Вхл трансферы на сегодня: Трансферы ВХЛ 2021/22

Трансферы ВХЛ 2021/22

16.08	Соломатин Борис	Челмет	→	свободный агент
16.08	Бодров Евгений	Лада	→	Краковия
16.08	Алексеев Ярослав	Динамо МО	→	Южный Урал
16.08	Ли Никита	ХК Сочи	→	Дизель
16.08	Подзиньш Зигурдс	Северсталь	→	Дизель
16.08	Павликов Марк	ХК Сочи	→	Буран
15.08	Козлов Иван	ХК Сочи	→	Югра
15.08	Недилько Денис	Ермак	→	Тамбов
14.08	Калинин Александр	Локомотив	→	Ростов
14.08	Угольников Игорь	Нефтяник	→	Дизель
14.08	Большаков Сергей	Динамо Спб	→	Дизель
14.08	Костин Денис	Дизель	→	Динамо Спб
14.08	Здунов Павел	Дизель	→	свободный агент
14.08	Пищулин Данил	Тайфун	→	Дизель
13.08	Калинин Александр	ХК Сочи	→	Тамбов
13.08	Попов Никита	Тамбов	→	свободный агент
13.08	Сизов Антон	Северсталь	→	Рубин
13.08	Иванов Илья Д.	Буран	→	Южный Урал
12.08	Махрин Максим	Динамо Мск	→	Дизель
12.08	Луховской Никита	Динамо Мск	→	Дизель
12.08	Дубовик Максим	Буран	→	свободный агент
12.08	Попов Платон	Буран	→	свободный агент
12.08	Чувиляев Артур	Буран	→	свободный агент
11.08	Шуленин Дмитрий	Нефтяник	→	свободный агент
11.08	Жолобов Юрий	Ижсталь	→	свободный агент
11.08	Кокарев Денис	Динамо МО	→	Тамбов
10.08	Микулович Александр	Буран	→	Лада
10.08	Торопов Егор	Юниор-Курган	→	ЦСК ВВС
10.08	Антипин Вадим	Металлург Мг	→	Рубин
10.08	Грачёв Герман	Ижсталь	→	свободный агент
10.08	Кожемякин Глеб	Динамо МО	→	АКМ
09.08	Слепец Кирилл	Нефтяник	→	Спартак
09.08	Рангаев Станислав	Лада	→	Ак Барс
09.08	Лачинов Глеб	Ак Барс	→	Лада
09.08	Платонов Юрий	Зауралье	→	Рубин
08.08	Ефремов Семён	Дизель	→	Сахалинские Акулы
06.08	Крикуненко Роман	Торпедо НН	→	Югра
06.08	Чегошев Вячеслав	Ладья	→	Тамбов
06.08	Пульченко Захар	Тайфун	→	Буран
06.08	Попов Платон	Сокол	→	Буран
04.08	Яковлев Егор	Металлург Нк	→	Адмирал
03.08	Денежкин Максим	Локомотив	→	Лада
03.08	Стешенко Степан	Лада	→	Локомотив
03.08	Яценко Иван	Буран	→	Краковия
02.08	Козыркин Кирилл	Тамбов	→	свободный агент
02.08	Кривошеев Роман	Тамбов	→	свободный агент
02.08	Яковлев Алексей	Буран	→	Кристалл-Саратов
01.08	Юшков Максим	Алматы	→	Ижсталь
01.08	Лазарев Александр	Ермак	→	Омские Крылья
31.07	Ворошило Артём	Дизель	→	Краковия
30.07	Шевченко Вячеслав	Торос	→	Металлург Нк
30.07	Марков Андрей	Сарыарка	→	свободный агент
30.07	Шохов Антон	Сарыарка	→	свободный агент
30.07	Москалёв Василий	Сарыарка	→	свободный агент
30.07	Цуриков Владислав	Сарыарка	→	свободный агент
29.07	Мельничук Никита	СКА-Нева	→	свободный агент
29.07	Николаев Илья	Буран	→	Металлург-Жлобин
29.07	Мингалеев Денис	Юность	→	Южный Урал
29.07	Бокун Даниил	Динамо Спб	→	Шахтер-Солигорск
29.07	Мальцев Максим	Карлскруна	→	Химик
28.07	Александров Степан	Арлан	→	Торпедо УК
28.07	Кацевич Марк	МХК Динамо Мск	→	Ермак
28.07	Пачин Антон	Торос	→	Ермак
27.07	Гимбатов Магомед	СКА-Нева	→	Витебск
27.07	Володин Павел	Дизель	→	Арлан
27.07	Сошнин Никита	Барс	→	Витебск
27.07	Полохов Кирилл	Тамбов	→	Сарыарка
27.07	Ибрайбеков Мадияр	Номад	→	Сарыарка
27.07	Муратов Батырлан	Номад	→	Нове Замки
26.07	Корчагин Олег	Химик	→	Тамбов
26.07	Караваев Андрей	Алтай-Торпедо	→	Тамбов
26.07	Калиновский Ян	Номад	→	Алматы
25.07	Зюзякин Максим	Тамбов	→	Гутс
25.07	Осипов Александр	Нефтехимик	→	Рубин
25.07	Лапшов Игорь	Могилев	→	Динамо Спб
25.07	Морозов Егор	Спутник Альметьевск	→	Дизель
25.07	Стальнов Донат	Дизель	→	Химик
25.07	Орлов Егор Ю.	Торунь	→	Буран
23.07	Фаст Константин	Рубин	→	свободный агент
23.07	Устинский Игорь	Молот-Прикамье	→	Дизель
23.07	Рожков Никита	Металлург Мг	→	Рубин
22.07	Смирнов Илья	Кременчуг	→	ЦСК ВВС
20.07	Мухин Дмитрий	Химик	→	Ростов
20.07	Затонских Кирилл	Рязань	→	Буран
19.07	Кучерявенко Александр	Динамо Мск	→	Динамо Спб
19.07	Петров Дмитрий	Лада	→	АКМ
19.07	Юшков Александр	Кристалл-Саратов	→	Зауралье
19.07	Канашев Иван	Торос	→	Зауралье
18.07	Куршук Александр	Сарыарка	→	Горняк
18.07	Терещенко Артём	Рязань	→	Горняк
18.07	Колягин Андрей	Лада	→	Горняк
18.07	Костин Денис	Дизель	→	свободный агент
18.07	Локтев Андрей	Динамо-Алтай	→	Металлург Нк
17.07	Боровиков Станислав	Арлан	→	Торпедо УК
17.07	Евдокимов Ярослав	Сарыарка	→	Арлан
17.07	Хайруллин Тимур	Зауралье	→	Металлург Нк
15.07	Чуркин Андрей	Югра	→	Северсталь
15.07	Молодцов Дмитрий	Молот-Прикамье	→	Сарыарка
15.07	Синягин Денис	Динамо Спб	→	Адмирал
15.07	Баин Максим	Химик	→	Металлург Нк
14.07	Колмыков Максим	Дизель	→	Северсталь
14.07	Алексеев Егор	Лада	→	Дизель
14.07	Любишкин Никита	Кристалл-Саратов	→	Дизель
14.07	Пачин Антон	Торос	→	Дизель
14.07	Платонов Данила	Лада	→	Дизель
14.07	Лукин Никита	Буран	→	Арлан
13.07	Наумов Владислав	Югра	→	Амур
13.07	Марковин Дмитрий	Витязь	→	Югра
13.07	Зиновьев Данил	Челмет	→	Адмирал
13.07	Юньков Михаил	Спартак	→	Химик
13.07	Шахворостов Виктор	Южный Урал	→	Ростов
13.07	Астанков Евгений	Металлург-Жлобин	→	Металлург Нк
13.07	Ковалёв Антон	Тамбов	→	Дизель
13.07	Глухов Николай	СКА-Нева	→	Адмирал
13.07	Павликов Марк	Лада	→	ХК Сочи
13.07	Гордеев Михаил	Ижсталь	→	ХК Сочи
13.07	Корепанов Артём	Звезда	→	Адмирал
13.07	Ли Никита	Дизель	→	ХК Сочи
12.07	Никулин Владислав	Сарыарка	→	Химик
12.07	Баранов Александр С.	Сахалинские Акулы	→	Рязань
12.07	Шепелев Валентин	МХК Крылья Советов	→	Рязань
12.07	Гнездилов Николай	Сарматы	→	Рязань
12.07	Мельник Даниил	Сахалинские Акулы	→	Рязань
12.07	Гундырев Дмитрий	Сибирские Снайперы	→	Рязань
12.07	Каштанов Иван	Ростов	→	Шахтер-Солигорск
12.07	Сергеев Дмитрий	Ростов	→	Омские Крылья
12.07	Салахов Максим	Нефтяник	→	Адмирал
12.07	Желнеровский Дмитрий	Сарыарка	→	Дизель
12.07	Емельянов Никита	Дизель	→	Рязань
12.07	Тымченко Матвей	Торпедо УК	→	Буран
12.07	Чиглинцев Александр	Буран	→	Алматы
11.07	Савицкий Кирилл	Торпедо УК	→	Барыс
11.07	Кудашев Данил	Ростов	→	ХК Сочи
10.07	Меньщиков Александр	Торпедо УК	→	Арлан
09.07	Макаренко Павел	Тамбов	→	Адмирал
09.07	Лапин Даниил	Нефтяник	→	Торпедо НН
09.07	Мастрюков Алексей	Лада	→	Адмирал
09.07	Калетник Владислав	Ермак	→	Адмирал
09.07	Казаманов Владислав	Динамо МО	→	Адмирал
09.07	Верба Марк	Динамо МО	→	Адмирал
09.07	Феклистов Андрей	Шахтер-Солигорск	→	Динамо Спб
09.07	Борисенков Александр	Югра	→	Адмирал
09.07	Буяльский Егор	Юность	→	Челмет
09.07	Михайлов Никита	ЦСК ВВС	→	Адмирал
09.07	Шитиков Дмитрий	Арлан	→	Торпедо УК
09.07	Глухов Николай	СКА-Нева	→	свободный агент
09.07	Крамаренко Юрий	Кристалл-Саратов	→	Ростов
09.07	Пяткин Денис	Сахалинские Акулы	→	Ростов
09.07	Григоренко Евгений	Лада	→	Адмирал
09.07	Зимин Никита	Амур	→	Динамо Спб
09.07	Арсенюк Дмитрий	Дизель	→	Адмирал
09.07	Патрикеев Михаил	Дизель	→	Адмирал
09.07	Грачёв Герман	Горняк Уч	→	Ижсталь
09.07	Зюзин Антон	Салават Юлаев	→	Буран
09.07	Мисюль Олег	Кулагер	→	Буран
08.07	Попов Олег	Гомель	→	Динамо Спб
06.07	Басистый Кирилл	Ермак	→	Ростов
06.07	Рубинчик Марк	Челмет	→	Динамо Спб
05.07	Васильев Даниил	Иртыш	→	Звезда
05.07	Зайцев Дмитрий В.	Алмаз	→	Звезда
05.07	Курбатов Владислав	ХК Сочи	→	СКА-Нева
05.07	Солянников Георгий	ХК Сочи	→	СКА-Нева
05.07	Осин Александр	Динамо МО	→	Ижсталь
05.07	Петраков Иван В.	Крефельд Пингвин	→	Динамо Спб
05.07	Большаков Александр	Краматорск	→	Буран
04.07	Янков Андрей	Кулагер	→	Торпедо УК
04.07	Сальвассер Дмитрий	свободный агент	→	Ижсталь
04.07	Баснев Станислав	Сахалинские Акулы	→	Ижсталь
04.07	Коротин Вячеслав	ННГУ Нижний Новгород	→	Ижсталь
04.07	Ахметзянов Ришат	ЦСК ВВС	→	Ижсталь
04.07	Волков Виктор	свободный агент	→	Ижсталь
04.07	Кадочников Данил	Дизель	→	Кулагер
03.07	Бекетаев Адиль	Торпедо УК	→	Барыс
03.07	Дёмин Павел	свободный агент	→	Лада
03.07	Бочкарёв Валерий	Шахтер-Солигорск	→	Лада
03.07	Поляков Никита	свободный агент	→	Лада
03.07	Герцик Владислав	Алмаз	→	Лада
03.07	Соколов Константин	Тамбов	→	Зауралье
03.07	Червоненко Владислав	Буран	→	Лада
03.07	Конев Андрей	Торпедо УК	→	свободный агент
03.07	Меньщиков Александр	Торпедо УК	→	свободный агент
03.07	Тымченко Матвей	Торпедо УК	→	свободный агент
03.07	Обрядин Ярослав	Торпедо УК	→	свободный агент
03.07	Кулда Эдгарс	Металлург Нк	→	Динамо Р
03.07	Шапорев Герман	Витязь	→	Барс
02.07	Синицын Роман	Чайка	→	ЦСК ВВС
02.07	Назаренко Никита	Номад	→	Алтай-Торпедо
30.06	Разумняк Валентин	Химик	→	Шахтер-Солигорск
30.06	Михайлов Эдуард	Торпедо УК	→	Арлан
30.06	Полошков Иван	Донбасс	→	Торпедо УК
30.06	Скворцов Юрий	СКА-Нева	→	свободный агент
30.06	Чередниченко Сергей	ЦСК ВВС	→	Лада
29.06	Полыгалов Игорь	Трактор	→	Нефтяник
29.06	Захарчук Степан	Рытиржи Кладно	→	Нефтяник
29.06	Шуленин Дмитрий	Юность	→	Нефтяник
29.06	Чурляев Михаил	Лада	→	Гомель
29.06	Берестенников Илья	Ермак	→	Ростов
29.06	Угольников Игорь	Нефтяник	→	Динамо Спб
29.06	Жарков Даниил	Динамо Спб	→	Нефтяник
29.06	Барабанов Владимир	Динамо Спб	→	СКА-Нева
29.06	Карпов Константин	Ледяные Волки	→	ЦСК ВВС
28.06	Епишин Михаил	Динамо Спб	→	Витязь
28.06	Акишин Дмитрий	Рубин	→	Арлан
28.06	Дервук Илья	Химик	→	Омские Крылья
28.06	Угольников Александр	Торпедо УК	→	Омские Крылья
28.06	Кравченко Вадим	Рубин	→	Омские Крылья
26.06	Рябоконов Алексей	Ижсталь	→	Арлан
26.06	Хамидуллин Динар	Нефтяник	→	Адмирал
26.06	Крутов Никита	Зауралье	→	ХК Сочи
25.06	Куянов Денис	Ростов	→	свободный агент
25.06	Каштанов Иван	Ростов	→	свободный агент
25.06	Чупятов Георгий	Дизель	→	Академия Михайлова
25.06	Бухряков Дмитрий	Горняк Уч	→	Академия Михайлова
25.06	Иванов Илья Д.	Буран	→	Академия Михайлова
25.06	Стариков Лев	Куньлунь Ред Стар	→	Барс
25.06	Белоглазов Владимир	ЦСК ВВС	→	Бейбарыс
24.06	Беляков Фёдор	Югра	→	Адмирал
24.06	Смирягин Роман	Лада	→	Южный Урал
24.06	Жолобов Юрий	Поруба	→	Ижсталь
24.06	Якуценя Жан	Тюменский Легион	→	Ижсталь
24.06	Калмыков Даниил	Ермак	→	Ижсталь
23.06	Глущенко Алексей	Зауралье	→	свободный агент
23.06	Горбунов Денис	Лада	→	Дизель
23.06	Субхи Нассер	Гомель	→	Барс
23.06	Качеловский Олег	Гомель	→	Барс
23.06	Фищенко Иван	Югра	→	Юность
22.06	Тертышный Никита	Югра	→	Трактор
22.06	Поддубный Герман	Сарыарка	→	Шахтер-Солигорск
22.06	Градович Артём	СКА-Нева	→	Шахтер-Солигорск
21.06	Хамидуллин Динар	Нефтяник	→	свободный агент
21.06	Шураков Денис	Южный Урал	→	Ермак
21.06	Басимов Спартак	Северсталь	→	Ермак
21.06	Смирнов Кирилл	Химик	→	Ермак
21.06	Севостьянов Артем	Бейбарыс	→	Ермак
21.06	Ситдиков Ильяс	Барс	→	Ермак
21.06	Кулда Эдгарс	Металлург Нк	→	свободный агент
21.06	Бобряшов Никита	Торпедо НН	→	Лада
21.06	Афанасьев Кирилл	Ижсталь	→	Шахтер-Солигорск
20.06	Банников Андрей	Торос	→	Зауралье
19.06	Бояркин Никита	Сарыарка	→	Барыс
19.06	Яковлев Андрей	Номад	→	Сарыарка
19.06	Клещенко Никита	Номад	→	Сарыарка
19.06	Данияр Саян	Номад	→	Сарыарка
19.06	Каратаев Денис	Номад	→	Сарыарка
19.06	Афонасьевский Семён	Звезда	→	Зауралье
17.06	Нургалиев Арсен	Южный Урал	→	Авангард
16.06	Светов Владислав	Чайка	→	ЦСК ВВС
16.06	Шутов Андрей	Торпедо УК	→	Барыс
15.06	Бондарев Алексей	свободный агент	→	Динамо МО
15.06	Лисов Никита	Динамо Спб	→	СКА-Нева

Трансферы ТХК, победные серии и все лучшее за неделю ВХЛ

ТРАНСФЕРЫ НЕДЕЛИ

Прошедшая неделя в первую очередь ознаменовалась тем, что лидер чемпионата – ТХК – расстался сразу с шестью ведущими игроками. С начала сезона много говорилось о финансовых проблемах клуба, с которыми он может столкнуться ближе к Новому году. Но, глядя на таблицу и состав тверичей, болельщики других команд в это не верили. Что ж, теперь, похоже, слова становятся реальностью.

За неделю ТХК потерял обладателя «Братины»-2016, защитника Станислава Заборникова, форвардов Артура Сарварова (один из лучших бомбардиров лиги), Артура Скородумова, Михаила Потякина, Ивана Иванова и Дмитрия Кириллова. Если называть вещи своими именами, то это лучший защитник команды и четыре из пяти ее лучших бомбардиров на данный момент. Плюс Потякин, который отдал ТХК десять лет жизни, и, казалось, уже никуда из Твери не уедет.

Теперь на повестке дня у тверских болельщиков один вопрос: это все потери или клуб и дальше продолжит распродажу. А заменяют ушедших, как вы понимаете, не только помощники из «Витязя», но и совершенно необстрелянная на уровне ВХЛ молодежь из МХЛ.

Прошедшая неделя ознаменовалась вообще большим количеством трансферов ярких игроков ВХЛ. Похоже, началась активизация клубов для решения поставленных на сезон задач.

