром», в результате остановки завода потребители столкнулись с дефицитом наиболее востребованных автомобилей и ценовым ростом.

«Я искренне рад возобновлению локального производства LADA в Казахстане, — заявил в ходе подписания договора президент АО «АВТОВАЗ» Ив Каракатзанис. — В кратчайшие сроки, благодаря профессиональному подходу наших партнеров, мы смогли подготовить и подписать соглашение о сотрудничестве, а также запустить в производство первую модель – внедорожник Niva Travel. В ближайшие месяцы на костанайском заводе начнут выпускаться и другие модели LADA. Казахстан является ключевым экспортным рынком для АВТОВАЗа, и мы намерены совместно с новым партнером еще более укрепить здесь присутствие нашего бренда», — заявил Президент АО «АВТОВАЗ» Ив Каракатзанис.

В рамках заключенного договора ГК «Аллюр» планирует выпускать в Казахстане широкую линейку LADA «в объемах, которые будут необходимы для местного рынка».

Кстати, в 2020 году АВТОВАЗ поставил в Казахстан 17,5 тыс. автомобилей LADA, включая машинокомплекты, а рыночная доля марки LADA в стране составила 19,6%. Самыми продаваемыми моделями LADA локального производства были LADA Granta (7557 шт.), LADA Vesta (3767 шт.) и LADA 4×4 (3062 шт.).

Быстро узнать стоимость нового автомобиля LADA (и не только) на российском рынке можно на сайте «Цена Авто».

Фото: АВТОВАЗ

LADA: 50 лет истории — Пресс-релизы — Новости

19 апреля 2020 года исполняется 50 лет с выпуска первых автомобилей марки LADA. В этот день в 1970 году с конвейера Волжского автозавода сошли шесть седанов ВАЗ-2101 «Жигули» – 2 синих и 4 вишнёвых, что символизировало цвета флага РСФСР. С тех пор на автозаводе в Тольятти было выпущено более чем 50 серийных моделей.

Первая LADA – самая массовая в СССР и в России

Продажи «Жигулей» начались в августе 1970 года. ВАЗ-2101 дал начало самому многочисленному семейству легковых машин в истории предприятия, и, более того, — в истории российской автомобильной промышленности. С 1970 по 1988 год выпущено около 4,8 млн ВАЗ-2101 и его модификаций. Помимо ВАЗ-2101, самыми массовыми стали LADA 2106 (4,3 млн шт.), LADA 2107 (2,8 млн шт.), LADA 4×4 (2,5 млн шт.).

Доработка зарубежного прототипа

Первая модель LADA базировалась на итальянском седане FIAT-124, который в 1967 году получил звание «Автомобиль года» в Европе. Для производства и продаж в Советском Союзе зарубежный прототип прошел серию испытаний на дорогах, бездорожье и специальных участках брусчатки. По итогам тестов в конструкцию лицензионного автомобиля было внесено свыше 800 конструктивных изменений – и значительная часть была направлена на повышение надежности.

Была переработана подвеска: изменена кинематика, усилены многие детали, в том числе пружины и шаровые опоры. FIAT-124 обладал клиренсом около 130 мм. При модернизации итальянского шасси дорожный просвет спереди был увеличен до 175 мм. В результате доработок машина стала тяжелее на 90 кг, но это компенсировалось увеличенной мощностью мотора. ВАЗ-2101 получил новый двигатель с верхним расположением распределительного вала и увеличенным межцентровым расстоянием цилиндров, что в будущем позволило дорабатывать мотор и повышать его объем. В сцеплении увеличился наружный диаметр фрикционных накладок – со 182 мм до 200 мм. В коробке передач появились синхронизаторы, разработанные для более скоростных спортивных «Фиатов». Кузов стал прочнее, а вместо двух проушин под домкрат (по одной с каждого борта) появились четыре, что обеспечило гораздо более надежное вывешивание автомобиля.

Появились отверстия под внешнюю пусковую рукоятку – в бампере, кузове и радиаторе. Вместо сигнальной лампы перегрева двигателя, применяемой итальянцами, на комбинации приборов ВАЗ‑2101 появился указатель температуры охлаждающей жидкости.

Часть изменений хорошо заметна внешне, в чем могут убедиться посетители корпоративного музея АВТОВАЗа, где экспонируется FIAT-124 – редкий для России автомобиль предоставлен музею из частной коллекции. Сравнить его можно с первым проданным автомобилем ВАЗ-2101, который поступил в корпоративный музей после 19 лет эксплуатации.

Время показало, насколько верными были конструктивные решения, заложенные в ВАЗ-2101. Автомобиль стал достаточно прочным, надёжным и комфортным – высокую оценку он получил как у отечественных потребителей, так и на зарубежном рынке, куда поступил уже в 1971 году. Первая партия автомобилей была отправлена в Югославию, Бельгию, Голландию и Финляндию. В 1971 году было экспортировано более 57 тысяч автомобилей LADA – это более трети всего годового экспорта легковых автомобилей СССР в то время.