Причем речь идет не только о ВХЛ, но и о КХЛ. А в особенности о хабаровском «Амуре». Его наставник Мисхат Фахрутдинов, который в ВХЛ собаку съел и выиграл все, что только можно, не стесняется прибегать к услугам хоккеистов из «вышки», зная, что они могут принести реальную пользу. Так, за прошедшую неделю в Хабаровск уехали: один из лучших бомбардиров ВХЛ, форвард «СКА-Невы» Денис Орлович-Грудков; его одноклубник, ведущий защитник питерцев Михаил Тихонов; те же самые Забоников и Кириллов; и американец из «Звезды» Джастин Барнетт. А ведь есть еще Вадим Хлопотов, который сменил Чехов на Новосибирск. В общем за неделю лига потеряла шестерых ярких игроков.

Но не только на повышение уходят хоккеисты, идет курсирование и внутри ВХЛ. Так, «Рубин» забрал у ТХК Потякина и Скородумова, Иванов теперь в «Торпедо» у Алексея Ждахина, который по прошлому году прекрасно знает, как использовать этого форварда, в «Сарыарку» вернулся Анатолий Васильев, а Воробьев в ту же Тюмень, где капитанил в прошлом году. И это далеко не все трансферы. А главное, самая жара в этом вопросе, похоже, только начинается.

ОТСТАВКИ НЕДЕЛИ

Пошли два клуба на радикальные шаги и в тренерском вопросе. Так, ХК «Рязань» отправил в отставку Павла Десяткова, который к тому моменту имел за плечами серию из трех побед. Да, «горожане» занимали всего лишь 17-е место и отдали очко «Бурану» в домашнем матче. Но при этом команда набрала более 52 % очков, и это самый высокий процент отставленного тренера в нынешнем сезоне. Кстати, после отставки уже при и.о. Алексее Алексееве «Рязань» продлила серию до пяти побед.

А в Перми расстались с Маратом Аскаровым и Сергеем Соломатовым. Им на смену пришли Сергей Востриков и опытнейший Николай Казаков. Правда, тут результат встряски пока определить трудно, пока что пермяки сыграли только один матч и выиграли у «Ижстали». Но до этого у «молотобойцев» было четыре поражения кряду.

СЕРИИ НЕДЕЛИ

Что ж, продолжим о сериях. Тем более, что на прошедшей игровой недели прервались две очень длительные.

«Спутник» все-таки не дотянул до десяти побед, оступившись на отметке «девять». Остановил его «Торос», но только по буллитам. А вот «Ариада-НХ» одержала полноценную викторию – в основное время, одолев в Воронеже «Буран». Ее серия поражений остановилась на пятнадцати эпизодах.

Из того, что поменьше, отметим, что «Химик» проиграл после шести побед, а обескровленный уже к тому моменту ТХК выиграл после трех поражений.

На данный момент набирают силу победные серии «Торпедо», «СКА-Невы» и «Сарыарки», а «Дизель», «Барс», «Буран» и – внимание – «Нефтяник». Чемпион проиграл уже пять раз подряд. То ли еще будет?

ЛАУРЕАТЫ НЕДЕЛИ

Лучшим голкипером недели признан Андрей Филоненко из «Звезды», который сыграл в двух победных матчах, отражая в среднем 96,5% бросков в створ ворот. Коэффициент надежности голкипера составил 0,99. В одном матче Андрей оставил свои ворота в неприкосновенности.  

Лучшим защитником стал Максим Иванов из «Ариады-НХ», на счету которого в четырех встречах 2 (0+2) очка при показателе полезности «+6». 

Лучшим нападающим недели стал Георгий Сергеенко из «Звезды», в активе которого в трех матчах 5 (3+2) баллов за результативность при показателе полезности «+2». Георгий также отметился одной победной шайбой.

Лучшим новичком стал нападающий Александр Борисенков из «Ариады-НХ», на счету которого в четырех встречах 5 (2+3) очков при показателе полезности «+3». 

Федерация хоккея России

 

Обменный Пулккинен: самые громкие переходы КХЛ | Статьи

Регулярный чемпионат Континентальной хоккейной лиги (КХЛ) подходит к своему экватору. И хотя команды сыграли только половину из 60 матчей, приблизительные контуры участников плей-офф уже сложились. Обмены и новые приобретения в КХЛ разрешены до 30 декабря. К этому времени лидеры стараются максимально усилиться, собрав с рынка игроков сливки или хоть что-то, чем можно поживиться, ведь хорошие хоккеисты всегда в дефиците, не говоря уже о звездах. Разбираем главные обмены ноября.

За одного шведа — трех молодых

Первые трансферы случились на днях. Занимающий предпоследнюю строчку «Сочи» отдал в СКА одного из своих лучших форвардов — шведа Мальте Стремвалля — в обмен на трех молодых игроков из системы клуба — защитника Владислава Валенцова, нападающих Ивана Володина и Владислава Курбатова, выступающих в ВХЛ за фарм-клуб петербуржцев «СКА-Нева».

В российских спортивных СМИ эта сделка не вызвала одобрения. КХЛ который год борется за спортивное выравнивание участников чемпионата, а тут сочинцы отдают в более богатый и успешный клуб своего едва ли не лучшего игрока. У СКА и южан особое сотрудничество: хоккеисты из Петербурга, которые уже переросли уровень ВХЛ, но еще не доросли до СКА, посылаются на обкатку в «Сочи». Получается полезное для российского хоккея дело, вот только спортивные задачи южного клуба никто не отменял.

Стремвалль — неплохой нападающий для КХЛ. Он сумел сходу стать лидером сочинцев, набрав в 59 матчах прошлого сезона 39 (21+18) очков и 16 (8+8) в 26 играх нынешнего. Имеет опыт выступления за сборную Швеции, но только на этапах Евротура, на чемпионаты мира из-за высокой конкуренции он ни разу не попадал. По той же причине швед не смог пробиться в «Рейнджерс», застряв в их фарм-клубе из АХЛ «Хартфорд», затем вовсе спустившись в лигу рангом ниже — ECHL, после чего вернулся в Европу и провел два ударных сезона в Финляндии за «КооКоо».

Подобные сделки, когда слабые клубы отдавали своих ведущих игроков в более сильные, происходили в КХЛ и раньше. Наиболее яркие примеры можно привести из сезона-2011/12. Не попадавшие в плей-офф «Витязь» и «Сибирь» отдали в «Ак Барс» и СКА Артемия Панарина и Владимира Тарасенко, будущих суперзвезд мирового хоккея. В случае со Стремваллем ситуация еще яснее: «Сочи» практически распрощался с задачей попасть в плей-офф, а Стремвалль получает далеко не маленькую зарплату. Платить игроку, который всё равно уже не поможет достичь клубу его главной задачи, смысла мало.

Трое игроков из системы СКА имеют среднюю перспективу вырасти в ведущих хоккеистов лиги, но при должной работе вполне могут раскрыться. Пока что спортивный менеджмент и тренерский состав сочинцев во главе с бывшим игроком НХЛ Андреем Зюзиным и главным тренером Евгением Ставровским с этой задачей справляются неважно, и дело далеко не только в 10-м месте таблицы «Запада».

— На мой взгляд, обмен между СКА и ХК «Сочи» выгоден обеим сторонам, — отметил «Известиям» двукратный олимпийский чемпион Александр Кожевников. — Стремвалль — очень хороший форвард, который может приносить немало пользы, в том числе и в более сильном клубе. Для СКА это отличное приобретение, только с его приходом у армейцев получается перебор легионеров. Хотя, с другой стороны, длинная скамейка никому никогда не мешала. Руководство СКА уже думает о плей-офф, где как раз глубина состава играет очень важный фактор. Что же касается сочинского клуба, то взамен одного игрока они получают троих голодных до хоккея молодых ребят. Курбатов, Володин и Валенцов получат много игровой практики, а самое главное — опыт выступления в КХЛ.

Скандинавская рокировка

Другая сделка не вызвала такого ажиотажа. Хотя кто-то их экспертов назвал ее обменом топ-игроками, на деле, судя по последним результатам, это далеко не так. Ярославцы отправили в московское «Динамо» шведского форварда Магнуса Пяярви-Свенссона, получив взамен финна — нападающего Теему Пулккинена.

Последний с юных лет считался очень перспективным, играя за все возрасты сборной Финляндии, дважды выступал на ЮЧМ и МЧМ. Затем решил сходу штурмовать НХЛ, но не закрепился сначала в «Детройте», затем в «Миннесоте» и «Аризоне». Устав от скитаний по фарм-клубам, Пулккинен пришелся ко двору в минском «Динамо», а в прошлом сезоне призван был усилить второе звено «Динамо» московского, где нет проблем с первой тройкой, по сравнению с которой у остальных полный провал. Только вот самого опытного тренера КХЛ Владимира Крикунова технарь Пулккинен не убедил и теперь будет завоевывать место в составе у Андрея Скабелки, у которого лимит на техничных игроков давно исчерпан — для игровой системы ему нужны «работяги-копатели».

Магнус Пяярви — несмотря на финскую фамилию, поданный шведского королевства. Его карьера очень похожа на карьеру Пулккинена, только этот швед имеет солидный опыт выступления за главную сборную и звание чемпиона мира. Пяярви прибыл в «Локомотив» в прошлом году после сезона в «Оттаве», где в 80 играх он набрал 19 (11+8) очков. В Ярославле он набрал столько же, но за 39 игр. Раскроется ли шведский форвард в «Динамо» или окончательно поедет с ярмарки — большой вопрос, ответ на который мы узнаем в ближайшие три месяца.

— Обмены происходят тогда, когда менеджеры клубов видят плюсы в этой сделке, — сказал «Известиям» комментатор КХЛ ТВ Леонид Вайсфельд. — Затрудняюсь сказать, чем руководствовался «Динамо» в этом обмене. На мой взгляд, от этого события «Локомотив» больше выиграл, чем бело-голубые. Относительно Теему Пулккинена скажу, что он хороший форвард, обладающий доминирующими качествами. Он наверняка усилит ярославский клуб.

Еще одним важным событием в КХЛ стал обмен между ЦСКА и «Салаватом Юлаевым». В Москву отправился форвард Никита Сошников, а клуб из Уфы взамен получил защитника Михаила Науменкова.

Кузня провела топовые трансферы! Собирается мощный состав

Новокузнецкий хоккейный клуб подписал контракт с игроками:

Дмитрий Акишин (21.04.1992) – воспитанник челябинской школы хоккея. Сезон 2018/19 начинал в усть-каменогорском «Торпедо». Сыграв 1 матч за клуб из Казахстана, перешел в ХК «Тамбов», в составе которого провел 28 поединков, набрал 7 (2+5) очков при показателе полезности «-7». По проценту реализованных бросков (6,9%) Акишин вошел в тройку лучших защитников команды.

В Высшей лиге Дмитрий ранее выступал за «Дизель», «Сокол», «Спутник» «Динамо» (Балашиха). В общей сложности в ВХЛ сыграл 304 матча, заработал 52 (17+35) балла, полезность составила «-17». В КХЛ защитник имеет опыт выступления не только в составе «Металлурга». В сезонах 2012/13 и 14/15 провел за московское «Динамо» 7 матчей.

В Молодежной хоккейной лиге Акишин дважды становился полуфиналистом розыгрыша Кубка Харламова. Выступал за «Белых Медведей», ХК МВД, «Шериф», «Белых Тигров» — 197 матчей, 25 (8+17) очков, полезность «+7».

В 2015 году в составе сборной России стал победителем Универсиады, проходившей в испанской Гранаде.

Александр Юксеев (05.03.1988) – воспитанник екатеринбургской школы хоккея. В сезоне 2018/19 выступал за победителя регулярного чемпионата Высшей лиги, полуфиналиста Кубка Петрова – «СКА-Неву». В клубе из Санкт-Петербурга провел 34 встречи, набрал 14 (1+13) очков, полезность составила «+10». В плей-офф нанес максимальное число бросков в створ в команде среди игроков обороны (25 в 12 матчах), по показателю полезности уступил только одному защитнику «армейцев».

В ВХЛ, помимо команды из Санкт-Петербурга, на протяжении 5 сезонов играл за «Сарыарку», а в начале карьеры выступал в «Зауралье». Начиная с чемпионата 2006/07 на уровне Высшей лиги провел 473 матча, набрал 174 (39+135) очка при показателе полезности «+61».

Наибольших успехов в ВХЛ Юксеев добился в составе «Сарыарки». В 2014 году клуб из Караганды стал обладателем Братины, а в двух следующих сезонах играл в полуфиналах плей-офф. Отметим, что ни один из 7 прошедших сезонов Высшей лиги Александр не завершал с отрицательным показателем полезности. По итогам сезона 2015/16 Юксеев был официально признан лучшим защитником ВХЛ.

В КХЛ Александр имеет опыт выступления за «Авангард», «Амур», «Автомобилист» и «Северсталь» — 44 матча, 4 (2+2) очка, полезность «-13».

Эрикс Шевченко (28.04.1991) – уроженец города Даугавпилс. В сезоне 2018/19 выступал в Высшей лиге за «Югру» — 50 матчей, 17 (5+12) очков, полезность «+21». Среди бомбардиров-защитников команды занял 2 место в регулярном чемпионате. По проценту реализованных бросков для игроков обороны, проведших не менее 17 матчей, Эрикс стал лидером ханты-мансийцев (7,8%). В регулярном чемпионате Шевченко оказался самым полезным хоккеистом «Югры», заработав «+23».

В Высшей лиге Шевченко, помимо «Югры», провел по одному сезону в «Ценг Тоу» и «Сарыарке», с которой дошел до полуфинала плей-офф в 2015 году. Всего в ВХЛ – 146 матчей, 51 (14+37) очко, полезность «+30».

В Континентальной хоккейной лиге Эрикс играл за рижское «Динамо» — 31 матч, 3 (1+2) очка, полезность «+1». Ригу защитник представлял и в соревнованиях МХЛ, в том числе на Кубке мира молодежных клубных команд – 117 матчей, 30 (6+24) баллов за результативность, полезность «-10».

Новичок «Металлурга» имеет большой опыт выступления в зарубежных турнирах. Так Эрикс поиграл в чемпионатах Латвии, Беларуси, Норвегии и в североамериканской Хоккейной лиге Восточного побережья (ECHL). В сезоне 2009/10 Шевченко стал чемпионом Латвии, в 2010 году в составе молодежной сборной своей страны занял 1 место на чемпионате мира 1 дивизиона.

Артем Чернов (28.04.1982) – воспитанник новокузнецкого хоккея. В сезоне 2018/19 играл за «Торос», занявший 3 место в регулярном чемпионате и дошедший до полуфинала Кубка Петрова. Нападающий в 62 матчах набрал 42 (20+22) очка при показателе полезности «+29». Чернов стал вторым среди бомбардиров клуба в регулярном чемпионате, а по проценту реализованных бросков равных ему в команде и вовсе не оказалось – 26,9%. По показателю полезности («+28») среди всех хоккеистов ВХЛ в регулярном чемпионате нападающий оказался в семерке лучших.

Напомним, что Артем Чернов играл за «Металлург» в сезоне 2017/18 и в 60 поединках набрал 39 (21+18) очков, полезность составила «+13». Больше баллов за результативность в розыгрыше Кубка Петрова среди новокузнечан тогда заработал только Даниил Романцев.

В составе «Металлурга» Артем дебютировал еще в сезоне 1999/2000, когда наша команда стала бронзовым призером чемпионата России. Тогда «Металлург» дошел до полуфинала плей-офф, где уступил будущему победителю турнира — московскому «Динамо».

Чернов является одним из первых воспитанников новокузнецкой школы хоккея, кто был задрафтован в НХЛ — в 2000 году спортивные права на Артема получил «Даллас». Но в Национальной хоккейной лиге нападающий так и не сыграл, выступая только за клубы России и Беларуси.

За свою карьеру на уровне сильнейшей хоккейной лиги России Артем Чернов выступал за новокузнецкий «Металлург», «Авангард», «Спартак», ХК МВД, московское «Динамо», «Торпедо», «Автомобилист», «Атлант», «Салават Юлаев», «Нефтехимик» и «Витязь». Провел 571 матч, набрал 239 (109+130) очков. В составе «Динамо» в 2012 году стал обладателем Кубка Гагарина, в 2016-м завоевал бронзу вместе с уфимским клубом

В Высшей лиге сыграл 157 матчей, набрал 108 (55+53) очков, полезность составила «+45».

Александр Печурский (04.06.1990) – воспитанник магнитогорского хоккея. В минувшем сезоне в составе клуба из Усть-Каменогорска сыграл наибольшее число матчей среди голкиперов – 32, отметившись результативной передачей. Процент отраженных бросков составил 91,7 при коэффициенте надежности 2,36.

«Торпедо» в регулярном чемпионате оба раза обыграло нашу команду с одинаковым счетом 4:2. В Усть-Каменогорске после 12 минут встречи хозяева уступали «Металлургу» 0:2, но все переменилось с выходом на замену Печурского. В поединке в Новокузнецке Александр играл уже с первых минут и отразил 30 бросков.

В Высшей лиге, помимо «Устинки», выступал за «Ценг Тоу», «Южный Урал» и «Титан» — 121 матч (8 на ноль), набрал 4 (0+4) очка, процент отраженных бросков составил 92,1 при коэффициенте надежности 2,25.

На уровне сильнейшей лиги России дебютировал в чемпионате 2007/08. Большую часть карьеры на клубном уровне входил в состав магнитогорского «Металлурга», за чемпионский состав которого выступал в сезоне 2013/14. Также опыт игры в КХЛ имеет за хабаровский «Амур». Статистика в Континентальной лиге: 64 матча (1 на ноль), набрал 2 (0+2) очка, процент отраженных бросков составил 90,9 при коэффициенте надежности 2,69.

В Молодежной хоккейной лиге выступал за «Стальных Лис»: 34 матча (1 на ноль), процент отраженных бросков 92,0; коэффициент надежности 2,42. В сезоне 2009/10 принимал участие в играх команды в регулярном чемпионате, которая затем стала первым обладателем Кубка в истории МХЛ, в 2012 году дошел с «Лисами» до ½ финала.

В 2008 году был задрафтован в НХЛ. За «Питтсбург» в итоге Александр провел 1 матч в сезоне 2009/10, выйдя на замену. Тогда в поединке с «Ванкувером» вратарь отразил 12 бросков из 13 и стал третьей звездой встречи.

Александр Печурский дважды завоевывал медали юниорского чемпионата мира в составе сборной России: в 2007 году стал чемпионом, а на следующий сезон – серебряным призером.

Алексей Кириллов (18.06.1993) – воспитанник новокузнецкого хоккея. В сезоне 2018/19 играл в ВХЛ за «Химик», провел 56 матчей, набрал 16 (7+9) очков при показателе полезности «+1». В регулярном чемпионате среди защитников воскресенцев показал лучший результат по заброшенным шайбам, проценту реализованных бросков (9,9%), баллам за результативность. В плей-офф получил второе среднее игровое время в «Химике» (22:19).

До этого, в трех предыдущих сезонах, имел игровую практику не только в ВХЛ, но и в Континентальной лиге, где выступал за «Спартак» и «Ладу» — 97 матчей, 8 (2+6) очков, полезность «-21». В сезоне 2017/18 занял 1 место среди защитников тольяттинского клуба по числу силовых приемов (54 в 38 поединках) и вошел в тройку лучших игроков обороны по количеству блокированных бросков (57).

В Высшей лиге, помимо «Химика», провел 2 матча за ЦСК ВВС. Всего в ВХЛ – 74 встречи, 24 (11+13) очка, полезность «-4». В МХЛ в 4 сезонах играл за «Кузнецких Медведей», провел несколько матчей за «Ладью» и Бердск, отыграв затем полноценный чемпионат за МХК «Спартак». Итого в лиге Кириллов сыграл 249 матчей, заработал 82 (16+66) балла за результативность, полезность составила «+46».

Алексей Кириллов является участником двух встреч за Кубок Вызова МХЛ, имеющих статус матчей лучших игроков лиги.

Источник: пресс-служба «Металлурга»

ХК «Авангард» | Новости | «Кубань» и «Лада» снимают сливки. Топ-10 трансферов ВХЛ

10. Никита Давыдов: из «Атланта» в «Кубань»

«Грифоны» этим летом в хорошем смысле озадачивают своих только втягивающихся в хоккей болельщиков. Послужной список новичков внушает оптимизм и уважение. И в случае с «Кубанью» заявления о решении серьёзных задач бравадой уже не выглядят. Но о главном приобретении «южан» мы поговорим позже, а пока представляем — голкипер Никита Давыдов. Воспитанник уфимского хоккея в сезонах-2009-2011 с успехом защищал цвета одного из лидеров

ВХЛ — нефтекамского «Тороса». В сезоне-2011/12 23-летний Никита очень прилично смотрелся на фоне «дядьки» Виталия Колесника и шведской надежды «Салавата» Эрика Эрсберга. После этого последовал не самый продуктивный сезон в «Атланте».

Нетрудно предположить, что переход в амбициозную «Кубань» станет для Давыдова огромной мотивацией. Никита невысокого роста, но за счёт массы создаёт впечатление очень габаритного вратаря. Он здорово занимает позицию и обладает прекрасной реакцией. Очевидно, что и клуб, и хоккеист только выиграют от этого союза: «грифоны» получат мотивированного и хорошо обученного первого номера, имеющего опыт игры в

Никита Давыдов теперь вратарь «Кубани»

финале ВХЛ, а Никита — шанс выйти на новый виток карьеры.

9. Евгений Чемерилов: из «Ермака» — в «Ладу»

В Тольятти не скрывают намерений вернуться в КХЛ. Процесс этот, надо понимать, непростой. Необходимо решить массу нехоккейных проблем. Однако же строить костяк будущей команды нужно уже сейчас. И волжане показывают, что работа ведётся. Евгений на протяжении последних двух сезонов является лидером атак очень зубастой и ровной команды из Ангарска. 27-летний форвард сейчас на пике формы и способен помочь в решении задач любой степени сложности. За плечами воспитанника омского хоккея опыт выступления за несколько клубов высшей лиги, роль ветерана ему примерять рановато, а вот бремя лидера атак — самое оно. Евгений отлично видит площадку и превосходно играет в подыгрыше. Готовый край для первого звена дружины Игоря Жилинского.

8. Максим Хапов: из «Нефтяника» — в «Рубин»

Тюменская дружина каждое лето находится на передовой трансферных баталий, совершая одно сенсационное приобретение за другим. В прошлое межсезонье лишь «Сарыарка» смогла потягаться со спортивно-селекционной службой «Рубина». После поражения уже на стадии четвертьфинала розыгрыша «Братины» «рубиновые» вновь вернули себе былую мотивацию и нагуляли голод до новых трофеев. Приобретений в Тюмени несколько, начнём с воспитанника казанского «Ак Барса» Максима Хапова. Максиму уже 28 лет, и с сезона-2009/10 он выступает в альметьевском «Нефтянике», где сразу стал лидером атак.

Романа с КХЛ у Хапова не получилось, но в

ВХЛ он заслужил репутацию крайне неудобного форварда. Обладая внушительными габаритами, Максим с готовностью идёт в борьбу, толкается у борта, выгрызает шайбу и великодушно делится ею с партнёрами. Как рыба в воде чувствует себя в вязкой и контактной игре. Без сомнений, добавит «Рубину» мощи при игре в равных составах, надёжно и самоотверженно действует в обороне. Ещё один органичный союз: тюменцы получают высокого уровня мастера, а хоккеист — возможность завоевать трофеи.

7. Дмитрий Алтарёв: из «Югры» — в «Рубин»

Ещё одно серьёзное приобретение «Рубина». За плечами Дмитрия полторы сотни матчей в КХЛ и более 400 — в высшей лиге. Мисхат Фахрутдинов получил в своё распоряжение игрока, в минувшем сезоне игравшего в первом звене клуба КХЛ. Всё изменилось для Дмитрия 7 января в Новосибирске, когда Артур Кулда нанёс ему травму. Алтарёв вынужден был пропустить больше

Дмитрий Алтарёв будет играть в Тюмени

месяца. Хантымансийцы остановились в шаге от зоны плей-офф, а Кубок надежды не удался ни ему, ни «Югре».

Можно с уверенностью говорить о том, что 32-летний воспитанник сурской хоккейной школы обладает достаточным опытом, харизмой, мастерством и лидерскими качествами, чтобы стать заметной фигурой и в составе «Рубина». В свете не утихающих разговоров о том, что тюменская дружина планирует в итоге заявиться в КХЛ, каждое приобретение рассматривается как перспектива. Дмитрий имеет положительный опыт старт-апа в КХЛ в составе «Югры». Думается, он будет полезен и в Тюмени.

6. Антон Зимин: из «Спутника» — в «Торос»

Для дружины Руслана Сулейманова становится доброй традицией пополнять в межсезонье свои ряды экс-хоккеистами «Рубина». Антон принимал участие в финальных баталиях сезонов- 2010/11 и 2011/12 и хорошо запомнился нефтекамским болельщикам. По стилю игры, да и внешними данными он здорово напоминает капитана и символ «Тороса» — Анатолия Степанова. Жизнерадостный, весёлый и заводной в жизни и на площадке, Зимин определённо принесёт пользу новому коллективу. Учитывая, как Сулейманов умеет выводить игроков на пик физической и игровой формы, можно не сомневаться, что у очередного призыва башкирской молодёжи во вторую команду республики, рядом будет достойный мастер, у которого есть чему поучиться.

5. Денис Франскевич: из «Сарыарки» — в «Рубин»

Из второй команды минувшего сезона продолжается отток хоккеистов. Разрывавший год назад на части трансферный рынок, нынешним летом карагандинский клуб пока является поставщиком игроков для конкурентов. Появление в Тюмени Франскевича можно назвать неожиданной закономерностью. Потеря Александра Судницина заставила спортивный отдел клуба заняться поисками опытного голкипера, который мог бы с ходу закрыть эту позицию. Воспитанник карагандинского хоккея уже защищал цвета главной команды Тюменской области в сезоне-2003/04. С тех пор, конечно, прошло немало времени, а Денис успел поиграть и в «Автомобилисте», и в «Барысе». «Рубин» получил в своё распоряжение вратаря высокого уровня, психологически устойчивого и имеющего богатый опыт выступления на высшем уровне. В весеннем финале он был брошен в бой при крайне неблагоприятных обстоятельствах и помог команде зацепиться и превратить серию в настоящий триллер.

4. Виктор Луговской: из ТХК — в «Казцинк-Торпедо»

Про такие трансферы принято говорить — «бомба». Второй ассистент и третий бомбардир лиги по итогам минувшего сезона Виктор Луговской априори должен был стать объектом пристального внимания массы клубов. Но заполучили его в свои ряды в Усть-Каменогорске. Луговской мог оказаться в «Казцинке-Торпедо» ещё год назад, но перемены в клубе тому воспрепятствовали. Пожалуй, Виктору жаловаться не на что — в Твери он получил титул абсолютно лучшего. Именно так оценили его выступления болельщики. Можно предположить, на каком эмоциональном подъёме он переходит в новую команду. Сезон в ТХК

Денис Франскевич — вратарь «Рубина»

стал абсолютно лучшим (ирония судьбы) в его карьере. Насколько 27-летний форвард сможет поддерживать этот уровень, покажет сезон. Но в том, что казахстанскому клубу удалось заполучить отличного форварда, сомнений нет.

3. Роман Смирнов: из «Ермака» — в «Буран»

«Вот бы сохранить всех парней, которые раскрылись в нашем клубе за последние три года! Горы бы свернули!» — так или примерно так могут рассуждать поклонники «Ермака», глядя на ежегодный исход лидеров. Это, конечно, подход болельщицкий и идёт вразрез в первую очередь с возможностями клуба, но понять их можно, особенно когда команду покидает их любимчик. Роман провёл в ангарском клубе три сезона и буквально покорил всех фанатов. Покорил игрой и человеческими качествами. Статистика не всегда бывает объективной, но когда защитник в 171 матче набирает 71 (32+39) очко, это говорит о многом.

В лице 26-летнего лучшего защитника-бомбардира лиги воронежский «Буран» получил достойное подкрепление своим амбициям, которые руководство не скрывало уже с первого сезона в

ВХЛ. Такие парни, как Роман, нужны команде и на льду, и в раздевалке. Лидерские качества, мастерство и умение расположить к себе болельщиков делает Смирнова прекрасным приобретением для команды, рассчитывающей на большие результаты. Такие парни становятся системообразующими, и за Виктора Семыкина в этом плане остаётся только порадоваться.

2. Сергей Елизаров: из «Челмета» — в «Ладу»

В Тольятти всерьёз взялись за укрепление атакующей линии. Ещё один лидер бомбардирской гонки по итогам регулярного сезона теперь будет играть на берегах Волги. Воспитанник новосибирского хоккея, Сергей Елизаров провёл лучший сезон в карьере, набрав в 52 матчах «регулярки» 45 (21+24) очков. Послужной список Сергея весьма внушительный. Он поиграл в разное время в «Амуре», «Сибири», «Зауралье». В его карьере числится семь клубов. Хочется пожелать клубу и игроку долгого и плодотворного сотрудничества. А трансфер мы, учитывая успехи Сергея в минувшем сезоне, поместили на вторую строчку.

1. Илья Малюшкин: из «Сарыарки» — в «Кубань»

Очередная и, пожалуй, вторая по значимости потеря серебряного призёра минувшего сезона. Но если Семён Кокуёв отправился покорять КХЛ, то другой лидер карагандинского клуба усилит «Кубань». То, что такой мастер, как Илья, придётся краснодарской дружине ко двору, сомнений уже не вызывает. В тюменском «Газовике» тройка Журун, Коробов и Малюшкин наводила страх и ужас на соперников. После того как Илья покинул сибирский клуб, Александр с Максимом продолжали тянуть лидерскую лямку ещё один сезон. Воссоединение форвардов в составе «грифонов» может стать настоящей сенсацией предстоящего сезона. По крайней мере, все предпосылки к этому у воссозданной тройки есть. И можно не сомневаться, что за «Кубанью» будет любопытно наблюдать не только растущей армии её поклонников.

Илья Малюшкин отправился в Краснодар

Трансферы ВХЛ, Спорт, ЗОЖ

С появлением кабельного телевидения и интернета все больше людей следят за футбольными и хоккейными матчами, биатлоном, волейбольными и баскетбольными играми, катанием на льду и другими спортивными событиями.

Многие представители сильной половины человечества (и не только) болеют исключительно за одну свою любимую команду. Часто это передается по наследству, то есть отец передал преданность команде своему сыну, а тот, скорее всего, приобщит своего сына. В доме есть атрибутика: шарфы, шапки, растяжки флаги с логотипом. Эти люди знают кричалки своей команды, следят за жизнью игроков, тренера.

Трансферы ВХЛ

В хоккее, как и в футболе, игроки часто меняют команды. После каждого сезона кто-то уходит, а кто-то приходит. Чтобы быть в курсе обновленного состава своей любимой команды, смотрите Переходы игроков ВХЛ на сайте https://ihockey.bet/.

Трансферы показывают из какой команды в какую переходит тот или иной игрок.

Часто бывает так, что молодой хоккеист не очень сильно показывал себя в команде. Но при переходе в другой клуб становится ведущим нападающим. Сложно сказать почему происходит эта трансформация. Возможно, дело в атмосфере в команде или подходе тренера. Не маловажную роль играет и межличностные отношения игроков. Ведь даже мельчайшие детали могут сыграть роль в конечном счете решающего матча.

Хоккей в России

Хоккей в России считается национальным видом спорта после легендарного матча команды СССР с Канадой в 1981 году, где наши спортсмены сумели забить 8 шайб против одной канадской. С того времени и до сих пор многие мальчишки мечтают стать великими хоккеистами и прославить свою страну на международной арене.

«Красная машина» — так называли советскую и продолжают называть российскую сборную по хоккею. Многие считают это прозвище обидным, некоторые, наоборот, утверждают, что наши спортсмены действительно как машины. Но и по сей все без исключения жители Российской Федерации болеют за наших хоккеистов в эти ответственные матчи: кто-то дома перед телевизором, кто-то в спорт-барах, многие непосредственно на ледовой площадке.

Портал https://ihockey.bet/

Портал https://ihockey.bet/ собрал в себя все новости хоккейной жизни. Здесь можно найти:

• Прогнозы
• Таблицы
• Афиши игр
• Трансферы
• Статистику
• Мнения экспертов

Как российских команд, так и международных матчей.

Если вы относите себя к болельщикам, то смело подписывайтесь на рассылку, добавляйте этот сайт в закладки, чтобы быть в курсе последних событий. Ведь в хоккее, как и в жизни, постоянно что-то происходит.

Сохранили ветерана, потеряли вратаря, вернули старожила. Анализ трансферов фарм-клуба «Салавата» — Новости — Уфа

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Республиканские любители хоккея внимательно следят за изменениями в составе «Салавата Юлаева». При этом фарм-клуб уфимской команды остаётся «в тени». Между тем «Торос» активно ведёт трансферную политику, о чём своевременно сообщает пресс-служба нефтекамцев.

 

Фото: championat.com

Из потерь, прежде всего, стоит выделить уход в «Сарыарку» главного тренера «ледяных глыб» Руслана Сулейманова. Именно под его руководством «Торос» в 2012-м и в 2013-м годах выигрывал Кубок Братины. В минувшем сезоне нефтекамцы стали вторыми в своей конференции, но проиграли в первом же раунде плей-офф «Хумо».

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Вслед за наставником в Караганду отправился и «первый номер» команды Владимир Сохатский. Вратарь в минувшем сезоне сыграл за фарм «Салавата» 49 матчей, одержав 24 победы. Процент отражённых бросков – 93,1; коэффициент надёжности – 2,07.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Также покидает «Торос» защитник Дамир Галин. За один сезон в Башкирии он сыграл 35 матчей, забив 2 гола и сделав 4 передачи. Показатель полезности – «+7», штраф – 16 минут.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Не будет в Нефтекамске и двух воспитанников «Салавата Юлаева». Во-первых, не продлён контракт с нападающим Сергеем Емелиным, который в минувшем сезоне за 42 игры забросил лишь 2 шайбы и 8 раз ассистировал партнёрам при показателе полезности «+3» и 8 минутах штрафа.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Во-вторых, будет искать себе новую команду форвард Андрей Анкудинов. В 53 играх сезона 2019/2020 годов он стал автором 6 заброшенных шайб и 5 результативных передач. Показатель полезности – «+1», штраф – 63 минуты.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Зато два выпускника юлаевской СДЮШОР продлили соглашения с «Торосом». Продолжит играть за башкирскую команду защитник Ильдар Абдеев, который в дебютном для себя сезоне в ВХЛ за 51 игру 7 раз огорчал вратарей соперников и 3 раза помогал сделать это партнёрам. При этом показатель полезности составил – «0», штрафное время – 14 минут.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

В отличие от Абдеева, Егор Дубровский уже давно выступает за нефтекамцев. В минувшем сезоне нападающий в 57 матчах забил 15 голов и 15 раз ассистировал партнёрам. Показатель полезности – «-6», штраф – 40 минут.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Возможно, продолжит играть за фарм-клуб юлаевцев и нападающий Иван Козлов, с которым заключён пробный контракт. Форвард перешёл в «Торос» по ходу сезона и за 18 игр забросил 3 шайбы при 4 голевых передачах. Показатель полезности – «+1», штраф – 4 минуты.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Также на просмотровом соглашении и новичок «ледяных глыб» — защитник Семён Богачонок. Хоккеист уже выступал за «Торос», когда в чемпионате 2016/2017 годов он сыграл за нефтекамцев 7 матчей. Минувший сезон он провёл в чемпионате Казахстана, где в 64 играх за «Алтай-Торпедо» он забил 5 голов и сделал 13 результативных передач. Показатель полезности – «+28», штраф – 54 минуты.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

Уход Сохатского призван компенсировать опытный вратарь Александр Скрынник. Голкипер имеет опыт игры в КХЛ в составе хоккейного клуба «Куньлунь Ред Стар». А минувший сезон стаж ворот провёл в тольяттинской «Ладе», в составе которой в 42 матчах одержал 22 победы при проценте отражённых бросков равном 92,1 и коэффициенте надёжности – 2,25.

 

Фото: пресс-служба ХК «Торос»

И, наконец, условным новичком «Тороса» можно назвать нападающего Виталия Каменева, который выступал за нефтекамскую команду с 2010-го по 2016-й год, выиграв с ней три Кубка Братины. Сезон 2019/2020 годов форвард провёл в альметьевском «Нефтянике». В 55 матчах он 9 раз забивал сам и 21 раз ассистировал партнёрам. Показатель полезности – «+26», штраф – 32 минуты.

 

Резюмируя, можно сказать, что представитель Башкирии в ВХЛ остался, что называется, «при своих». Наверняка мы увидим в составе «ледяных глыб» выпустившуюся молодёжь из «Толпара». С высокой долей вероятности будут появляться в Нефтекамске и молодые звёзды юлаевцев Шакир Мухамадуллин, Родион Амиров, Павел Елизаров, Александр Пашин и Данил Алалыкин. И, скорее всего, игровую практику в фарме «Салавата» будет получать выменянный у «Трактора» вратарь Владислав Сухачёв. Таким образом трёхкратный обладатель Кубка Братины сможет как бороться за самые высокие места, так и готовить смену для главной команды республики.

трансферов Салавата пока не впечатляют. Лидеры занимают игроки и ветераны ВХЛ

.

В Уфе не могут найти сильных новичков.

В этом межсезонье «Салават» покинул основную
звезду Линус Умарк и ряд ключевых игроков
, защитников Захар Арзамасцев,
Артем Сергеев, Михаил Пашнин и нападающий
Александр Бурмистров .

Замена их — сильное испытание для
гендиректора уфимцев Александра
Курносова и спортивного директора
Василия Чижова .Умарка Юху
Метсолу, Филип Ларсен
на
Уфа вывела прежнее лидерство,
Курносов с Чижовым произвели всего
замен. Теперь они, по сути, к
должны обновить команду наполовину.