Сегодня в России на учете стоят несколько сотен тысяч седанов ВАЗ-2101. Заслуженные автомобили и сегодня трудятся по прямому назначению – в качестве транспорта, но все чаще становятся предметом реставрации и коллекционирования.

Российский автомобиль ХХ столетия

В 2000 году ВАЗ-2101 был назван «Российским автомобилем столетия» по итогам опроса, проведенного журналом «За рулем». За первую модель LADA проголосовал каждый четвертый участник опроса, а всего в нем приняло участие более 80 тысяч человек.

История побед в автоспорте

В 1970 году вместе с выпуском первых ВАЗ-2101 было принято решение о создании спортивного подразделения. С первых же лет выпуска ВАЗ-2101 стала побеждать во всевозможных автомобильных гонках, открыв новую страницу истории автоспорта в СССР. В 1971-м, впервые приняв участие в ралли «Тур Европы», проходившем на территории 14 стран, команда на ВАЗ-2101 выиграла «Серебряный кубок», а спустя два года сразу два – и «Золотой», и «Серебряный». Параллельно заводская команда завоевывала главные награды состязаний, проводившихся внутри Советского Союза. Гонщики на ВАЗ-2101 соревновались как с отечественными авто других марок, так и в моноклассе, созданном специально для «Жигулей». Спортсмены на ВАЗ-2101 участвовали и в международных ралли, и в советских кольцевых гонках и автокроссе до середины 80-х годов. История спортивных побед LADA продолжается: на специально подготовленных LADA Granta и LADA Vesta заводская команда выступает в российских ралли и кольцевых гонках. Только в 2019 году пилоты LADA Sport ROSNEFT более 100 раз поднимались на победные подиумы.

Новая LADA: наследник традиций

С появлением ВАЗ-2101 были сформированы базовые правила создания автомобилей, которые реализуются и в современных моделях LADA. Это оригинальный и яркий дизайн, надежность, лучшее качество и оснащение по доступной цене. ВАЗ-2101 был не только массовым, но и по-настоящему передовым автомобилем для своего времени – современные модели LADA продолжают эту традицию.

LADA была и остается самым массовым автомобильным брендом в России. Рыночная доля Марки составляет более 20%, а в целом в автопарке России LADA занимает около 30%. Лидерами российского рынка являются модели LADA Granta и LADA Vesta.

В данный момент модельный ряд LADA представлен 5 семействами: Vesta, XRAY, Granta, Largus, 4х4. LADA представляет своим покупателям широчайший выбор модификаций своих моделей: более двух десятков серийных машин – седанов, хэтчбеков, универсалов, кроссоверов; а так же ряд специальных версий – это фургоны, пикапы с открытым и закрытым бортом, инкассаторские броневики, болотоходы, социальное такси, скорая помощь, кинологическая или спасательная служба.

Сегодня АВТОВАЗ – часть Groupe Renault, одного из лидеров мирового автомобилестроения. Производственные технологии предприятия, системы контроля и оценки качества выпускаемой продукции соответствуют самым современным международным стандартам и непрерывно развиваются.

Найти более подробную информацию о юбилее LADA, скачать архивные фото, исторические и современные видеоматериалы можно здесь.

FRET для устройств типа «лаборатория на кристалле» — текущие тенденции и перспективы на будущее

В этом обзоре основное внимание уделяется использованию резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) для мониторинга внутри- и межмолекулярных реакций, протекающих в микрофлюидных реакторах. Микрожидкостные устройства недавно стали использоваться для проведения высокоэффективных и миниатюрных биологических анализов для анализа биологических объектов, таких как клетки, белки и нуклеиновые кислоты. Микрожидкостные анализы характеризуются реакционными объемами от нанолитров до фемтолитров, что требует принятия чувствительной схемы оптического обнаружения.FRET служит сильной «спектроскопической линейкой» для выяснения третичной структуры биомолекул, поскольку эффективность безызлучательного переноса энергии чрезвычайно чувствительна к наноразмерным изменениям в разделении донорных и акцепторных маркеров, прикрепленных к интересующей биомолекуле. В этом обзоре мы рассмотрим реализацию различных микрофлюидных анализов, в которых используется FRET для различных применений в биомедицинской области, наряду с преимуществами и недостатками различных подходов.Будут обсуждены будущие перспективы развития микрофлюидных устройств, включающих обнаружение FRET.

У вас есть доступ к этой статье

Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

Freshers: не беспокойтесь о будущем

PIPPA CALVIN объясняет, почему новичкам еще рано беспокоиться о будущем.

Итак, вот и мы: прошли половину пасхальных каникул. Это означает, что я закончил первый год в Кембридже. Пришло время оценить свою жизнь. Так что, возможно, я еще не достиг, ну, ничего значительного, но я все равно считаю последний год своей жизни огромным успехом.