Учитывая не самый богатый рынок свободных агентов, жесткий потолок зарплат и финансовые проблемы, справиться с такой задачей крайне сложно. Как подтверждают последние новички «Салавата», это либо хоккеисты-неудачники, либо сыгравшие свою роль ветераны.Если клуб не вернет Михаила Воробьева из НХЛ или не закроет оставшуюся вакансию легионера эффектным подписанием, отбор, несомненно, можно назвать разочарованием.

34 ГОДА УРОВНЯ

Евгений Бирюков всю свою карьеру проработал в Магнитогорском Металлурге и считался хорошим защитником. Он трижды играл на чемпионатах мира за сборную России, а в 2012 году стал чемпионом мира.Но возраст дает о себе знать: в прошлом сезоне 34-летний защитник сел физически и сыграл лишь три матча плей-офф из пяти. На пути к сбережениям Вице-президент нового клуба Сергей Ласков решил расстаться с игроком. Бирюкову предложили роль помощника тренера, но он отказался.

Евгений Бирюков / фото: официальный сайт «Металлурга»

Сейчас Бирюков — главное укрепление «Салавата», что лучше всего говорит о трансферной политике клуба.При этом у уфимцев еще есть возможность качественно укрепиться, но под потолок зарплат не так много денег. Всего четыре легионера «съедают» чуть больше трети от разрешенной суммы (900 миллионов рублей).

ЗАПОВЕДНИК «АМУРА»

Первое приобретение
Салават стал белорусским защитником
Коробов Дмитрий . Все по позиции
логично: из
защиты вышли три ключевых игрока, и их нужно кем-то заменить.
Коробов когда-то считался перспективным. Защитник
, играл в системе Тампа-Бэй
и даже провел три матча в НХЛ
в сезоне 2013/14.

Но в сезоне 2018/19 Беларусь играла за «Торпедо
», так что в начале января клуб принял решение о его прекращении
, хотя никто еще не объявил
это было невозможно. В прошлом сезоне у «Купидона»
все сложилось еще хуже —
Коробов не сыграл и половины матчей (29
из 62), причем несколько раз претендовали
нападающих.

Дмитрий Коробов перешел в «Салават Юлаев»! #HCSalavat подписал контракт с белорусским защитником Дмитрием Коробовым. Срок соглашения с опытным защитником — 2 сезона
https://t.co/32kZUP8Nyl pic.twitter.com/QOjmlPBXwc
— ХК Салават Юлаев (@hcsalavat) 2 мая 2020 г.

В целом
защитник (190 см, 107 кг) заметно проехал на
скорости и проиграл борьбу за
место в составе «Амура». «Салават Юлаев» —
клуб, ставящий задачи выше, на
хабаровчан.А как тогда Коробов
может усилить уфимцев?

ТРЕТИЙ ГОЛИСТ «ТРАКТОРА» В ОБМЕН УЧИТЕЛЯ

Кроме
совсем молодых игроков, в прошлом сезоне за «Салават» играл только один собственный воспитанник Станислав
Гареев . В прошлом сезоне он провел 19 матчей и смог подняться, так как по уровню не сильно уступал защитникам, которых клуб подписал в межсезонье. Но только в следующем сезоне его не будет в составе: Гареев решил обменять в «Тракторе»
на вратаря Владислава
Сухачева .

Станислав Гареев / фото: Светлана Садыкова, BUSINESS Online

Сухачев считался самым талантливым голкипером России
1998 года. Но с переходом во взрослый хоккей
Владислав начал преследовать
травм, а к 22 годам он сыграл в КХЛ всего
матчей. В Салавате
он может рассчитывать на большее: Сухачева
берут в качестве подстраховки для Мецолы, то есть 15 матчей
он получит. Но насколько
это поспособствует его прогрессу?

Последние
трех сезонов вторым голкипером «Салавата»
был Андрей
Кареев ,
который сейчас не хочет продлевать
контракт с клубом.«Салават
» хотел обменять вратаря, но не принял ни одного предложения об обмене
. По информации
Горобзора,
Кареев может продолжить карьеру в Европе, если уфимский клуб
не обменяет ее. Понятно,
, что под Метсолом трудно надеяться на
место основного голкипера, а Кареев
просто устал сидеть на скамейке запасных. Но
Салават остался без надежного бекапа.

ИГРОК ИЗ ФАРМ КЛУБА ЦСКА

Игорь Мясищев
—
лучший защитник фарм-клуба ЦСКА Звезда.Но за
в КХЛ он сыграл всего 12 матчей, а последний матч он провел более двух лет назад. По сути, к
«Салават» ничем не рискует, давая шанс
Мясищеву. Недорогой хоккеист
вряд ли сыграет в первых двух парах
защиты и постепенно адаптируется к
КХЛ.

Вот только ему Уфа уступила
прав Сергееву, который в прошлом сезоне был ключевым защитником
. Он уезжает во Флориду, а если вернется в Россию, выберет ЦСКА.

КТО СТАНЕТ НАЧИНАМ «Салавата»?

В клубе
есть одна вакансия легионера, но
пока не ясно, кто ее займет. «Чемпионат»
сообщил об интересе уфимцев к Йоонасу
Кемппайнену , уехавшим на год назад
СКА из Салавата. По нашей информации,
вероятность этого мала. Подробнее
реалистичный вариант с подписанием
финского форварда Маркуса Гранлунда ,
в пользу Эдмонтона.Салават
даже сделал ему квалификационный
предложение не терять
прав на игрока. И если Гранлунд примет его,
, то следующий сезон проведет в Уфе.

Йонас Кемппайнен / фото: Светлана Садыкова, BUSINESS Online

Также
Салават предложил трехлетний контракт
воспитаннику клуба Михаилу Воробьеву,
в 2017 году, уехавшему в систему Филадельфии.
За это время провел 35 матчей в НХЛ,
но закрепиться в основном составе
The Flyers не удалось.Решение
отложено из-за того, что
не ясно, когда возобновится сезон в НХЛ. По нашим сведениям
, Воробьев, скорее всего, вернется в Салават.

Наверняка
останется в Салавате и нападающий
Алексей Кручинин , который один
Контракт с клубом закончился. И вот
Вячеслав Солодухин и Владимир
Жарков покинут клуб: «Салават»
рассматривает варианты обмена футболистов,
— чтобы освободить место в потолке
зарплат.

На
при этом не забывайте, что у клуба
большие внутренние резервы. Защитник
Шакир Мухамадуллин нападающие
Родион Амиров, Данил Башкиров и
Даниил Алалыкин входят в число
самых талантливых юниоров России. Одной из
основных претензий к Цулыгину было
недоверие к молодежи, и если Ламса не
даст им много игрового времени, то
будет выглядеть странно.

Ориентировочный
состав «Салавата Юлаева» на сезон
2020/21
Вратари :
Мецола (Сухачев)

Ларсен —
Панин

00070002 Коледов — Бирюковцев

Бирюковцев
Мясищев — Мухамадуллин

Хартикайнен
— Маннинен — ​​Гранлунд (?)

Сошников
— Воробьёв — Кугрышев

Кручинин —
Кадейкин — Амиров

0002 Гимартаев

Гимартов 85

Еще способов дать: VHL Alliance

VHLA посвящена повышению осведомленности, диагностике, лечению и повышению качества жизни отдельных лиц и семей, пострадавших от фон Хиппель-Линдау.

---

Ваша поддержка помогает улучшить жизнь и способствует исследованиям. Помимо электронного пожертвования, вот список других способов, которыми вы можете пожертвовать.

Дань / мемориальное пожертвование
Почтите любимого человека памятным подарком или памятным подарком VHLA, используя любой метод пожертвования по вашему выбору.

Сделайте пожертвование по почте или телефону
Щелкните здесь, чтобы увидеть наш почтовый адрес и номер телефона.

Сбор средств онлайн
Создайте свою собственную страницу сбора средств, используя Facebook или нашу платформу однорангового сбора средств.Любой из них позволяет легко организовать сбор средств и поделиться им с друзьями.

Legacy Giving
Завещание VHLA полностью вычитается для целей налога на наследство. Независимо от того, велико ли ваше наследие или мало, ваше пожертвование — важный и личный способ дать надежду людям с болезнью фон Хиппель-Линдау для будущих поколений. Чтобы включить альянс VHL в свое завещание или доверие, назначить VHLA бенефициаром вашего пенсионного плана, полиса страхования жизни, коммерческого аннуитета или передать VHLA в наследство денежные средства или другое имущество, назначьте встречу со своим юристом. и предоставьте им следующую информацию:

VHL Alliance, Inc.
A 501 (c) (3) некоммерческая корпорация, учрежденная в соответствии с законодательством штата Массачусетс
1208 VFW Parkway, Suite 303, Boston, MA 02132
Идентификационный номер федерального налогоплательщика 04-3180414

Щелкните здесь, чтобы получить дополнительную информацию о том, как стать членом VHLA Legacy Circle. Унаследованные участники включили VHLA в свое завещание или доверие или назначили VHLA бенефициаром своего пенсионного плана, полиса страхования жизни или коммерческого аннуитета.

Подарок акций
Подарок акций может быть более выгодным с точки зрения налогообложения, чем эквивалентный денежный подарок.Предоставляя VHL Alliance ценные бумаги, которые находились в собственности не менее одного года и одного дня, вы можете избежать уплаты федерального налога на прирост капитала в размере до 15% плюс налог штата на прирост капитала, если это применимо. Кроме того, вы получаете вычет из подоходного налога по справедливой рыночной стоимости акций на момент подарка. Пожалуйста, свяжитесь со своим налоговым консультантом, прежде чем инициировать любой перевод, чтобы быть уверенным, что вы полностью понимаете налоговые преимущества подарка акций. Когда вы будете готовы, свяжитесь с Альянсом VHL, чтобы уточнить детали передачи запасов.

Дарение денежных средств или акций в рамках вашего минимального обязательного распределения (RMD) с квалифицированного пенсионного счета (например, IRA). Доноры могут сделать прямой взнос со своего пенсионного счета в размере до 100 000 долларов, чтобы удовлетворить свои требования к минимальному распределению (RMD). Налоговое управление США требует, чтобы доноры старше 72 лет (возраст которых увеличился с 70 ½ в соответствии с Законом о безопасности от 2019 года) снимали минимальные суммы со своих пенсионных счетов. Вместо того, чтобы брать распределение и платить обычные подоходные налоги, доноры могут внести взнос в размере до 100 000 долларов непосредственно в VHL, не считая это налогооблагаемым распределением.Этот прямой взнос с квалифицированного пенсионного счета фактически снизил бы скорректированный валовой доход донора. Имейте в виду, что прямые взносы с квалифицированных пенсионных счетов не могут использоваться в качестве вычета в Таблице А налоговой декларации донора. Другие пожертвования благотворительным организациям, которые не используют квалифицированные пенсионные фонды, по-прежнему могут быть заявлены как вычеты по статьям.

Золото для лечения!
Старые или неиспользованные золотые предметы, которые могут быть у вас дома, могут быть переданы в дар Альянсу VHL и использованы для достижения нашей цели — лечения рака с помощью VHL! Все, что вам нужно сделать, это заполнить эту форму , и мы отправим вам этикетку с оплаченной почтой.Упакуйте свои товары, отправьте их в UPS или FedEx, и вы получите налоговую квитанцию ​​по почте! Простой способ изменить мир к лучшему!

Покупки в Интернете
Зарегистрируйтесь на iGive.com *, чтобы собирать деньги для VHL Alliance каждый раз, когда вы делаете покупки в Интернете! VHLA получает 5 долларов за каждого, кто присоединяется, еще 5 долларов, когда вы делаете свою первую покупку, и часть того, что вы потратите на каждую покупку в будущем (в среднем 3%)! За все платят магазины. Панель инструментов не добавляется, и вы можете использовать свой любимый браузер.Программное обеспечение «кнопка» отслеживает, на какой сайт вы переходите, и указывает сайты, которые участвуют в iGive.com. Сделайте покупку как обычно, и iGive пришлет нам чек!

Зарегистрироваться:

Перейдите на igive.com и нажмите «Присоединиться сегодня».
Введите «VHL» в поле «Найти причину». Выберите «VHL (Family) Alliance».
Введите свои регистрационные данные и нажмите «зарегистрироваться» внизу страницы.
Следуйте инструкциям по установке кнопки iGive.
Вы зарегистрированы! — Делайте покупки и жертвуйте!

Еще один вариант покупок в Интернете — Amazon Smile **.Поддерживайте VHLA каждый раз, когда вы делаете покупки на Amazon, без каких-либо дополнительных затрат с вашей стороны. Когда вы делаете покупки на smile.amazon.com, Amazon жертвует часть стоимости покупки альянсу VHL. Это также работает с членством в Amazon Prime!

* Перейдите по этой ссылке для получения дополнительной информации о iGive.

** Перейдите по этой ссылке, чтобы получить дополнительную информацию о программе Amazon Smile.

Объединенная федеральная кампания
Напишите в VHL Alliance в форме пожертвования United Way или через другие благотворительные кампании на рабочем месте; пожалуйста, сначала свяжитесь с вашим отделом кадров.Федеральные служащие могут делать пожертвования альянсу VHL через кампанию CFC. Наш агентский код — 10934, и мы зарегистрированы как Curing Cancer через VHL . Посетите нашу страницу на сайте racecuremerica.org.

Подарите свой автомобиль (CarEasy.org)

Пожертвуйте свой автомобиль, грузовик, мотоцикл, фургон или лодку альянсу VHL (DBA Curing Cancer через VHL), просто щелкнув здесь и заполнив форму. Организация CarEasy свяжется с вами, чтобы организовать получение вашего пожертвованного автомобиля бесплатно.Вы получите первоначальную квитанцию ​​о пожертвовании автомобиля при получении, а затем АВТОМОБИЛИ будут работать, чтобы превратить ваш автомобиль в наличные для поддержки VHLA.

Очки отеля / мили авиакомпаний
Баллы лояльности, полученные от вашей авиакомпании, отеля или кредитной карты, могут оказаться очень полезными в борьбе с ВХЛ. Свяжитесь с вашим банком, авиакомпанией или сетью отелей для получения информации о том, как легко перевести свои баллы в альянс VHL.

Belzutifan одобрен для лечения опухолей, связанных с VHL

21 сентября 2021 г. , от NCI Staff

У людей с заболеванием VHL белковые комплексы HIF накапливаются и способствуют росту опухоли.Связываясь с HIF-2α (зеленая часть белкового комплекса HIF), белзутифан (фиолетовый шестиугольник) ингибирует опухолевую активность HIF.

Кредит: Ричард Бруик, Кевин Гарднер, Юго-западный медицинский центр штата Юта

Люди с редким наследственным заболеванием фон Хиппеля-Линдау (VHL) имеют повышенный риск развития раковых и доброкачественных опухолей во многих органах, включая почки, поджелудочную железу, мозг и позвоночник.Врачи обычно проводят операцию по удалению этих опухолей и предотвращению распространения рака, но с каждой последующей операцией риск осложнений увеличивается.

Новый препарат, недавно одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), может помочь людям с ВХЛ избежать или отсрочить операцию, уменьшив размер опухоли.

13 августа FDA одобрило использование белзутифана (Велирег) для лечения взрослых с несколькими опухолями, связанными с ВХЛ. В частности, препарат одобрен для лечения VHL-ассоциированной почечно-клеточной карциномы (тип рака почки), гемангиобластом центральной нервной системы (тип доброкачественной опухоли, которая формируется в головном или спинном мозге) и нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы (редкий тип. рака поджелудочной железы), которые не требуют немедленного хирургического вмешательства.

Одобрение основано на результатах небольшого клинического испытания, в ходе которого белзутифан тестировался на людях с почечно-клеточной карциномой, ассоциированной с VHL, у всех из которых также были другие первичные опухоли, связанные с VHL.

Через 18 месяцев почти у половины участников опухоль почки уменьшилась по крайней мере на 30% (частичный ответ), и большинство опухолей этих людей все еще реагировали через 1 год. Белзутифан также уменьшил VHL-ассоциированные опухоли головного мозга, поджелудочной железы и глаза.

«Когда мы впервые начали наблюдать реакцию пациентов, у меня ослабли колени.Я не мог поверить в это », — сказал У. Марстон Линехан, доктор медицины, руководитель отделения урологической онкологии Центра исследований рака NCI, который был частью команды, проводившей исследование фазы 2. «У этого препарата есть реальный потенциал, чтобы произвести революцию в лечении таких пациентов».

«Это первый раз, когда у нас есть одобренный FDA агент для лечения пациентов с опухолями, связанными с VHL», — сказал главный исследователь исследования Рамапрасад Шринивасан, доктор медицинских наук, также из отделения урологической онкологии.«Теперь мы можем сказать некоторым пациентам:« Мы можем дать вам лекарство, которое поможет вам избежать операции »».

В поисках пути к лечению

Заболевание

VHL вызывается мутациями в гене VHL .

В начале 1990-х доктор Лайнехан и его коллеги из NCI идентифицировали ген VHL и обнаружили, что мутации в этом гене также связаны со спорадическим (или ненаследственным) светлоклеточным раком почки.

«Нам потребовалось почти 10 лет, чтобы найти этот ген», — сказал он.«Наша цель состояла в том, чтобы идентифицировать этот ген, изучить путь и разработать [таргетные] методы лечения».

Их открытие привело к ряду дополнительных открытий, которые привели к разработке и одобрению belzutifan. Первые открытия были сделаны в конце 1990-х — начале 2000-х годов, когда Уильям Кэлин, доктор медицины из Гарвардской медицинской школы, и Питер Рэтклифф, доктор медицины, из Оксфордского университета, обнаружили, что белок VHL принимает непосредственное участие в контроле уровней группы известных белков. как HIF. Они показали, что когда VHL отсутствует или не работает должным образом, белки HIF могут накапливаться и вызывать рост опухолей.

Последующие исследования показали, что один конкретный тип белка HIF, HIF-2α, играет решающую роль в развитии опухолей почек. HIF-2α — фактор транскрипции, белок, контролирующий экспрессию других генов.

В конце концов, исследователи из Юго-Западного Техасского университета обнаружили, что возможно получить лекарство, связывающееся с HIF-2α, а позже разработали соединение, которое могло бы эффективно блокировать его опухолевую активность. Это соединение стало бельзутифаном.

«В течение многих лет люди говорили:« Мы не можем найти лекарства от факторов транскрипции, они просто не будут работать », — сказал д-р.Шринивасан. «Они были неправы людьми, которые разработали этот препарат. Это очень умный образец лекарственной инженерии ».

Исследование показывает уменьшение опухоли

В ходе клинического исследования белзутифана 61 пациенту с ВХЛ, у которого была по крайней мере одна опухоль почки, давали белзутифан в таблетках один раз в день. Исследование финансировалось компанией Merck, производящей белзутифан.

Через 18 месяцев 49% участников ответили частично. «Масштабы уменьшения опухоли были очень, очень четкими и выраженными», — сказал д-р.Шринивасан. «И если вы посмотрите, опухоли со временем уменьшаются».