После трех замечательных недель откладывания пасхальных праздников я решил взглянуть на список To Do , который я составил на пятой неделе. На самом деле, это больше похоже на список Sort Your Life Out .В ней полно вещей, которые я обманул, думая, что смогу обойтись во время моего (кхм) продуктивного пятинедельного перерыва, например: найти летнюю стажировку, заглянуть в летние школы Испании и разобраться с годовым проектом за границей. Легче сказать, чем сделать.

После тупого взгляда на свой список в течение нескольких минут и с учетом минимальных усилий, которые я приложил, чтобы найти направление в жизни до сих пор, я начал задаваться вопросом, нужно ли мне делать больше, чтобы подняться по карьерной лестнице, или стоит ли мне просто перестать беспокоиться об этом?

Хотя первый год, возможно, самый легкий с точки зрения рабочей нагрузки и ограничений по времени, это, несомненно, огромный культурный шок.Попасть в университет прямо из школы или, что еще лучше, «впитать культуру» во время провала в Юго-Восточной Азии — это большой шаг. Безусловно, потребуется время, чтобы приспособиться к новому графику, наполненному лекциями, супервизиями и случайным кризисом эссе в 5 утра. Добавьте сюда приступ гриппа новичков, пытаясь завести друзей, пока вы страдаете от указанного гриппа и переживаете свой первый опыт Life / Cindies / Mahal , и, ну, вы в значительной степени заняты.

Мы все пережили кризис эссе в 3 часа ночи…

Так что, возможно, сейчас не лучшее время для того, чтобы начать думать о том, насколько улучшится ваше резюме, если вы станете членом с блестящим названием Technology and Enterprise Club, или Diplomacy Society .Не поймите меня неправильно: если вы искренне увлечены технологиями и предприятиями, обязательно зарегистрируйтесь. Но, насколько я понимаю, первый год — лучшее время, чтобы заняться тем, что вы всегда любили или хотели попробовать. Сейчас не время начинать создание резюме.

Я, например, почти не представляю, чем я хочу заниматься после учебы в жизни. Но недавно, в духе корпоративных приключений, я направился на сквош недавно созданного общества маркетинга и рекламы: MadSoc .Это обещало быть великим обществом с особой поддержкой маркетингового конкурса L’Oreal Brandstorm — легенды CV.

К сожалению, я был там только первый год. Ничего страшного, учитывая, что вы даже не сможете принять участие в конкурсе Brandstorm до второго года обучения. По общему признанию, это всего лишь анекдотические свидетельства, но они убедительно подтвердили мою новообретенную убежденность: никто на самом деле не ожидает, что вы будете так стремиться к своей карьере, пока, по крайней мере, немного позже получите степень.

Первый год в любом университете будет сложной кривой обучения, и лучший способ пройти ее — найти баланс между работой и личной жизнью, занимаясь тем, что вам нравится. Процитирую товарища-первокурсника: «Freshers» — это гулять, веселиться и заводить друзей, которые никогда не позволят вам забыть , то время, когда… ’

И мы, вероятно, сможем переживать об остальной части нашей жизни позже.

НЕ РАССКАЗЫВАЙТЕ В БУДУЩЕЕ. — Христианская ежедневная молитва

РАПСОДИЯ РЕАЛЬНОСТЕЙ ЕЖЕДНЕВНО ПРЕДАННАЯ;

НЕ РАССКАЗЫВАЙТЕ В БУДУЩЕЕ.

Вторник, 3 ноября 2020 г .;

пастор Крис Ояхиломе;

Ибо Я знаю мысли, которые думаю о тебе, говорит Господь, мысли о мире, а не о зле, чтобы дать тебе ожидаемый конец (Иеремия 29:11).

Господь Иисус указал на некоторые мучительные знамения, которые означают конец века. Он сказал: «И будут знамения на солнце, и на луне, и на звездах; и на земле бедствия народов, недоумение… Сердца человеческие теряют их из-за страха и заботы о том, что грядет на землю… »(Луки 21: 25-26).

Многие из них уже происходят, и многие впали в уныние; источники средств к существованию, предприятия и экономика были подорваны. Многие больше не уверены в своем будущем. Но как христианин не беспокойтесь о будущем; быть на месте. Правительство или общество могут пообещать вам большое будущее; не надейтесь на их обещания.

Божий план — лучший; ваша роль — обнаружить этот план и идти в его свете. В новой международной версии нашего тематического стиха говорится: «Ибо я знаю планы, которые у меня есть для вас, — провозглашает ГОСПОДЬ, — планы, которые помогут вам добиться успеха, а не причинят вам вреда, планы дать вам надежду и будущее.«Никогда не позволяйте мирским неприятностям вызывать у вас депрессию. Иисус знал, что вы столкнетесь с кризисами в этом мире; Итак, Он сказал: «Это Я сказал вам, чтобы вы имели мир во Мне. В мире вас ждут скорби; но ободритесь; Я победил мир »(Иоанна 16:33).

Ободритесь, независимо от того, что происходит вокруг вас или с вами. Быть сильным. Быть смелым. Не сдавайтесь. Может быть, это ваш бизнес, работа, семья, что бы то ни было; проблема только на короткое время.Апостол Павел назвал это «легкой скорбью». Он сказал: «Ибо наша легкая скорбь, которая кратковременна, производит для нас гораздо более великую и вечную тяжесть славы» (2 Коринфянам 4:17). Пока вы во Христе, вы в безопасности; ваше будущее обеспечено. Аллилуйя!

Загрузить, подписаться и поделиться

ИСПОВЕДОВАНИЕ

Я — дело рук Бога (Его мастерство), воссозданное во Христе Иисусе, чтобы исполнить судьбу и прославить Его своей жизнью. Я иду предначертанными путями, иду по тому пути, которым должен следовать, и живу хорошей жизнью, которую Он заранее приготовил и приготовил для меня, чтобы жить во Имя Иисуса.Аминь.

ДАЛЬНЕЙШИЕ ИЗУЧЕНИЯ: || 2 Коринфянам 4: 16-18 Посему мы не унываем; но хотя внешний человек наш и погибает, внутренний [человек] обновляется день за днем. 17 Ибо наша легкая скорбь, которая лишь на мгновение, производит для нас гораздо более несравненную [и] вечную тяжесть славы; 18 А мы смотрим не на видимое, но на невидимое: ибо видимое [временно]; но невидимое [вечно]. ||

|| Иоанна 14:27 Мир оставляю вам, мир Мой даю вам: не как мир дает, Я даю вам.Да не тревожится сердце твое и не бойся. ||

Доступ ко всем станциям сети LTM в любом месте и в любом месте…. И МНОГОЕ ДРУГОЕ. Загрузите приложение CLoveWorld, приложение Cetunes или приложение Loveworld Radio из магазина Android или Apple, используя код ссылки:

3 для бесплатных бонусных каналов

ЕЖЕДНЕВНОЕ ЧТЕНИЕ ПИСАНИЙ

Годовой план чтения Библии => Евреям 3 и Иеремии 38-40

2-летний план чтения Библии => 1 Петра 2: 1-12 и Иезекииль 34

Гиды Мадагаскара беспокоятся о будущем, поскольку лесорубы уничтожают леса

Кларел Фанири Расоанаиво

ВОХИБОЛА, Мадагаскар (Рейтер) — В лесу Вохибола на востоке Мадагаскара туристический гид Набе беспокоится о своем будущем как подсечно-огневое земледелие и десятилетия лесозаготовок медленно разрушают его средства к существованию.

«В 2017 году лесорубы подожгли этот заповедник, и примерно 20 или более процентов леса были сожжены, поэтому мы обнаружили, что в нем были сожжены дотла несколько видов животных», — сказал он.

Известный своими высокими тропическими лесами, лемурами, хамелеонами, ядовитыми лягушками и растениями, Мадагаскар является горячей точкой биоразнообразия. Более 80 процентов млекопитающих на четвертом по величине острове мира не встречаются больше нигде.

Экотуризм составляет основу туристической индустрии страны с доходом в 390 миллионов долларов в год, но Набе обеспокоена тем, что вырубка лесов уже влияет на эту отрасль и сообщества, которые в значительной степени зависят от нее, чтобы заработать себе на жизнь.

Необузданные лесозаготовки продолжают уничтожать как растения, так и животных в лесах острова, а экзотические существа, такие как карликовая лягушка Stumpffia, одна из самых маленьких земноводных в мире, остаются под угрозой.

Исследователи также предупреждают, что знаменитые лемуры страны все чаще сталкиваются с риском исчезновения.

Сообщества поощряются к тому, чтобы они играли более активную роль в защите биоразнообразия страны, отслеживая незаконную деятельность в лесах.

«Здесь целое дерево, ствол там, верхушка здесь, и они взяли только один метр пятьдесят (1,5 м), только два метра на дереве, вот и все, остальное — потеря», — сказал Стефан. , туристический гид.

«Здесь было 30 лесорубов, незаконно заготовленный лес мы забрали. Это свидетельство вырубки лесов », — добавил Жан Поль, гид и член общественной природоохранной группы.

Местное сообщество также работает над различными природоохранными проектами, включая сбор семян для питомника деревьев и, в конечном итоге, пересадку деревьев для роста лесного покрова.

В прошлом правительство вводило запреты на лесозаготовки, чтобы защитить лесные массивы по всей стране, но власти изо всех сил пытались обуздать незаконную торговлю древесиной.

По сообщениям, по крайней мере 90 процентов естественной экологии острова — его уникальной флоры и фауны, которые ученые связывают с тем, что Мадагаскар был отделен от других массивов суши более 160 миллионов лет, — по сообщениям, к настоящему времени были уничтожены.

Защитники природы говорят, что в управлении лесным хозяйством отсутствует надлежащее регулирование, направленное на спасение лесов.