Кроме того, большинство пациентов, опухоли которых дали частичный ответ, все еще отвечали на лечение через год. Доктор Сринивасан отметил, что даже среди пациентов, у которых не было частичного ответа, у большинства наблюдалось некоторое уменьшение размера опухоли.

Белзутифан также уменьшает опухоли поджелудочной железы, головного мозга / позвоночника и глаз.

«Мы показали, что при VHL-ассоциированном раке почки HIF-2α очень важен.Мы надеялись, что это будет также важно при опухолях головного мозга, поджелудочной железы и глаз », — сказал доктор Линехан. «Но пока мы не провели клиническое испытание, мы ничего не знали. Так что мы были просто счастливы увидеть там эти отзывы ».

Доктор Сринивасан указал, что частичный ответ — это хороший ответ. «Был бы я доволен полным ответом, и не возникли бы новые опухоли? Совершенно верно, — сказал он. Но полное искоренение опухолей не требуется, «чтобы существенно повлиять на клинические исходы пациента», — продолжил он.Пациенты могут избежать операции в течение многих лет, «если мы можем взять опухоль и вместо трех сантиметров уменьшить ее до полутора сантиметров и удерживать там».

Побочные эффекты белзутифана были легкими и включали утомляемость, головные боли, головокружение и тошноту. Наиболее частым побочным эффектом, который испытывали 90% пациентов, была анемия.

«Анемия является наиболее частым побочным эффектом, потому что ингибиторы HIF-2α блокируют путь, необходимый для образования клеток крови», — пояснил д-р.Шринивасан.

Тем не менее, «это относительно легкий препарат [для переносимого пациентами], и его также должно быть легко комбинировать с другими лекарствами», — сказал д-р Линехан.

Следующие главы для Belzutifan

Доктор Сринивасан отметил, что, поскольку болезнь ВХЛ встречается редко, у исследователей нет непосредственных планов проведения более крупного клинического исследования, которое потребовало бы участия сотен людей с опухолями, связанными с ВХЛ. Кроме того, у исследователей нет другого эффективного препарата, с которым можно было бы сравнить белзутифан в исследовании фазы 3.

Но это не значит, что история белзутифана окончена. На самом деле, это только начало, — сказал доктор Шринивасан.

«Нам нужно больше узнать об этом препарате», — сказал он. «Нам нужно посмотреть, как долго мы можем лечить людей белзутифаном и как лучше всего его вводить». Следует ли пациентам получать его постоянно? Следует ли им принимать белзутифан в течение некоторого времени, а затем прекратить, а затем начать снова? Пациентам, опухоли которых не проходят. Не ответили, могут ли врачи сочетать белзутифан с другим препаратом? Или, возможно, пациентам нужна более высокая доза препарата.«Это те вопросы, на которые наука поможет нам ответить», — сказал д-р Шринивасан.

Испытания фазы 3 проводятся для оценки эффективности белзутифана в лечении пациентов со светлоклеточным раком почки, не связанным с ВХЛ, который распространился или метастазировал за пределы почек.

Доктор Линехан выразил надежду, что однажды это лекарство будет одобрено FDA для лечения других опухолей, связанных с VHL, таких как опухоли глаза. «У нас еще много работы, но мы в восторге от возможностей, которые у нас есть в будущем», — сказал д-р.Линехан. «Нет никаких сомнений в том, что этот препарат резко изменит необходимость хирургического вмешательства у этих пациентов и сделает их жизнь намного лучше».

Стартовые комплекты тройного комплекса NanoBRET ™ VHL и CRBN

ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ДАННОГО ПРОДУКТА ИССЛЕДОВАТЕЛЬ СОГЛАШАЕТСЯ С УСЛОВИЯМИ ДАННОЙ ЛИЦЕНЗИИ НА ЭТИКЕТКУ ОГРАНИЧЕННОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ. Если исследователь не желает принимать условия этой лицензии, и продукт не используется, Promega примет возврат неиспользованного продукта и предоставит исследователю полный возврат средств.

Исследователь может использовать этот продукт только в исследовательских целях; коммерческое использование запрещено. Коммерческое использование означает любое без исключения использование этого продукта стороной в обмен на вознаграждение, включая, помимо прочего, (1) использование в дальнейшем производстве продукта; (2) использование при предоставлении услуг, информации или данных; и (3) перепродажа продукта, независимо от того, перепродан ли такой продукт для использования в исследованиях. Исследователь не имеет права изменять или иным образом создавать вариации продукта. Никакое другое использование или передача этого продукта не разрешается без предварительного письменного согласия Promega.

Для использования реагентов марки Nano-Glo®, предназначенных для передачи энергии (например, резонансной передачи энергии биолюминесценции) акцепторам, отличным от генетически кодируемого аутофлуоресцентного белка, исследователи должны:
(i) использовать акцепторы энергии марки NanoBRET ™ ( например, лиганды HaloTag®, оптимизированные для BRET) для всех определений активности передачи энергии этим продуктом; или
(ii) связаться с Promega для получения лицензии на использование продукта для анализа передачи энергии в приемники энергии, не производимые Promega.

В отношении любого использования, выходящего за рамки данной лицензии, включая диагностическое, терапевтическое, профилактическое или коммерческое использование, пожалуйста, свяжитесь с Promega для получения информации о поставках и лицензировании. PROMEGA НЕ ПРЕДОСТАВЛЯЕТ НИКАКИХ ЗАЯВЛЕНИЙ ИЛИ ГАРАНТИЙ ЛЮБОГО РОДА, ЯВНЫХ ИЛИ ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ, ВКЛЮЧАЯ В ОТНОШЕНИИ КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИЛИ ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ КОНКРЕТНОЙ ЦЕЛИ ОТНОСИТЕЛЬНО ПРОДУКТА. Условия данной лицензии на лейбл регулируются законодательством штата Висконсин, США.

ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ДАННОГО ПРОДУКТА ИССЛЕДОВАТЕЛЬ СОГЛАШАЕТСЯ С УСЛОВИЯМИ ДАННОЙ ЛИЦЕНЗИИ НА ЭТИКЕТКУ ОГРАНИЧЕННОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ.Если исследователь не желает принимать условия этого заявления об ограниченном использовании и продукт не используется, Promega примет возврат неиспользованного продукта и предоставит исследователю полный возврат средств.

Исследователи могут использовать этот продукт только в исследовательских целях; передача или коммерческое использование этого продукта не допускается. Коммерческое использование означает любое без исключения использование этого продукта или его производных стороной в обмен на вознаграждение, включая, помимо прочего, (1) использование в дальнейшем производстве продукта; (2) использование при предоставлении услуг, информации или данных; и (3) перепродажа продукта или его производных, независимо от того, перепродаются ли такой продукт или производные для использования в исследованиях.Исследователи не имеют права изменять или иным образом создавать вариации нуклеотидной последовательности гена люциферазы, за исключением того, что исследователь может (1) создавать последовательности слитых генов при условии, что кодирующая последовательность полученного гена люциферазы содержит не более четырех дезоксинуклеотидов, отсутствующих на пораженном участке. конец по сравнению с последовательностью интактного гена люциферазы; и (2) вставка и удаление последовательностей нуклеиновых кислот в исследованиях сплайсинга, основанных на инактивации или восстановлении люминесценции кодируемой люциферазы.Никакое другое использование этого продукта или его производных запрещено без предварительного письменного согласия Promega.

Кроме того, исследователи должны:
(1a) использовать люминесцентные реактивы (LAR) марки Nano-Glo® для всех определений люминесцентной активности этого продукта и его производных; или
(1b) связаться с Promega для получения лицензии на использование продукта и его производных с LAR, которые не производятся Promega.

Для использования LAR марки Nano-Glo®, предназначенных для передачи энергии (например, резонансной передачи энергии биолюминесценции) акцепторам, отличным от генетически кодируемого аутофлуоресцентного белка, исследователи должны:
(2a) использовать акцепторы энергии марки NanoBRET ™ ( е.g., BRET-оптимизированные лиганды HaloTag®) для всех определений активности передачи энергии этим продуктом и его производными; или
(2b) связаться с Promega для получения лицензии на использование продукта и его производных для анализа передачи энергии к акцепторам энергии, не производимым Promega.

Исследователи могут передавать производные продукты другим лицам для использования в исследованиях при условии, что во время передачи получателям будет предоставлена ​​копия этой лицензии на этикетку и получатели соглашаются соблюдать условия этой лицензии на этикетку.В отношении любого использования, выходящего за рамки данной лицензии, включая диагностическое, терапевтическое, профилактическое или коммерческое использование, пожалуйста, свяжитесь с Promega для получения информации о поставках и лицензировании. PROMEGA НЕ ПРЕДОСТАВЛЯЕТ НИКАКИХ ЗАЯВЛЕНИЙ ИЛИ ГАРАНТИЙ ЛЮБОГО РОДА, ЯВНЫХ ИЛИ ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ, ВКЛЮЧАЯ В ОТНОШЕНИИ КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИЛИ ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ КОНКРЕТНОЙ ЦЕЛИ ОТНОСИТЕЛЬНО ПРОДУКТА. Условия этого соглашения регулируются законодательством штата Висконсин, США.

ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ДАННОГО ПРОДУКТА ИССЛЕДОВАТЕЛЬ СОГЛАШАЕТСЯ СОБЛЮДАТЬ УСЛОВИЯ НАСТОЯЩЕГО ЗАЯВЛЕНИЯ ОБ ОГРАНИЧЕННОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ.Если исследователь не желает принимать условия этого заявления об ограниченном использовании, и продукт не используется, Promega примет возврат неиспользованного продукта и предоставит исследователю полный возврат средств. Исследователи могут использовать этот продукт только в исследовательских целях, коммерческое использование запрещено. Исследователи не имеют права изменять или иным образом создавать вариации нуклеотидной последовательности гена HaloTag®. Однако исследователи могут клонировать гетерологичные последовательности ДНК на одном или обоих концах указанного гена HaloTag®, чтобы создать последовательности слитых генов при условии, что кодирующая последовательность полученного гена HaloTag® имеет не более четырех (4) дезоксинуклеотидов, отсутствующих на пораженном конце, когда по сравнению с интактной последовательностью гена HaloTag®.Кроме того, исследователи должны выполнить одно из следующих действий в связи с использованием продукта: (1) использовать лиганды Promega HaloTag®, которые могут быть модифицированы или связаны с Promega или частями, предоставляемыми заказчиком, или (2) связаться с Promega для получения лицензию, если нельзя использовать лиганды Promega HaloTag®. Исследователи могут передавать производные продукты другим лицам для использования в исследовательских целях при условии, что во время передачи копия этой лицензии на этикетку будет предоставлена ​​получателям и получатели соглашаются соблюдать условия этой лицензии на этикетку.В отношении любого использования, выходящего за рамки данной лицензии, включая любые диагностические, терапевтические или профилактические применения, пожалуйста, свяжитесь с Promega для получения информации о поставках и лицензировании. PROMEGA НЕ ДАЕТ НИКАКИХ ЗАЯВЛЕНИЙ ИЛИ ГАРАНТИЙ ЛЮБОГО РОДА, ЯВНЫХ ИЛИ ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ, ВКЛЮЧАЯ В ОТНОШЕНИИ КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИЛИ ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ КОНКРЕТНОЙ ЦЕЛИ ОТНОСИТЕЛЬНО ПРОДУКТА. Условия этого соглашения регулируются законодательством штата Висконсин, США.

Патент США. №№ 8,557,970, 8,669,103, 9,777,311, 9,840,730, 9,951,373 и 10,633,690, а также другие заявленные патенты и патенты.

Патент США. № 8,809,529, Европейский патент. № 2635582 и другие патенты и патенты на рассмотрении.

Патент США. №№ 7,425,436, 7,935,803, 8,466,269, 8,742,086, 8,420,367, 8,748,148, 9,416,353, 9,593,316 и другие заявленные патенты и патенты.

Патент США. №№ 10 067 149 и 10 024 862, а также другие патенты и патенты на рассмотрении.

По лицензии Kazusa Genome Technologies.

JCI — Активность индуцируемого гипоксией фактора способствует противоопухолевой эффекторной функции и резидентности CD8 + Т-клеток в тканях

Абстрактные

Адоптивная Т-клеточная терапия (АКТ) имеет большие перспективы в лечении рака, но низкие общие показатели ответа у пациентов с солидными опухолями подчеркивают остающиеся проблемы в реализации потенциала этого подхода клеточной иммунотерапии.Содействие адаптации CD8 + Т-клеток к участию в тканях представляет собой малоиспользуемую, но многообещающую стратегию улучшения функции лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL). Здесь мы сообщаем, что делеция HIF-негативного регулятора фон Хиппель-Линдау (VHL) в CD8 + Т-клетках индуцировала HIF-1α / HIF-2α-зависимую дифференцировку резидентных в ткани TIL-подобных (Trm-подобных) TIL в мышиных моделях злокачественность. VHL-дефицитные TIL накапливались в опухолях и демонстрировали базовую сигнатуру Trm, несмотря на фенотип, связанный с истощением, что приводило к сохранению полифункциональности и ответу на иммунотерапию αPD-1, что приводило к эрадикации опухоли и резидентной защитной памяти.Дефицит VHL аналогичным образом способствовал усиленному накоплению Т-клеток химерного антигенного рецептора (CAR) с Trm-подобным фенотипом в опухолях. Таким образом, активность HIF в CD8 + TIL способствует накоплению и противоопухолевой активности, обеспечивая новую стратегию повышения эффективности ACT.

Авторы

Илкка Лийканен, Колетт Лаухан, Сара Куон, Кайла Омилусик, Энтони Т. Фан, Лаура Барсело Бартроли, Амир Ферри, Джон Гулдинг, Джойс Чен, Джеймс П. Скотт-Браун, Джейсон Т. Юштейн, Николь Э.Шарпинг, Дебора А. Уизерден, Ананда В. Голдрат

×

Рисунок 1

HIF-зависимое накопление TIL и контроль роста опухоли с помощью VHL-дефицитных CD8 ⁺ Т-клеток.

(A – B) Рост опухоли и выживаемость (A) B16.gp33- или (B) MC38.gp33-несущих мышей C57BL / 6J после переноса Vhl ^{fl / fl} dLck-Cre ^— (WT) или Vhl ^{fl / fl} dLck-Cre ⁺ (VHL-KO) P14 клеток, n = 7 в A и 9 в B (экспериментальный) и 5 ​​в A и 6 в B (контроль).(C) Изображения (в центре) и количественная оценка (справа) метастатических опухолей легких у поликлональных мышей WT и VHL-KO после внутривенного введения. провокация клетками B16.gp33. (D) Иммунофлуоресцентная микроскопия CD8α (красный) и DAPI (синий) в репрезентативных опухолевых очагах от C при 20-кратном увеличении; области опухоли, указанные пунктирными линиями (слева), и количественное определение TIL CD8 ⁺ на единицу площади опухоли (AU; справа). Данные объединены из 2 независимых экспериментов с 6 × 10 ⁵ клеток B16.gp33, инъецированных 11 мышам WT и 10 мышам VHL-KO.Соответствующие результаты были получены в 2 дополнительных экспериментах с 4,5 × 10 ⁵ опухолевых клеток, n = 9 мышей на группу. (E) Количество донорских клеток P14 из опухоли (TIL) и селезенки от мышей, несущих опухоли B16.gp33 (слева) и MC38.gp33 (справа), в конечной точке экспериментов по эффективности (A и B), n = 9 для WT и 10 для ВХЛ-КО для B16.gp33, n = 3 на группу для MC38.gp33. (F) Частота выделения донорских клеток P14 из опухолей KMR.gp33 или селезенки через 7 дней после совместного переноса клеток WT и VHL-KO, n = 4.(G) Рост опухоли и выживаемость мышей, несущих опухоль B16.gp33, после переноса WT, VHL-KO или Vhl ^{fl / fl} -Hif1a ^{fl / fl} -Epas1 ^{fl / fl} dLck-Cre ⁺ (VHL-HIF-1α-HIF-2α-KO) клеток P14, n = 5 на группу. Данные представляют 3 независимых эксперимента, за исключением случаев, указанных в D. Столбцы и ошибка представляют собой среднее значение ± SEM. NS, не значимо, * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001 Двусторонний t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни (рост опухоли) и с поправкой Бонферрони Логранговый тест (выживаемость), (*) не смог достичь порога с поправкой на Бонферрони, хотя показал P <0.05.

Профиль экспрессии гена

в клеточной линии почечной карциномы: рассечение VHL и гипоксозависимых путей

Введение

Большинство солидных опухолей размером более нескольких кубических миллиметров подверглись ангиогенному переключению, что является решающим этапом для роста опухоли и метастазирования. Таким образом, блокирование ангиогенеза может быть эффективной стратегией остановки роста опухоли (1). Этот переключатель регулируется сигналами как генетических мутаций, так и факторов окружающей среды (2), причем одним из наиболее мощных сигналов окружающей среды является гипоксия (низкое давление кислорода).Хотя образование новых кровеносных сосудов стимулируется гипоксией и ослабляет гипоксическую среду, гипоксия продолжает поражать некоторые области крупных солидных опухолей. Адаптация к гипоксии имеет фундаментальное значение в онтогенетических, физиологических и патофизиологических процессах (3, 4). Эта адаптация к гипоксии частично зависит от соответствующей экспрессии многих физиологически значимых генов, которые регулируются транскрипционно, посттранскрипционно или посттрансляционно. Изменения экспрессии генов в ответ на гипоксию важны для многих фундаментальных биологических процессов, включая апоптоз, адаптацию к стрессу и ангиогенез.Гены, экспрессия которых изменяется в ответ на гипоксию, включают фактор роста эндотелия сосудов ( VEGF ), который является мощным ангиогенным фактором роста, который индуцирует образование новых кровеносных сосудов как в физиологических, так и в патофизиологических процессах, а также гены, участвующие в адаптации энергетический метаболизм в среде с пониженным содержанием кислорода, такой как транспортер глюкозы 1 ( GLUT1 ) и фосфоглицераткиназа 1 ( PGK1 ) (3, 5).Усиленный метаболизм глюкозы и ангиогенез являются отличительными признаками роста опухоли и включают активацию генов, которые обычно индуцируются гипоксией.

Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF), является критическим регулятором транскрипции многих генов, связанных с гипоксией, включая GLUT1 и VEGF (6). HIF представляет собой гетеродимер, состоящий из HIF-α и ARNT, двух основных белков спираль-петля-спираль в семействе PAS (5). Существует по крайней мере две изоформы HIF-α млекопитающих, HIF-1α и HIF-2α, которые преимущественно регулируются стабильностью белка, хотя есть некоторые свидетельства того, что на уровни мРНК HIF также может влиять кислород (7, 8).В условиях нормоксии белки HIF-α быстро разрушаются посредством убиквитин-протеасомного пути (8–11). Напротив, при низком давлении кислорода белки HIF-α стабилизируются (6).

Инактивация гена-супрессора опухоли VHL приводит к развитию болезни фон Хиппеля-Линдау, наследственного онкологического синдрома, который отличается высокоангиогенными опухолями почек, сетчатки и центральной нервной системы (12, 13). Несколько линий доказательств предполагают, что pVHL, продукт гена VHL , является многофункциональным белком.Лучше всего охарактеризованная функция pVHL — это его роль в качестве компонента комплекса ubiquitin E3 ligase, который нацелен на HIF-α для убиквитин-зависимой деградации протеасом (14-17). Недавние исследования продемонстрировали, что VHL-зависимая протеолитическая деградация как HIF-1α, так и HIF-2α происходит посредством ферментативного гидроксилирования специфических пролиловых остатков в домене кислородзависимой деградации HIF-α (ODDD) (18-20).

В гипоксических клетках деградация HIF-α подавляется, что приводит к усилению транскрипции генов-мишеней, включая проангиогенные гены.При почечно-клеточной карциноме (ПКР), частом проявлении болезни VHL, HIF-α продуцируется в опухоли с избытком. Хорошо известная транскрипционная мишень HIF-α, VEGF , сверхэкспрессируется в опухолях ПКР и, вероятно, способствует активации ангиогенного переключателя в этих и других опухолях (21-24). В клеточной линии карциномы почек 786-0 отсутствует функциональный белок VHL, и хотя этот тип клеток не экспрессирует HIF-1α, HIF-2α постоянно экспрессируется в этих клетках на высоких уровнях (25).

Выяснение молекулярных механизмов, включающих сигнальные пути гипоксии, может иметь огромное влияние на диагностику, прогноз и лечение опухолей (26). Действительно, генетическое нарушение сигнального пути гипоксии HIF-α или ингибирование мишеней HIF-α эффективно подавляет рост опухоли (25, 27–29). Исследования молекулярных механизмов, с помощью которых клетки адаптируются к гипоксии, во многом зависят от систем линий in vitro раковых клеток. Неясно, используют ли опухолевые клетки и нормальные клетки одни и те же пути передачи сигналов гипоксии.Возможно, опухоли развивают альтернативные пути передачи сигналов гипоксии, чтобы выжить в неблагоприятной окружающей среде или, возможно, избежать наблюдения с контрольных точек нормального роста. Здесь мы исследовали регулируемую гипоксией экспрессию генов как в нормальных, так и в раковых клетках на уровне транскрипции. Используя серийный анализ экспрессии генов (SAGE) (30), мы обнаружили, что клетки карциномы почек, независимо от статуса VHL , по-разному реагируют на гипоксию, чем нормальные клетки почечных канальцев. Мы идентифицировали множество индуцируемых гипоксией генов, которые могут быть ключевыми регуляторами онкогенеза и ангиогенного переключения.Мы также показываем, что VHL оказывает глубокое транскрипционное воздействие на клетки 786-0 и может играть важную роль в регуляции некоторых генов в альтернативном пути передачи сигналов гипоксии. Наконец, наши данные предполагают, что результаты исследований in vitro следует интерпретировать с осторожностью, потому что разные клеточные линии могли развить уникальные пути ответа на гипоксию.

Результаты и обсуждение

SAGE клеток ПКР 786-0 в различных генетических и экологических условиях

Всего восемь независимых библиотек SAGE было создано из восьми различных нормальных и опухолевых образцов, как показано в таблице 1.Образцы различались по экспрессии гена VHL дикого типа и подверженности гипоксии. Родительская линия ПКР 786-0 дефектна в экспрессии VHL . Эта линия была сконструирована для экспрессии гена VHL дикого типа посредством инфицирования ретровирусным вектором, несущим кДНК VHL . Библиотеки SAGE были получены из сконструированной линии 786-0, выращенной в условиях нормоксии (V1; 786-0 VHL ⁺ Nor.) И из родительской линии, не содержащей VHL , но инфицированной пустым ретровирусным вектором и выращенной в условиях нормоксии. (V2; 786-0 VHL ^— Nor.). Библиотеки SAGE также получали из этих двух клеточных линий, выращенных в условиях гипоксии, соответственно (V3; 786-0 VHL ⁺ Hyp. И V4; 786-0 VHL ^— Hyp.). Для сравнения, образцы были получены из двух независимых первичных культур нормальных клеток проксимальных канальцев почек (RPTEC), поскольку большинство данных свидетельствует о том, что ПКР возникает из этих клеток (31), хотя недавнее исследование предполагает, что причиной ПКР могут быть дистальные канальцы ( 32). Две культуры RPTEC выращивали в нормоксических условиях (V5 и V6; RPTECs VHL ⁺ Nor.) и в условиях гипоксии (V7 и V8; RPTECs VHL ⁺ Hyp.). Всего было секвенировано более 380 000 тегов SAGE и идентифицировано более 61 000 уникальных тегов. Профили экспрессии генов клеток, выращенных в различных условиях, сравнивали для поиска потенциальных регуляторов или мишеней VHL и / или передачи сигналов, опосредованной гипоксией. Для этого анализа использовали нормализованное количество меток SAGE для сравнения данных из двух или более библиотек, и гены считали индуцированными или репрессированными, если их уровни экспрессии изменялись по крайней мере в 4 раза.

Таблица 1 .

SAGE Библиотеки раковых клеток (RCC 786-0) и нормальных клеток

VHL отрицательно регулирует гены в клетках 786-0

Было показано, что VHL отрицательно регулирует многие индуцируемые гипоксией гены посредством пути VHL-HIF. Кроме того, было показано, что VHL регулирует стабильность мРНК некоторых индуцируемых гипоксией генов (22), что повышает вероятность того, что VHL оказывает влияние на экспрессию генов независимо от HIF .Используя стандартные методы молекулярной биологии, такие как Нозерн-блот-анализ, другие исследовали влияние VHL и гипоксии на экспрессию отдельных генов (25). Представленные здесь данные используют беспристрастный подход к геному, чтобы расширить предыдущие исследования. Наш анализ подтвердил, что потеря pVHL и воздействие гипоксии вызывают подмножество одних и тех же генов (рис. 1). Тридцать восемь генов, индуцируемых гипоксией в клетках 786-0 VHL ⁺ , также активируются в 786-0 VHL ^— Nor.ячеек (рис.1 и дополнительные материалы ¹ ). Стоит отметить, что GLUT1 не входит в число 38 перечисленных здесь, потому что он не индуцируется как минимум в 4 раза по сравнению с клетками 786-0 VHL ⁺ , выращенными в условиях нормоксии. Это в значительной степени связано с высокой базальной экспрессией GLUT1 в 786-0 VHL ⁺ Nor. ячеек (см. Таблицу 2в). Тем не менее, экспрессия GLUT1 индуцируется в 2 раза в отсутствие VHL . Более того, как показано ранее (25), наши данные подтверждают, что восстановление экспрессии VHL спасает способность гипоксии индуцировать GLUT1 в клетках карциномы почек (3 раза в VHL ⁺ ; 1.5-кратный в ВХЛ ^—). Интересно, что фактор созревания глии β ( GMFB ), который участвует в дифференцировке клеток мозга и стимуляции регенерации нервов (33), входит в число генов, индуцируемых в отсутствие VHL или в присутствии гипоксии (таблица 2б). Сверхэкспрессия генов, участвующих в росте и дифференцировке нейронов, интригует, поскольку другие проявления болезни VHL включают развитие феохромоцитом и гемангиобластом сетчатки и центральной нервной системы (12, 34).

РИСУНОК 1 .

Гены, которые негативно регулируются VHL в клетках 786-0. Черный кружок на слева обозначает гены, которые активируются в ≥4 раза в 786-0 VHL ^— Nor. ячеек по сравнению с 786-0 VHL ⁺ Nor. клетки; белый кружок справа указывает на гены, которые активируются в ≥4 раза в 786-0 VHL ⁺ Hyp. ячеек по сравнению с 786-0 VHL ⁺ Nor.клетки. серый перекресток двух кружков обозначает гены, которые активируются в обоих сравнениях. Указывается количество индуцированных генов в каждом наборе. Буквы в каждом разделе относятся к репрезентативным генам из каждого набора, которые можно найти в соответствующем разделе таблицы 2 и в дополнительных материалах.

Таблица 2 .

Дифференциально экспрессируемые гены в почечных клетках, выращенных в разных условиях

Важно отметить, что подавляющее большинство (122 из 160 генов; рис.1) генов, индуцированных гипоксией в клетках 786-0 VHL ⁺ , не активируются (по крайней мере, в 4 раза) в клетках 786-0 путем простой мутации VHL . Это демонстрирует, что в опухолевой клетке потеря VHL не эквивалентна гипоксическому воздействию, и предполагает, что опухолевый супрессор VHL может играть важную роль, отличную от его участия в индуцируемом гипоксией пути.

Рис. 1 также показывает, что в опухолевых клетках имеется 154 гена, которые, по-видимому, негативно регулируются VHL .Эти гены активируются в клетках 786-0, в которых отсутствует VHL , по сравнению с генами, экспрессирующими VHL (таблица 2а и дополнительные материалы). Среди этих генов — матриксная металлопротеиназа 1 ( MMP1 ), которая кодирует протеазу, расщепляющую коллагены (35). Ранее было показано, что ММП регулируются VHL (36). Многочисленные исследования продемонстрировали, что эти протеазы играют важную роль в ангиогенезе, морфогенезе и ремоделировании тканей, процессах, которые все связаны со своевременным разрушением внеклеточного матрикса во время туморогенеза (37–39).В эту группу также входят гены, участвующие в росте и дифференцировке клеток, в том числе белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 3 ( IGFBP3 ) (40). Это предполагает, что супрессор опухоли VHL функционирует путем непосредственной регуляции генов, которые контролируют рост и дифференцировку клеток, а также ангиогенез.

Изменения экспрессии генов в клетках 786-0, на которые влияет

VHL

pVHL контролирует экспрессию ключевых регуляторов транскрипции, таких как HIF-α, поэтому ожидается, что дефект в VHL окажет сильное влияние на экспрессию многих генов.На рис. 2 показано, что, как и ожидалось, клетки карциномы почки 786-0 претерпели множество изменений экспрессии генов по сравнению с нормальными клетками почек. Используя профиль экспрессии гена RPTEC в качестве эталона, мы смогли выделить VHL-зависимые и VHL-независимые изменения в линии раковых клеток. Семьсот восемьдесят семь (416 + 371) генов показывают по крайней мере 4-кратную сверхэкспрессию в клетках 786-0, лишенных VHL , по сравнению с RPTEC, а 839 (468 + 371) генов показывают аналогичную дифференциальную экспрессию, когда VHL является вновь введен.Возможно, что некоторые из 416 генов, которые индуцируются в клетках 786-0, лишенных VHL , также были бы индуцированы в RPTEC, если бы в них отсутствовала экспрессия VHL дикого типа. Однако 371 ген сверхэкспрессируется в клетках 786-0 независимо от статуса VHL . В целом, статус VHL в этой линии раковых клеток влияет на экспрессию более 800 генов (416 + 468). Это наблюдение подчеркивает важность VHL как главного регулятора множества генов и путей и предполагает, что роль pVHL как опухолевого супрессора может быть более сложной, чем считалось ранее.

РИСУНОК 2 .

Влияние VHL на экспрессию генов в клетках 786-0. Черный кружок слева обозначает гены, которые активируются в ≥4 раза в 786-0 VHL ^— Nor. клеток по сравнению с RPTEC Nor. клетки; белый круг справа указывает гены, которые активируются в ≥4 раза в 786-0 VHL ⁺ Nor. клетки. Поскольку две независимые библиотеки SAGE были сделаны из RPTEC при каждом условии роста, значения тегов были усреднены перед сравнением. серый перекресток двух кружков обозначает гены, которые активируются в обоих сравнениях. Указывается количество индуцированных генов в каждом наборе. Буквы в каждом разделе относятся к репрезентативным генам из каждого набора, которые можно найти в соответствующем разделе таблицы 2 и в дополнительных материалах.

416 генов, активируемых в клетках 786-0, лишенных VHL , включают гены, которые кодируют факторы роста и их рецепторы, белки, участвующие во взаимодействиях между клеткой и матрицей, и белки, которые контролируют клеточный метаболизм (таблица 2c и дополнительные материалы).Как и ожидалось, многие из генов в этой группе являются индуцируемыми гипоксией генами, в том числе GLUT1 , IGFBP3 и VEGF , все из которых, как известно, регулируются HIF-1α (5) и поэтому, как ожидается, будут наводиться в отсутствие ВХЛ . (Эти гены также активируются в RPTEC, выращенных в условиях гипоксии, по сравнению с RPTEC, выращенными в условиях нормоксии; Таблица 2c.) Примечательно, что хотя в клетках 786-0 отсутствует экспрессия HIF-1α, наблюдается повышенная экспрессия этих HIF. -1α регулируемые гены по сравнению с нормальными клетками.Клетки 786-0 конститутивно экспрессируют HIF-2α, и известно перекрытие генов, которые регулируются белками HIF-α (41). Важно отметить, что у HIF-1α и HIF-2α также подозреваются уникальные мишени, поскольку мыши, дефицитные по любому из генов, не обнаруживают повторяющихся фенотипов (42). Также возможно, что эти индуцируемые гипоксией гены могут в норме репрессироваться посредством VHL-зависимого пути, который не зависит от HIF. В соответствии с этим предыдущее исследование с использованием этой линии клеток показало, что VHL негативно регулирует экспрессию VEGF, в значительной степени влияя на стабильность мРНК VEGF (22).

Гипоксия-сверхэкспрессируемый ген 3 ( HOG3 ) также экспрессировался более высоко в 786-0 VHL ^— Nor. ячеек, чем в RPTEC Nor. ячеек (таблица 2в). HOG3 — это HIF-1-зависимый ген, индуцируемый гипоксией, первоначально идентифицированный в клетках глиобластомы человека (43). HIG2 ( индуцируемый гипоксией ген 2 ), который ранее был идентифицирован как индуцируемый гипоксией ген в культивируемых эпителиальных клетках шейки матки человека и в ксенотрансплантатах шейки матки, лишенных кислорода (44), также был индуцирован в 786-0 ВХЛ ^— Нор.клетки. Как обсуждалось выше, сверхэкспрессия этих генов согласуется с ролью VHL в негативной регуляции HIF-чувствительных генов и предполагает, что HIG2 также может регулироваться HIF-α.

Четыреста шестьдесят восемь генов активируются исключительно в клетках 786-0, которые были сконструированы для повторной экспрессии VHL по отношению к их экспрессии в RPTEC (рис. 2). Интересно, что многие из этих генов ранее играли функциональную роль в ангиогенезе и онкогенезе (таблица 2d и дополнительные материалы).К ним относятся синдекан 2 ( SDC2 ) (45), нейропилин 1 ( NRP1 ) (46), активатор плазминогена рецептор урокиназы ( PLAUR ) (47–49) и связывание интегрина β3. белок ( ITGB3BP ) (50, 51). Роль VHL в негативно регулирующих генах, участвующих в ангиогенезе, широко изучена. Наши данные предполагают, что VHL может также положительно регулировать гены, которые способствуют ангиогенезу, по крайней мере, в контексте раковой клетки.

HIF-α регулируется посредством гидроксилирования пролила белками 1, 2 и 3, содержащими домен PHD (52, 53). Исследования in vitro с использованием рекомбинантных белков PHD предполагают, что PHD могут быть датчиками кислорода (53, 54). Важно отметить, что PHD-1 активируется в раковых клетках, выращенных в условиях нормоксии, по сравнению с RPTEC (Таблица 2d). Вероятно, изменения в экспрессии PHD-1 могут влиять на реакцию раковых клеток на кислородные изменения.

Наш анализ также выявил 371 ген, который конститутивно сверхэкспрессируется в клетках 786-0 по отношению к RPTEC, независимо от экспрессии VHL (рис.2e и дополнительные материалы). Этот набор предположительно отражает генетические различия между линией злокачественных и нормальных клеток. Некоторые из генов представляют собой потенциальные биомаркеры или опухолеспецифические антигены ПКР, поскольку их сверхэкспрессия не зависит от генетического статуса VHL . Действительно, циклин B1 (CCNB1), белок, который регулирует рост и пролиферацию клеток, индуцируется SAGE примерно в 7-10 раз в клетках 786-0. CCNB1 недавно был идентифицирован как эпителиальный опухолеспецифический антиген и является кандидатом на вакцинацию против рака (55).

Хотя 371 ген индуцируется по крайней мере в 4 раза как в присутствии, так и в отсутствие VHL , многие из этих генов более высоко экспрессируются в клетках VHL ^– (дополнительные материалы). Это убедительно свидетельствует о том, что VHL играет роль в их регуляции транскрипции. Многие из этих генов участвуют в регуляции пролиферации, дифференцировки и ангиогенеза опухолей.

В целом, более 1000 генов показали индуцированную экспрессию в клетках 786-0 (относительно их экспрессии в RPTECS), с VHL и без него, что позволяет предположить, что раковые клетки претерпели значительные изменения по сравнению с нетрансформированными эпителиальными клетками почек.Предположительно, эти изменения привели к индукции генов, которые способствуют и поддерживают рост опухоли.

Гены, индуцируемые гипоксией в присутствии

VHL

Гипоксия опухоли — центральная проблема физиологии опухолей и лечения рака, поскольку она связана с неблагоприятными исходами. Идентификация генов, специфически индуцируемых в условиях гипоксии, может быть функционально важной для множества критических клеточных путей, включая остановку клеточного цикла и регуляцию ангиогенеза.Таким образом, мы сравнили гены, индуцируемые гипоксией в клетках 786-0 VHL ⁺ , с генами, индуцируемыми гипоксией в RPTEC, чтобы идентифицировать гены, которые уникальным образом регулируются гипоксией в почечной эпителиальной клетке, подвергшейся злокачественной трансформации.

На рис. 3 показаны гены, которые индуцируются по меньшей мере в 4 раза гипоксией в клетках 786-0 VHL ⁺ и в RPTEC. Сто шестьдесят генов активируются гипоксией в клетках 786-0 VHL ⁺ , тогда как 414 генов индуцируются гипоксией в RPTEC (дополнительные материалы).Примечательно, что только 7 генов индуцируются гипоксией как минимум в 4 раза в обоих RPTEC и в клетках 786-0 VHL ⁺ . Подавляющее большинство генов (153 из 160), которые индуцируются гипоксией в клетках 786-0 VHL ⁺ , не индуцируются по крайней мере в 4 раза в RPTEC, выращенных в условиях гипоксии. Как обсуждалось выше, VEGF индуцируется более чем в 5 раз в RPTEC, выращенных в условиях гипоксии, но поскольку базальная экспрессия VEGF повышена в клетках 786-0 VHL ⁺ , индукция гипоксии в этих клетках не столь значительна.Наблюдение за тем, что более 95% индуцируемых гипоксией генов различаются между злокачественными клетками и нормальными почечными клетками, предполагает установление альтернативного чувствительного к гипоксии пути (путей) в этих опухолевых клетках. Ген , индуцированный TGFβ, ( TGFBI ; таблица 2f) входит в число 153 индуцируемых гипоксией генов в клетках 786-0 VHL ⁺ , но не в RPTEC. TGFBI также индуцировался в клетках 786-0 независимо от статуса VHL (таблица 2e), хотя теги SAGE, идентифицированные в этих различных условиях, были разными.Оба тега расположены в 3 ‘UTR гена и, следовательно, соответствуют одному и тому же белку, хотя альтернативные мРНК могут регулироваться по-разному. Ранее сообщалось, что уровень TGFBI повышен при аденомах и колоректальном раке (56, 57). Известно, что TGFBI связывается с коллагенами и, как полагают, играет важную роль во взаимодействиях клетки с коллагеном (58). Следовательно, сверхэкспрессия этого гена может быть критическим компонентом ремоделирования тканей, сопровождающего онкогенез.