«В прошлом году это было 510 000 гектаров — действительно впервые в мире. Конечно, в Бразилии исчезло более 4 миллионов гектаров, но для Мадагаскара за один год исчезло 4 процента естественных лесов Мадагаскара », — сказал Ньято Разакаманарина, председатель группы Alliance Voahary Gasy Environmental.

«Это действительно свидетельствует об отсутствии желания, но также и о коррупции, потому что кривая коррупции будет соответствовать кривой вырубки лесов на Мадагаскаре», — сказала Разакаманарина.

Отчетность Кларел Фанири Расоанайво; Под редакцией Хью Лоусона

Не беспокойтесь о настоящем, Covid преподает уроки устойчивости к будущим

Чтобы помочь читателям справиться со своими тревогами в эти стрессовые времена, The Times of India запустила серию Talk it Out, в рамках которой наша группа консультантов ответят на ваши вопросы о психическом здоровье. На этой неделе совет дает психолог доктор Шветамбара Сабхарвал
. Я 23-летний индус, состоящий в отношениях с девушкой из другой религии, которую я знал с детства.Мы оба очень серьезно относимся к нашим отношениям и не можем жить друг без друга. Но наши родители не примут таких отношений. У меня огромная дилемма, и я очень беспокоюсь о том, что мне делать.
— Govind
Мне жаль, что вы испытываете этот стресс из-за чего-то, что на самом деле должно быть радостным. Я не думаю, что вам и вашим любовным интересам следует терять надежду или испытывать стресс. Если бы я был на вашем месте, я бы сосредоточился на своей карьере, инвестировал бы в свою продуктивность и на вещи, которые идут хорошо в жизни.В вашем возрасте нам предстоит принять несколько важных решений, например, брак, выбор карьеры и поиск работы, и я бы посоветовал вам обоим сначала устроиться профессионально. Вам не нужно искать немедленные решения сразу для всех проблем, что, вероятно, увеличивает ваш стресс. Учитывая, что вы оба преданы друг другу, проявите терпение и сконцентрируйтесь на профессиональном урегулировании, и это только облегчит дело в будущем.
Что касается родителей, не торопитесь, чтобы поговорить об этом, когда вы почувствуете себя более уверенно.Мы часто предполагаем реакцию родителей и испытываем беспокойство по этому поводу, хотя все это предположение.
Мне 26 лет. Я закончил образование и начал работать год назад. Мне не хочется встречаться с людьми, иногда даже со своими друзьями. Я не могу им доверять и принимать их слова за чистую монету. Я чувствую, что у меня низкая самооценка. Из-за всего этого я отвлекаюсь от работы. Что я могу сделать, чтобы выйти из этого?
— Аноним
Мне жаль слышать о ваших проблемах.Я бы посоветовал вам разделить свои проблемы на отдельные категории — я, семья, друзья, работа — и заниматься одним делом за раз. Забота о себе — самое важное. Сосредоточьтесь на здоровом и активном образе жизни, установите распорядок дня и следуйте ему. Запишите рабочие цели и установите напоминания, чтобы действовать в соответствии с ними. Обращение к психологу, чтобы вылечить условную самооценку, окажет большое влияние на другие факторы стресса. Я хотел бы добавить, что, когда мы чувствуем себя в безопасности, уверенно и здорово, наши отношения и производительность на работе часто улучшаются.Для нас нормально чувствовать себя подавленным и временами не в настроении общаться, но если это происходит постоянно и настойчиво, консультация с психологом поможет определить причины.
Я очень обеспокоен тем, как проходят онлайн-классы. Когда я пытаюсь уделять внимание лекциям, некоторые студенты начинают показывать на экране вульгарные изображения или видеоролики или используют несогласные выражения, которые влияют на меня. Даже когда совместное использование экрана отключено, некоторые учащиеся включают свои видео, где они раздеваются и делают неприемлемые вещи.Это влияет на меня и многих других студентов. Я чувствую себя очень неуютно и неловко. Пожалуйста помоги.
— Sumita
Онлайн-обучение вызывает много стресса в различных формах, поскольку это все еще новый способ преподавания и обучения. Хотя мы, люди, являемся чемпионами в адаптации, потребуется некоторое время, чтобы принять обязательные меры безопасности и здоровья по сравнению с онлайн-технологиями. Вы не упомянули свой возраст. Если вы студент, ваши родители и учителя должны знать, что происходит в классе. Если вы взрослый, то во что бы то ни стало уверенно выражайте свое беспокойство людям, которые проводят эти занятия, поскольку они могут не осознавать этого.Если этот урок неизбежен, я бы сосредоточился на содержании, которое я собираюсь изучить, и игнорировать отвлекающие факторы, как будто их не существует, что будет препятствовать такой демонстрации, поскольку она не будет привлекать внимание.
Я только что закончил XII класс. Я очень переживаю за свое будущее и хочу продолжить карьеру в IT. Из-за Ковида мой год потрачен зря. Мои родители говорят мне, что здоровье важнее всего, но я очень переживаю и расстроен своим будущим. Пожалуйста, помогите мне преодолеть это.
— Адитья
Спасибо, что написали, так как это может помочь многим таким студентам, как вы, которые воспринимают этот год как крушение.Хороший выбор в области ИТ, и это само по себе должно быть вашей гарантией прекрасного будущего, учитывая зависимость, которую в этом году создает от этого. Беспокойство — это здорово, а тревога и депрессия — нет. Давайте попробуем превратить этот год в изучение бесконечных возможностей и уроков. Сосредоточьтесь на росте. Это означает, что мы здесь, чтобы учиться в каждом путешествии и в каждом опыте. Я чувствую, что ваше поколение может быть гораздо более устойчивым и адаптивным, чем наше, просто из-за этого года паузы или перерыва. Некоторые из самых престижных университетов открыли свои двери для бесплатных онлайн-курсов.Выберите один и начните учиться.
Я хочу стать летчиком-истребителем своего народа и служить с честью и гордостью. Цветовая слепота не позволяет мне достичь моей мечты и критериев даты рождения, а также я не соответствую возрасту CDS и AFCAT. Я виню своих родителей в том, что они не отправили меня в школу рано и не вылечили мою дальтонизм. Я просто не хочу жить. Я очень ненавижу себя и свою удачу. Люди говорят, что трудитесь, и вы добьетесь успеха. Как я могу усердно работать, если сам не соответствую критериям?
— Аноним
Прошу прощения за это разочарование.Это действительно сложно, когда мы не можем следовать своей мечте. Но это то, что они есть. Мечты не всегда сбываются. Ваше намерение вдохновляет. Есть очень много способов добиться этого. Я надеюсь, что вы проявите гибкость, не будете подавлены жесткостью и найдете карьеру, которая будет соответствовать вашему благородному желанию. Возможно, ваши родители неосознанно сделали выбор, который не сработал для вас, но то, что произойдет дальше, будет следствием вашего сознательного выбора. Учитесь на своем прошлом и продолжайте двигаться вперед, создавая красивое и сильное настоящее.Успех и честь — это результат упорного труда, и никто не сможет вам помешать.
Если вам нужна консультация, обращайтесь по следующим телефонным линиям:
Aasra + 91-9820466726 (24×7)
Cooj +91 9822562522 (13-19 вечера, пн-пт)
iCall +91 9152987821 (пн-сб, 10-00-20pm)
Fortis +91 8376804102 (9.00-17.00)
Kiran 1800-599-0019 (24×7)
Sumaitri +91 9315767849 (14-18.30)
Saath +91 7926305544 (13-19pm)
Sneha +91 9566027776 (10.00-14pm)
Фонд Вандревала 18602662345, +91 7304599836 (круглосуточно)
ХОЧУ ПОСОВЕТОВАТЬ?
Совместное использование может помочь вам выздороветь, поэтому напишите нам по адресу talkitout @ timesgroup.com с вашим вопросом, именем и местом. Но если вы хотите остаться анонимным, укажите это в своем электронном письме.

Arteta не будет беспокоиться о будущем, футбольные новости и популярные новости

ЛОНДОН • ​​«Арсенал» демонстрирует худшее начало сезона в высшем дивизионе Англии за 39 лет после своего пятого поражения в Премьер-лиге, забив всего 10 голов.

Но, несмотря на падение на 14-е место в турнирной таблице в воскресенье, менеджер Микель Артета настаивал на том, что он не беспокоится о потере работы.

Удары Педро Нето и Даниэля Поденсе по обе стороны от равного счетчика Габриэля дали «Вулвз» победу со счетом 2: 1 на Эмирейтс, в результате чего «Арсенал» набрал 13 очков, отстав от лидера «Тоттенхэма» на восемь очков, с которым они столкнулись в воскресном дерби на севере Лондона.

Предшественник Артеты и испанский соотечественник Унаи Эмери был уволен за год до дня в воскресенье, когда клуб занимал восьмое место, но он утверждал, что был сосредоточен на будущем команды, а не на своем собственном.

«Это то, что в тот день, когда я решил стать тренером, я знал, что однажды меня уволят или уйду из футбольного клуба, но я не знаю, когда это произойдет», — сказал он репортерам.

«В этой профессии я знаю, что это произойдет, но я никогда не беспокоюсь об этом. Моя единственная забота — получить максимум от игроков и предоставить клубу наилучшие услуги».

«Арсенал» проиграл три последних домашних матча в чемпионате, и в воскресенье только два из 13 бросков попали в створ, что побудило Артета признать, что «на гору непросто взобраться».

В довершение ко всему, он подтвердил, что крайний срок в 45 миллионов фунтов стерлингов (80,4 миллиона долларов США) подписал Томаса Парти, который пропустил последние три игры из-за травмы против «Астон Виллы», скорее всего, не будет на протяжении всего этого матча месяц, включая напряженный рождественский график.