РИСУНОК 3 .

Альтернативный путь ответа на гипоксию в клетках 786-0, экспрессирующих VHL . Черный кружок слева обозначает гены, которые активируются в ≥4 раза в 786-0 VHL ⁺ Hyp. ячеек по сравнению с 786-0 VHL ⁺ Nor. клетки; белый кружок справа указывает на гены, которые активируются в ≥4 раза в RPTEC Hyp. клеток по сравнению с RPTEC Nor. клетки. Значения тегов SAGE для двух независимых библиотек RPTEC, выращенных при каждом условии, были усреднены перед сравнением. серый перекресток двух кружков обозначает гены, которые активируются в обоих сравнениях. Указывается количество индуцированных генов в каждом наборе. Буквы в каждом разделе относятся к репрезентативным генам из каждого набора, которые можно найти в соответствующем разделе таблицы 2 и в дополнительных материалах.

Недавно набор сверхэкспрессированных гипоксией генов ( HOGs ) был идентифицирован в клетках глиобластомы человека с использованием SAGE (43), и было обнаружено, что шесть из HOG контролируются HIF-1α (43).Интересно, что ни один из шести HOGs не был индуцирован в наших клетках 786-0 VHL ⁺ , выращенных в условиях гипоксии. Как обсуждалось выше, в клетках 786-0 отсутствует экспрессия HIF-1α, поэтому невозможность увидеть здесь индукцию HOG можно объяснить исключительной регуляцией HIF-1α HOGs . Альтернативно, экспрессия HOG может быть специфичной для клеточного типа, хотя индукция HOG3 в отсутствие VHL (фиг. 2c и таблица 2c) противоречит этой возможности по крайней мере для этого HOG .Представляет интерес определить, индуцируются ли 153 гена, индуцируемые гипоксией в клетках 786-0 только при экспрессии VHL , также и при других типах опухолей.

Семь генов, индуцируемых гипоксией как в RPTEC, так и в клетках 786-0 VHL ⁺ , могут регулироваться белками HIF-α. Поскольку HIF-2α конститутивно экспрессируется в клетках 786-0 VHL ^—, независимо от давления кислорода, мы ожидаем увидеть более высокую экспрессию этих семи генов в 786-0 VHL ^— Nor.клетки по отношению к RPTEC, выращенным в условиях нормоксии. Интересно, что это верно только для двух из семи генов, PAI-1 и нового гена (не соответствует тегу SAGE в общедоступных базах данных). Это предполагает, что другие пять генов контролируются белками, отличными от HIF, и снова разделяют пути индукции гена VHL и HIF-α .

Четыреста четырнадцать генов были индуцированы по крайней мере в 4 раза в RPTEC, выращенных в условиях гипоксии (рис.3). Как и ожидалось, в эту группу входят гены, ранее идентифицированные как гены гипоксии, такие как GLUT1 , IGFBP3 и VEGF (таблица 2c, c ^a и дополнительные материалы) (5). HIF-1α мРНК также была обнаружена на индуцированных уровнях в обработанных гипоксией RPTEC (данные не показаны), что подтверждает, что HIF-1α может регулироваться на уровне транскрипции (7, 8). В дополнение к генам, которые, как известно, индуцируются гипоксией, многие из обнаруженных генов недостаточно хорошо охарактеризованы и / или ранее не было известно, что они регулируются гипоксией.Примеры включают индуцированный ретиноевой кислотой ген 3 ( RAI3 ), который кодирует предполагаемый рецептор, связанный с G-белком (59), и лизилоксидазоподобный ген 2 ( LOXL2 ), который кодирует внеклеточный белок, который может быть задействован. в адгезии и старении клеток (60–62).

VHL -Независимая экспрессия гена в клетках 786-0 в условиях гипоксии

VHL — известный регулятор пути гипоксии через HIF. Дефект в VHL приведет к конститутивной активации пути HIF-α и приведет к усилению регуляции индуцируемых гипоксией генов даже в нормоксических условиях.Интересно, что еще 91 ген индуцируется гипоксией в клетках 786-0 VHL ^– (рис. 4 и дополнительные материалы). На рис. 4 показано, что 87 генов индуцируются гипоксией в клетках 786-0 только при дефекте VHL , тогда как 156 генов индуцируются только гипоксией в присутствии VHL (дополнительные материалы). Это предполагает, что эти опухолевые клетки обладают как VHL -зависимыми, так и VHL -независимыми механизмами ответа на гипоксический стресс.Среди 87 генов, индуцируемых гипоксией в клетках 786-0 VHL ^—, есть гены, которые, как известно, участвуют в межклеточных взаимодействиях и ремоделировании сосудов (таблица 2h и дополнительные материалы), в том числе интегрин αE ( ITGAE ) (63) и эндотелин 2 ( EDN2 ) (64, 65). Интересно, что EDN2 ранее был идентифицирован как индуцируемый гипоксией ген в опухолевых клетках подглотки (66). Как и ожидалось, этот список также включает гены, участвующие в стрессовой реакции ( стресс-ассоциированный белок эндоплазматического ретикулума 1 ; SERP1 ) (67), клеточный метаболизм ( фосфоглюкомутаза 1 ; PGM1 ) (68) и клеточный контроль роста ( цикл деления клеток 25B ; CDC25B ) (69).Кроме того, многие из генов кодируют белки с неизвестной функцией, которые могут оказаться важными регуляторами метаболических путей, чувствительных к гипоксии, при дальнейшей характеристике.

РИСУНОК 4 .

Гены, чувствительные к гипоксии, в клетках 786-0, лишенные VHL . Черный кружок на слева обозначает гены, которые активируются в ≥4 раза в 786-0 VHL ^— Hyp. ячеек по сравнению с 786-0 VHL ^— Nor. клетки; белый кружок справа указывает на гены, которые активируются в ≥4 раза в 786-0 VHL ⁺ Hyp.по сравнению с 786-0 VHL ⁺ Nor. клетки. серый перекресток двух кружков обозначает гены, которые активируются в обоих сравнениях. Указывается количество индуцированных генов в каждом наборе. Буквы в каждом разделе относятся к репрезентативным генам из каждого набора, которые можно найти в соответствующем разделе таблицы 2 и в дополнительных материалах.

Интересно, что четыре гена индуцируются гипоксией в клетках 786-0 независимо от экспрессии VHL (Таблица 2i).Эти четыре гена не входят в число 414 генов, индуцируемых гипоксией в нормальных клетках почек (RPTEC). Специфичность индукции в клетках рака почки, независимо от статуса VHL , предполагает, что эти четыре гена могут быть полезными биомаркерами ПКР и / или эффективными терапевтическими мишенями. HAX-1 , один из этих четырех генов, кодирует белок, о котором известно, что он взаимодействует с различными белками, включая белок поликистозной болезни почек (PKD2) (70). Было высказано предположение, что HAX-1 соединяет PKD2 с актиновым цитоскелетом.Наше наблюдение, что экспрессия HAX-1 увеличивается в среде гипоксической опухоли, предполагает, что этот белок может вносить вклад в изменения контакта клетки с матрицей, связанные с прогрессированием опухоли. Функциональная характеристика генов, соответствующих остальным трем тегам в этой группе, может быть полезной для понимания молекулярных изменений, связанных с гипоксией опухоли.

Количественная ПЦР в реальном времени генов, дифференциально экспрессируемых в клетках 786-0

Для подтверждения результатов экспрессии, наблюдаемых с помощью SAGE, была использована количественная ПЦР в реальном времени для исследования экспрессии трех генов, которые дифференциально экспрессировались в раковых клетках.Экспрессию генов анализировали в наборе независимо выращенных клеток 786-0, которые были стабильно трансфицированы плазмидой, экспрессирующей VHL (WT8) или пустой вектор (pRC3) (71), и сравнивали с экспрессией в нормальных RPTEC, выращенных в условиях нормоксии. . На рис. 5 показано, что общие паттерны экспрессии для двух технологий были подобны. Соотношения уровней экспрессии генов, обнаруженные с помощью обратной транскрипции (RT) -PCR в реальном времени, были в пределах от 2,5 до 3 раз по сравнению с уровнями, обнаруженными с помощью SAGE, для всех клеток, кроме GLUT1 , в клетках VHL ^—.В частности, CCNBI был высоко экспрессирован как в образцах WT8, так и в pRC3. TGFβI индуцировался как в WT8, так и в pRC3, хотя он наиболее высоко экспрессировался в клетках pRC3 с дефицитом VHL , что согласуется с данными SAGE, которые показали резкую сверхэкспрессию в клетках 786-0, лишенных VHL . GLUT1 показал устойчивую экспрессию в отсутствие VHL с помощью обеих технологий, хотя экспрессия была в 5 раз выше в образце pRC3 VHL ^— ОТ-ПЦР, чем в образце 786-0 VHL ^— SAGE образец.Это может быть связано с чувствительностью метода или, возможно, с методом нормализации (см. «Материалы и методы»). Также возможно, что pRC3 экспрессирует больше GLUT1 , чем линия, используемая для анализа SAGE.

РИСУНОК 5 .

Количественная экспрессия ОТ-ПЦР в реальном времени подтверждает экспрессию SAGE. Количественная ОТ-ПЦР была проведена для трех генов, индуцированных SAGE. РНК из независимо созданного набора 786-0- VHL ⁺ клеток ( WT8 ) и 786-0 VHL ^— клеток ( pRC3 ) была использована для подтверждения индуцированной экспрессии CCNB1 , TGFβI и GLUT1 в клетках ПКР по сравнению с RPTEC.

Таким образом, анализ профиля экспрессии генов линии 786-0 ПКР и нормальных клеток почек, выращенных в различных условиях окружающей среды, показал, что в клетках 786-0 произошли генетические изменения, которые влияют на рост и дифференцировку клеток, а также измененные клетки. ответ на гипоксию. Недавно микроматрицы GEM были использованы для изучения VHL-зависимой экспрессии генов в другой линии ПКР, выращенной как в условиях нормоксии, так и в условиях гипоксии (72). Эти исследования были ограничены 9182 генами, отмеченными на матрице GEM, и профили экспрессии нормальных клеток почечных канальцев не учитывались.Тем не менее, полученные данные согласуются с нашими результатами о том, что не все гены-мишени VHL регулируются кислородом.

Представленные здесь данные о VHL и кислородзависимой регуляции генов в нормальных и злокачественных клетках почек подтверждают и расширяют результаты других исследований с использованием анализа экспрессии с низкой пропускной способностью. Наши данные свидетельствуют об альтернативных путях ответа на гипоксию, которые либо VHL -зависимые, либо -независимые. Гены, участвующие в таких путях, имеют потенциальное значение для физиологической и патологической регуляции роста опухоли, метаболизма и ангиогенеза.Поскольку почечно-клеточные опухоли сильно васкуляризированы, считается, что опухолевые клетки могут индуцировать ангиогенные факторы, такие как VEGF и TGF-β, что ясно подтверждают наши данные. Некоторые из генов, идентифицированных здесь как демонстрирующие сверхэкспрессию в раковых клетках, особенно те, которые кодируют секретируемые или связанные с мембраной белки, могут быть потенциальными биомаркерами опухолей или мишенями для рациональной терапии. Более того, наш анализ выявил гены, которые индуцируются гипоксией, в частности, в раковых клетках, которые утратили экспрессию VHL , таких как SERP1 и HAX1 , которые могут оказаться ценными мишенями, специфичными для мутантных опухолевых клеток.Мы и другие ранее показали, что SAGE — это технология с высокой воспроизводимостью, которая является репрезентативной для подобных образцов с использованием других технологий количественной экспрессии (43, 56, 73–75). Таким образом, исследование экспрессии генов в множественных опухолях и клеточных системах, сопровождаемое функциональной характеристикой некоторых из описанных здесь генов, может привести к важным терапевтическим мишеням, которые могут быть специфичными для VHL . То есть некоторые опухоли почек и другие опухоли, утратившие экспрессию VHL , могут быть устойчивыми к определенным методам лечения.Понимание молекулярных изменений, которые сопровождают потерю VHL , может привести к новым эффективным лекарствам.

Материалы и методы

Клетки и культура клеток

Линия спорадических клеток ПКР человека 786-0 содержит единственный аллель VHL с мутацией сдвига рамки считывания в кодоне 104, приводящей к отсутствию белка VHL (76). Кроме того, клетки 786-0 лишены экспрессии HIF-1α, но конститутивно экспрессируют HIF-2α (25). Клетки 786-0 инфицировали либо пустым вектором (pBABE-Puro-HA) (77), либо вектором, несущим ген VHL дикого типа (pBABE-Puro-HA-VHL).Этот вектор был сконструирован путем вставки кДНК VHL , несущейся во фрагмент Bam HI- Eco R1 из pRc / CMV-HA-VHL (71). Клеточные линии поддерживали в среде DMEM (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Эта пара клеток (786-0 VHL ⁺ и 786-0 VHL ^—) была выращена как в нормоксических условиях (5% CO ₂ /21% O ₂ ) (образцы V1 и V2). соответственно) и гипоксический ( у.е.е. , 5% CO ₂ /1% O ₂ /94% N ₂ ) (образцы V3 и V4 соответственно) в условиях в течение 48 часов, как описано ранее (22). Первичные культуры RPTEC человека (Clonetics, Сан-Диего, Калифорния) поддерживали в определенной поставщиком среде для роста эпителиальных клеток почек, которая включает 10 нг / мл hEGF, 5 нг / мл инсулина, 0,5 нг / мл гидрокортизона, 0,5% фетальной бычьей сыворотки, 0,5 нг / мл адреналина, 0,675 нг / мл трийодтиронина, 10 нг / мл трансферрина, 50 мкг / мл гентамицина и 50 нг / мл амфотерицина B.Два независимых образца нормальных клеток проксимальных канальцев почек (RPTEC) выращивали как в условиях нормоксии (образцы V5 и V6), так и в условиях гипоксии (образцы V7 и V8) в течение 48 часов для получения профилей экспрессии генов из неопухолевых клеток. Для анализа RT-PCR в реальном времени РНК экстрагировали из независимого набора клеток 786-0, которые экспрессируют или не экспрессируют VHL. Клетки pRC3 дефектны для VHL , тогда как клетки WT8 стабильно трансфицированы копией VHL дикого типа, как описано (71).

Библиотеки SAGE и анализ SAGE

Образцы

тотальной РНК выделяли либо с помощью РНКзола B (Tel-Test Inc., Friendswood, TX) или TRIzol (Invitrogen Life Technologies) в соответствии с рекомендациями производителя. Поли (A) ⁺ РНК экстрагировали с использованием набора Oligotex mRNA Mini (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния) и набора Dynabeads mRNA DIRECT (Dynal, Осло, Норвегия). Были созданы библиотеки SAGE и секвенированы теги, как описано (30). Программное обеспечение SAGE 3.0 [http://www.sagenet.org/sage_protocol.htm] использовалось для идентификации последовательностей тегов и количественной оценки количества каждого тега. Идентичность гена и присвоение кластера UniGene каждой метки SAGE были получены с использованием «надежной» карты «метка-ген» (обновлена ​​23 апреля 2001 г.) из [http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/pub/SAGE/map] и таблица кластеров UniGene (обновлена ​​25 сентября 2001 г.), из [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/] (UniGene Build №140; последнее обновление 25.09.01). Всего было секвенировано более 380 000 тегов SAGE и идентифицировано более 61 000 уникальных тегов. Для сравнения уровней экспрессии тегов SAGE, присутствующих в отдельных библиотеках, секвенированных на разную глубину, значения тегов были нормализованы, чтобы представить изобилие на 10 000 секвенированных тегов. Гены считались индуцированными или репрессированными, если их уровни экспрессии изменялись по крайней мере в 4 раза с использованием нормализованных данных при сравнении распространенности меток SAGE в двух или более библиотеках.Для выполнения расчетов, когда знаменатель равен нулю, знаменатель принимается равным 1.

Количественная ПЦР в реальном времени

RT-PCR в реальном времени выполняли с использованием набора High-Capacity cDNA Archive Kit, TAQman Universal PCR Master Mix и набора реагентов TAQman Ribosomal RNA Control (Applied Biosystems, Foster City, CA) с наборами праймер-зондов, предназначенными для амплификации CCNBI , TGFβI и GLUT1 . Праймеры для ПЦР были получены от Integrated DNA Technologies (Coralville, IA).Зонды для ПЦР в реальном времени были получены от Synthegen, LLC (Хьюстон, Техас). Зонды были помечены на 5′-конце 6-карбоксифлуоресцеином (FAM) и на 3′-конце тетраметилродамином (TAMRA). Праймеры CCNBI были 5′-GGCCTCTACCTTTGCACTTCC-3 ‘и 5′-GGCCAAAGTATGTTGCTCGAC-3′ с зондом 5’-TCAACCTCTCCAATCTTAGATGCTCTCCGA-3 ‘. Праймеры TGFβI были 5′-TTGAGACCCTTCGGGCTG-3 ‘и 5′-TGGCCGTTACCTTCAAGCAT-3′ с зондом 5’-TGTGGCTGCATCAGGGCTCAACAC-3 ‘. Праймеры GLUT1 были 5′-GATCCTGGGCCGCTTCAT-3 ‘и 5′-ACATGGGCACGAAGCCTG-3′ с зондом 5’-TCGGTGTGTACTGCGGCCTGACC-3 ‘.Экспрессию генов количественно оценивали с использованием сравнительного метода C _T , описанного в User Bulletin # 2 (Applied Biosystems, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System) с 18S рРНК в качестве ссылки. Реакции проводились на ABI Prism 7700 в соответствии с рекомендациями производителя.

Дефектный васкулогенез плаценты вызывает эмбриональную летальность у VHL-дефицитных мышей

Abstract

Наследование инактивированной формы гена-супрессора опухоли VHL предрасполагает пациентов к развитию болезни фон Хиппеля – Линдау, а соматическая инактивация VHL является ранним генетическим событием, ведущим к развитию спорадической почечно-клеточной карциномы.Ген VHL был разрушен целевой гомологичной рекомбинацией в мышиных эмбриональных стволовых клетках, и была получена линия мыши, содержащая инактивированный аллель VHL . В то время как гетерозиготные мыши VHL (+/-) выглядели фенотипически нормальными, мыши VHL — / — умерли внутриутробно, , на сроке от 10,5 до 12,5 дней беременности (от E10.5 до E12.5). Гомозиготные эмбрионы VHL — / -, по-видимому, нормально развивались до E9.5 — E10.5, когда развилась плацентарная дисгенезия.Эмбриональный васкулогенез плаценты не произошел у мышей VHL — / -, и в плаценте развились геморрагические поражения. Последующее кровотечение у эмбрионов VHL — / — вызвало некроз и смерть. Эти результаты показывают, что экспрессия VHL критична для нормального развития внеэмбриональных сосудов.