По поводу полузащитника он сказал: «Я не думаю, что он будет с нами в следующих нескольких играх, но все же нам не хватает многих игроков».

Пьер-Эмерик Обамеянг также переживает худшую засуху в своей карьере в «Арсенале» и худшую тренировку в форме за шесть лет. В этом сезоне он забил всего два гола, один с пенальти, и всего один мяч в воскресенье, что заставило Артета выразить обеспокоенность по поводу своей потери формы.

«Я думаю, мы все (обеспокоены), потому что главный бомбардир клуба в данный момент не забивает голы, поэтому меня больше всего беспокоит, как помочь ему больше забивать голы, потому что нам нужны его голы», — сказал он.«Он должен забивать голы, если мы хотим добиться успеха».

«Волки», напротив, набирают силу, поднимаясь на шестое место и опережая лидеров совместной лиги «Тоттенхэм» и «Ливерпуль» перед вчерашними играми.

Победа на выезде — их первая в «Арсенале» с 1979 года — была испорчена только тошнотворной битвой голов в первом тайме между Раулем Хименесом и Давидом Луисом, в результате чего последний оказался в крови, а первый растянулся.

Волков сказал, что мексиканский нападающий Хименес сломал себе череп и чувствовал себя «комфортно» после операции после игры.

Менеджер

Нуно Эспириту Санто сказал, что гордится своей командой за то, что она забыла об инциденте, добавив: «Мы были великолепны после этого, но особенно сегодня, потому что эта команда проявила сердце.

«Настоящая вера в то, как они работали и работали из-за того, что произошло. Мы хотим расти, мы хотим улучшаться и мы хотим найти решения».

АГЕНТСТВО ФРАНЦИЯ-ПРЕСС, РЕЙТЕР

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов.В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов. Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом исследования взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты.Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале. Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Рисунок 1 — Фёрстеровский резонансный перенос энергии Диаграмма Яблонски

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.Используя этот метод, молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что возможна молекулярная ассоциация. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же соседстве, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Визуализация флуоресценции с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает от относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применяя методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применяется для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представленный в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на рис. 1 , ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов для мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привели к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически кодируемая конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критически важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F люоресценция C комплементация; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция под названием cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов на начало седьмой цепи beta в остове флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных концов N и C и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками , могут быть объединены с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

Рисунок 2 — Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения протеазной активности

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на изменениях протонирования нативного (дикого типа) GFP, которые приводят к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в реальном времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. Рисунок 2 ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансный перенос энергии нечувствителен к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью событий, зависящих от растворителя, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Рисунок 3 — Переменные Фёрстера расстояния и коэффициента ориентации в FRET

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, более того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и уменьшении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

Формула 1 — Эффективность FRET

E _FRET = 1 / [1 + (правый / правый ₀ ) ⁶ ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно вычислить для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Фёрстера и обсуждается ниже более подробно).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний меньше R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний больше R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на рис. 3 (а) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерения часто могут различать только с высоким FRET, и с низким FRET, или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или забуференном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо известными входными параметрами:

Формула 2 — R (0)

R ₀ = [2,8 x 10 ¹⁷ × Κ ² × Q _D × Ε _A × Дж (λ)] ^1/6 нанометров

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя диполями флуорофора (см. рис. 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает на то, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами примерно так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень совмещения определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может изменяться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Почти для любой реалистичной ситуации (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы скорректировать это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам).Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Рисунок 4 — Интеграл перекрытия спектра возбуждения и излучения

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен 4-6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, возникающих в результате изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как в другом канале преобладает систематический шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET.Из-за того, что в действительности нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по взаимодействию белок-белок, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия фиксирована и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозного прохождения (также называемого перекрестными помехами и перекрестным перекрестным возбуждением ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. рис. 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора (, рис. 5 (а), ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора демонстрируют значительное перекрытие (, рис. 5 (b), ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, хорошо разделенных спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имеют значение (2) приблизительно ноль) или если они просто не расположены в пределах радиуса Ферстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждую из описанных выше проблем можно смягчить (или частично) путем осознанного выбора пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Рисунок 5 — Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, рис. 5 (а), ), так и излучения (, рис. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (а) построены в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP (, рис. 5 (b), ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всем диапазоне излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

• Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
• Фотообесцвечивание акцептора — Этот метод, также известный как расщепление донора , измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
• Флуоресцентная микроскопия для визуализации продолжительности жизни (FLIM) — Измерение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
• Спектральная визуализация — Возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
• Флуоресцентная поляризационная визуализация — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Сенсибилизированное излучение

Также обычно называемый двухцветным изображением с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для получения изображений с сенсибилизированным эмиссионным FRET разработано множество корректирующих подходов. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Рисунок 6 — Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированное излучение является особенно привлекательным методом при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, проиллюстрированный на Рис. 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля при ферментативном расщеплении пептидного линкера. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцепторное фотообесцвечивание

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и что акцептор фотообесцвечивается примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормирования этого значения на интенсивность донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, что ограничивает его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 являются примерами FRET-анализа сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцептора с использованием визуализации живых клеток. Фиг. 6 (a) иллюстрирует эпителиальную клетку карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующую биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) в , фиг. 6 (d) — (f), , были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 (, фиг. 6 (d), ; зеленый) и Cy5 (, фиг. 6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и нацеленный на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (e) ) увеличивает расщепление донора (усиление зеленой флуоресценции на рис. 6 (f) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале Только.

Флуоресцентная микроскопия для визуализации на протяжении всей жизни (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

Рисунок 7 — Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET-микроскопии

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование является дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Кроме того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но и различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Метод построения спектральных изображений требует специального оборудования, но отличные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рис. 7 (a) представляют собой изменения в уменьшении времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет собой энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль излучения от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (примерно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивностях на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Отображение поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, то излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Рисунок 8 — Получение изображений FRET с поляризационной анизотропией

Основная сила этого подхода — простота измерения поляризации флуоресценции, параллельной и перпендикулярной вектору возбуждения, с высоким отношением сигнал-шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку это может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов, имеющих числовую апертуру 1,0 или меньше.

Представлено в Рис. 8 — графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков (, рис. 8 (а), ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается во временной шкале эксперимента (, рис. 8 (b), ) или если он передает энергию возбуждения, обусловленную FRET, соседнему белку (, рис. 8 (c), ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансная передача энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (называемый бета -ствол или бета -кан ) и состоящий из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. фиг. 9 ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9 ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Рисунок 9 — Архитектурные особенности флуоресцентного белка

Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все флуоресцентные белки, обнаруженные на сегодняшний день, демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локализованная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы допустить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут дать сложные наборы данных, которые иногда могут быть скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация белков , Aequorea , в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Токсичность — это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и дуговых разрядных ламп высокой интенсивности.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации определенных белков с помощью хромофорной инактивации света ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако продолжительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов пригодны для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (от примерно 450 до 650 нанометров), тем самым заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. во всех цветовых классах. Недавние успехи в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы по разработке белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Эти белки, получившие названия Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. таблицу 1 ), дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей области спектра и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки можно легко визуализировать в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в сочетании с белками, излучающими желтый, и в них преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с CFP Aequorea и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки голубого спектрального класса. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP, названный CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ), был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Внедрение полезных мутаций , сворачивающих и в мономерные варианты ECFP, привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные super CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

Таблица 1 — Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET77 907 907

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно появилось новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальным альтернативным партнером FRET, излучающим зеленый цвет, для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, получившее название TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из самых универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны обеспечивать кандидатов, действующих как доноры, так и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. , Таблица 1, ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой мономерное производное медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), также был получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом, когда-либо разработанным, и демонстрирует приемлемую фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой при разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, еще предстоит установить пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо работает с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный апельсин кусабира, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

Проиллюстрировано на , рисунок 10, — спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10 (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно возрастают. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (красные и синие заштрихованные области соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение в экспериментах, требующих повторной визуализации.Однако mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый свет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (под названием mOrange2 ) с резко увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный оранжевый белок, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата для локализации и исследований FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самым ярким флуоресцентным белком в любом спектральном классе является тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов при локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Версия тандем-димера (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является его больший размер (вдвое больше, чем у мономерного белка), который может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияния, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах по визуализации многоцветных изображений, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентного белка желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, которые представляют собой первые генно-инженерные зонды истинного дальнего красного цвета. Самый потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. Рисунок 10 ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих далекую красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Katushka (максимум эмиссии 635 нанометров). Хотя «Катушка» ярче всего на две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, что важно для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое акцепторное возбуждение. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скоростей созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему обеспечивают наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET, использующий флуоресцентные белки, должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут произвести дальнейшую революцию в этом новом подходе к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

Белковая пара	Максимум возбуждения донора (нм)	Максимум излучения акцептора (нм)	Квантовый выход донора	Коэффициент молярной экстинкции акцептора	Яркость акцептора
EBFP2-mEGFP	383	507	0.56	57,500	4,8	1: 2
ECFP-EYFP	440	527	0,40	83,400	4,9	1: 4			1: 4		528	0,62	92,200	5,4	1: 2
MiCy-mKO	472	559	0,90 9077 -3	51,600			51,600				492	528	0.85	92,200	5,1	1: 1
CyPet-YPet	477	530	0,51	104,000	5,1	1: 4,5		1: 4,5			1: 4,5		610	0.60	72,000	5.1	2.5: 1
Venus-mCherry	528	610	0,57	72,000		5.7	528	581	0.57	138,000	5,9	1: 2
Venus-mPlum	528	649	0,57	41,000	5,2	13: 1