Мутации зародышевой линии в гене-супрессоре опухоли VHL предрасполагают пациентов с болезнью фон Хиппеля-Линдау к развитию опухолей на нескольких участках, включая ангиомы сетчатки, гемангиобластомы центральной нервной системы, феохромоцитомы, почечно-клеточные карциномы и рак поджелудочной железы (обзор в ссылки1 и 2). Кроме того, соматическая инактивация VHL посредством делеции одного аллеля, связанного либо с мутацией, либо с гиперметилированием оставшегося аллеля, была обнаружена примерно в 80% исследованных спорадических светлоклеточных карцином почек (2), что поддерживает функцию супрессора опухоли для VHL .

Установленная аминокислотная последовательность белка VHL не указывает на функцию белка. Исследования, разработанные для определения функции VHL посредством идентификации физически ассоциированных белков, показали, что VHL стабильно связывает субъединицы B и C комплекса элонгина (3–5).Элонгин, фактор элонгации транскрипции РНК-полимеразы II, содержит каталитическую субъединицу A, которая стабилизируется и активируется регуляторными субъединицами B и C. Кроме того, гетеротримерный комплекс VHL-элонгин B / C (VBC) стабильно взаимодействует с гомологом CUL-2 человека, членом консервативного семейства генов, участвующих в клеточном цикле и контроле роста у низших эукариот (6). Клеточные функции комплексов VBC и / или VBC-CUL-2 еще предстоит выяснить.

Чтобы проанализировать роль VHL в росте и дифференцировке нормальных клеток, мы использовали нацеленную гомологичную рекомбинацию для создания линии мыши, которая удалена для одного аллеля VHL .Гетерозиготные мыши VHL (+/-) выжили до 15 месяцев без признаков спонтанного заболевания. Однако у мышей с дефицитом VHL (- / -) поражения плаценты развиваются на 9,5-10,5 днях беременности (E9.5 — E10.5) и они умирают внутриутробно между E10.5 и E12.5 из-за отсутствия плаценты. эмбриональный васкулогенез с последующим кровотечением и некрозом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Конструирование мышиного вектора нацеливания на VHL.

Два клона геномной ДНК, соответствующие гену VHL , были выделены из 129 полученной от мыши библиотеки P1 (Genome Systems, Сент-Луис). Физическое картирование показало, что три рестрикционных фрагмента Bam HI размером 5 т.п.н., 6 т.п.н. и 4 т.п.н. содержат экзоны 1, 2 и 3 соответственно. Эти фрагменты были субклонированы в pBluescript II (Stratagene), и частичный анализ последовательности показал, что гены VHL человека и мыши имели консервативную структуру интрона / экзона (см. Также ссылку.7). Плазмиду pPNT, содержащую селективные маркеры тимидинкиназы pgk-neo и pgk-HSV, использовали для конструирования нацеливающего вектора VHL (pPNT-VHL). Фрагмент Kpn I– Not I размером 3 т.п.н., содержащий промотор VHL и первые 24 кодона экзона 1, был клонирован в pPNT (сайт Not I вставки был заполнен ДНК-полимеразой перед клонированием, таким образом уничтожая этот сайт и сохраняя, как уникальный, единственный сайт Not I в pPNT).Кроме того, был также клонирован фрагмент Nco I– Bam HI размером 3 т.п.н., содержащий 3 ‘нетранслируемые последовательности третьего экзона VHL (сайт Nco I составляет семь нуклеотидов 3′ кодона терминации трансляции). в pPNT, так что последовательности экзона 1 и экзона 3 фланкировали ген устойчивости к неомицину, а ген вируса простого герпеса tk находился за пределами областей с гомологией VHL . На целевом аллеле neo будет транскрибироваться с противоположной цепи как VHL .

Целевое нарушение VHL в стволовых (ES) клетках.

Направляющий вектор VHL , pPNT-VHL, линеаризовали с помощью Not I, и 20 мкг ДНК подвергали электропорации (Bio-Rad, 400 вольт, 25 мкФ) в клетки J1 ES. После электропорации 2,5 × 10 ⁵ клеток на чашку высевали в 60-мм чашки для культур ткани ² , содержащие монослой устойчивых к G418 эмбриональных фибробластов. Отбор начинали через 24 часа после посева с использованием 400 мкг / мл G418 (GIBCO / BRL) и 2 мкМ ганцикловира (Syntex, Пало-Альто, Калифорния).Двойной отбор привел к примерно 10-кратному обогащению, и устойчивые колонии были изолированы и размножены через 5-6 дней отбора.

Поколение химерных мышей и мышей VHL +/-.

Два клона ES-клеток, G15 и G35, были введены в бластоцисты эмбрионов C57BL / 6 и введены псевдобеременным приемным матерям для завершения развития. Потомство химеров было идентифицировано на основе вклада цвета шерсти агути и спаривалось с самцами и самками C57BL / 6.Затем потомство агути анализировали на предмет разрушения VHL , как описано ниже.

Генотипирование целевых ES-клеток, мышей VHL и эмбрионов.

Геномную ДНК экстрагировали из культивируемых ES-клеток, биопсий хвоста мыши и желточных мешков эмбриона, как описано ранее (8). Для анализа по Саузерну ДНК расщепляли либо Bam HI, либо Hin dIII, подвергали электрофорезу в 1% агарозных гелях и капиллярно наносили на нейлоновые мембраны. Зонды, фланкирующие целевые последовательности VHL , метили с помощью набора для рандомизации праймеров (Stratagene) и использовали в гибридизации.Аллели дикого типа и мутировавшие аллели идентифицировали по предполагаемым различиям в размерах рестрикционных фрагментов. Восемь из 160 исследованных клонов ES показали гомологичную рекомбинацию pPNT-VHL с 5′- и 3′-фланкирующими зондами. Расщепление ДНК ES-клеток ферментами, которые не разрезались в нацеленном векторе, и Саузерн-блоттинг с помощью neo-зонда показали только один гибридизирующий фрагмент, что указывает на то, что в клонах-мишенях ES-клеток был только один сайт встраивания вектора. В некоторых случаях ДНК биопсии хвоста мыши расщепляли Nco I вместо Hin dIII.Было обнаружено, что локус VHL дикого типа не может быть идентифицирован в этих образцах после переваривания Hin dIII, возможно, из-за потери узнавания в результате метилирования в этом сайте. ПЦР также использовалась для генотипирования ДНК, выделенной из биоптатов хвоста мыши или желточных мешков эмбриона. Пары олигонуклеотидных праймеров включали те, которые специфичны для VHL экзона дикого типа, 5′-CCTGAAAGAGCGGTGCCTTCAGGT-3 ‘(прямой) и 5′-GGCTGAAACTCAGGAACACT-3’ (обратный), и праймеры VHL экзона 1 дикого типа, 5 ‘-CGAGCCCTCTCAGGTCATCT-3′ (прямой) и 5’-CGGTGCCCGGTGGTAAGATC-3 ‘(обратный).Олигонуклеотидный праймер, специфичный для целевого аллеля, происходил из pgk-neo, фланкируя сайт Nco I в VHL экзоне 3 (5′-CTACCCGGTAGAATTGACCT-3 ‘), и его использовали в комбинации с обратным праймером экзона 3, показанным выше. Олигонуклеотидные праймеры, соответствующие внутренним neo-последовательностям, были 5’-ATGATTGAACAAGATGGATTGCACG-3 ‘(прямой) и 5′-CGGCACTTCGCCCAATAGCAGCC-3’ (обратный).

Микродиссекция аномальных эмбрионов и генотипирование.

Ткань аномальных эмбрионов была выделена с помощью лазерной микродиссекции (9).Этот метод позволил получить жизнеспособную ткань из аномальных эмбрионов без загрязнения некротизированными эмбриональными тканями или тканями материнского происхождения. ДНК экстрагировали, как описано (9), и ПЦР-анализ выполняли в трех повторностях с использованием праймеров, описанных выше, в присутствии [ ³² P] α-dCTP. Продукты подвергали электрофорезу на гелях полиакриламид / мочевина и визуализировали с помощью авторадиографии.

Гистологический анализ эмбрионов.

Плаценты и эмбрионы мышей из E8.5 — E16.5 фиксировали в матке в нейтральном забуференном формалине или 4% параформальдегиде. После фиксации эмбрионы были осторожно препарированы для тщательного изучения эмбриона и плаценты, залиты парафином и сделаны срезы по 5 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимия выполнялась после фиксации параформальдегидом, этанолом или формалином с использованием антител, направленных против VHL или VEGF (Santa Cruz Biotechnology), развития комплекса авидин-биотин и контрастного окрашивания гематоксилином.

In situ Гибридизация.

Параформальдегид или фиксированные формалином, залитые в парафин срезы плаценты от VHL и контрольных мышей использовали для гибридизации in situ для определения экспрессии мРНК VHL . Вставка Nco I– Bam HI размером 3 т.п.н., соответствующая 3′-нетранслируемой области мРНК VHL (см. Выше), была клонирована в плазмиды pBluescript и pGem 7Z и использована для создания радиоактивно меченных антисмысловых и смысловых зондов РНК. .Зонды РНК разводили до удельной активности 2 × 10 ⁶ дпм / мкл и гидролизовали щелочью перед гибридизацией. In situ гибридизацию проводили, как описано ранее (10, 11). Вкратце, гистологические срезы депарафинизировали и гидратировали, блокировали уксусным ангидридом и янтарным ангидридом и гибридизовали в течение ночи. После тщательной промывки и расщепления РНКазой на предметные стекла наносили эмульсию Kodak NTB2 и экспонировали в течение 4 дней. Слайды проявляли в разбавленном D-19, фиксировали и просматривали в проходящем и темнопольном освещении.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Поколение мышей VHL.

Геномный локус VHL мыши был молекулярно клонирован и картирован, и был сконструирован вектор нацеливания. Направляющий вектор был сконструирован таким образом, что последовательности между сайтом экзона 1 Not I и сайтом экзона 3 Nco I были заменены геном устойчивости к неомицину (фиг. 1 a ). ES-клетки подвергали электропорации с линеаризованным нацеливающим вектором VHL и подвергали двойной селекции G418 и ганцикловира.Саузерн-блоттинг-анализ показал, что 8 из 160 протестированных клонов с двойной устойчивостью имели направленное разрушение одного локуса VHL (фиг. 1 b ). Хотя промотор VHL , первые 23 кодона кодирующей последовательности из 181 аминокислоты (7) и 3′-нетранслируемая область будут сохраняться в нарушенном локусе, анализ экспрессии с использованием связанной обратной транскрипции и ПЦР не позволил обнаружить VHL. Транскрипт из целевого локуса в ES-клетках (данные не показаны).Саузерн-блоттинг с использованием гена neo в качестве зонда показал, что ES-клетки-мишени содержали только одну вставку вектора нацеливания (данные не показаны). Два клона ES-клеток, G15 и G35, инъецировали в бластоцисты-реципиенты C57BL / 6 и получили в общей сложности девять химерных мышей. Семь химер G35 имели сильный вклад ES-клеток в зависимости от цвета шерсти агути и были скрещены с мышами C57BL / 6. Все семь достигли передачи по зародышевой линии нарушенного аллеля VHL с очень высокой частотой.Две химеры G15 имели плохой вклад ES-клеток и не передавали нарушенный аллель VHL .

Рисунок 1

Направленное разрушение мышиного гена VHL в ES-клетках и мышах. ( a ) Схематическое изображение локуса VHL и вектора нацеливания VHL . Прямоугольники представляют три экзона VHL . Открытые поля в векторе нацеливания представляют выбираемые маркеры pgk-neo и pgk-tk. Закрашенные прямоугольники в нацеливающем векторе представляют собой рестрикционный фрагмент Kpn I– Not I размером 3 т.п.н. с 5′-конца гена VHL и рестрикционный фрагмент Nco I– Bam HI размером 3 т.п.н. с 3′-конца гена.Указаны 5′- и 3′-фланкирующие зонды, используемые в саузерн-блоттинге. (b ) Обнаружение аллелей дикого типа и целевых аллелей в клонах ES 15 и 35 и репрезентативном, нецелевом клоне ES (-) с помощью саузерн-блоттинга. После гомологичной рекомбинации нацеливающего вектора в ES-клетках, расщепления Bam HI и Саузерн-блоттинга с 5′-фланкирующим зондом, обнаруженным в дополнение к фрагменту 5 т.п.н. из локуса дикого типа, фрагменту размером 4 т.п.н. из целевого локуса за счет введения нового сайта Bam HI в вектор нацеливания.Аналогичным образом, расщепление Hin dIII и Саузерн-блоттинг с 3′-фланкирующим зондом выявили фрагмент 8 т.п.н. дикого типа и фрагмент 4 т.п. вектор. ( c ) Саузерн-анализ ДНК биопсии хвоста мыши Bam, HI ( Верхний ) или Hin dIII ( Нижний ) хвоста мышей из репрезентативного помета при скрещивании, показывающий отсутствие гомозиготных мышей VHL .Локус дикого типа размером 8 т.п.н. не удалось идентифицировать при расщеплении Hin dIII ДНК, экстрагированной из биопсий хвоста мыши, возможно, из-за потери узнавания из-за интерференции метилирования.

Генотипирование мышей и эмбрионов VHL.

Гетерозиготное потомство VHL (+/−) оказалось фенотипически нормальным, а самые старые из них выжили после 15 месяцев без признаков значительного спонтанного заболевания. Генотипическая оценка отъемного потомства от VHL гетерозиготных скрещиваний (+/- × +/-) и Саузерн-блот-анализ репрезентативного помета показаны на рис.1 c . В целом, генотипирование гетерозиготных скрещиваний VHL выявило приблизительное соотношение 2: 1 гетерозигот VHL к мышам + / + и отсутствие VHL -дефицитных (- / -) мышей (Таблица 1). Поскольку не было доказательств перинатальной смерти в течение первых 3 недель (в этот момент детеныши были генотипированы), это указывало на то, что гомозигот по VHL умерли внутриутробно . Были проанализированы эмбрионы от гетерозиготных скрещиваний, и общий анализ выявил многочисленные аномальные участки плаценты, содержащие геморрагические поражения и находящиеся в процессе резорбции (рис.2). Из 10 пометов, исследованных между E8.5 и E12.5, 43 эмбриона (78%) оказались фенотипически нормальными, а 12 (22%) — фенотипически ненормальными (Таблица 1). Три аномальных участка плаценты были идентифицированы на поздних сроках беременности как E14.5, и ни одного не было обнаружено на E16.5 или E18.5 (Таблица 1). Генотипирование нормальных живых эмбрионов с помощью ПЦР выявило 28 эмбрионов VHL +/- и 15 эмбрионов VHL + / + в этих пометах, соотношение аналогично тому, которое наблюдается у отъемышей (Таблица 1). Ни один из фенотипически нормальных эмбрионов не был VHL — / — (Таблица 1).Однако генотипирование фенотипически аномальных эмбрионов в процессе резорбции оказалось чрезвычайно трудным из-за наличия некротической ткани и невозможности изолировать желточные мешки без загрязнения материнской крови. Поэтому для анализа дополнительных пометов была использована методика лазерного микродиссекции (9). Серийные срезы нормальных или аномальных эмбрионов визуализировали под микроскопом, а материнские или эмбриональные ткани выделяли из 14 аномальных участков плаценты из шести пометов.Анализ ДНК, полученной с помощью микродиссекции с помощью лазерного захвата, показал, что 12 из 14 протестированных аномальных плаценты и / или эмбрионов содержали целевой локус, но не смогли амплифицировать последовательности экзона 2 VHL дикого типа (рис. 3 и данные не показаны), что указывает на то, что эти Плаценты и эмбрионы имели VHL — / — генотип. Все протестированные материнские образцы показали +/- генотипы (рис. 3 и данные не показаны). Остальные 2 из 14 протестированных аномальных плаценты и эмбрионов также показали +/- генотипы (данные не показаны).В то время как плаценты и эмбрионы VHL +/- могут демонстрировать аномальный фенотип и эмбриональную летальность, спонтанная смерть и резорбция мышиных эмбрионов довольно распространены, и у этих двух эмбрионов могут развиться аномалии, не связанные с нарушением VHL (см. Также ниже) . Кроме того, мы не можем исключить возможность того, что некоторая материнская ткань была получена в процессе микродиссекции с помощью лазерного захвата, тем самым неправильно назначая +/- генотип на основе положительной амплификации последовательностей VHL экзона 2.Однако очевидно, что высокая частота эмбриональной летальности у VHL-дефицитных мышей, вероятно, была связана с гомозиготным нарушением VHL .

Таблица 1

Генотипы и общий анализ потомков от VHL +/- скрещивания

фигура 2

Общий вид эмбрионов E12.5 от скрещивания мышей VHL +/-. ( a ) Типичный помет с тремя аномальными эмбрионами из 12 всего. VHL — / — эмбрионы некротизированы, и один эмбрион показан с геморрагической плацентой.( b ) Микрофотография другого репрезентативного помета E12.5, на котором виден один аномальный эмбрион и один эмбрион нормального вида, прикрепленные к геморрагической плаценте.

Рисунок 3

Генотипирование аномальных эмбрионов после лазерной микродиссекции и ПЦР. Тестируемые ПЦР-праймеры были специфичны для VHL экзона 1 (реагирует только с аллелем дикого типа) или специфичны для целевого локуса (ампликон охватывает границу pgk-neo / экзон 3 целевого локуса).Образцы ДНК были проанализированы в трех экземплярах, и VHL — / — эмбрионов были идентифицированы на основании амплификации с целевыми аллель-специфическими праймерами и неспособности амплифицироваться с праймерами VHL экзона 1. Группа 1, положительные контрольные продукты реакции ПЦР с использованием ДНК-матрицы для биопсии хвоста мыши VHL +/-; группа 2 — продукты отрицательного контроля из реакций ПЦР, не содержащие добавленной ДНК; группа 3, продукты реакции ПЦР с использованием матричной ДНК, выделенной из репрезентативного аномального E10.5 с генотипом VHL — / -; группа 4, продукты реакции ПЦР с использованием матричной ДНК, выделенной из части материнской плаценты от матери VHL +/-; группа 5, продукты реакции ПЦР с использованием матричной ДНК, выделенной из репрезентативного нормального эмбриона E10.5 и демонстрирующие генотип VHL + / +.

Гистологическая оценка эмбрионов и плаценты VHL.

Детально изучена гистология эмбрионов от гетерозиготных скрещиваний VHL .Всего было исследовано 63 участка плаценты из семи пометов от 9,5 до 12,5 дней гестации. Семнадцать из 63 участков плаценты (27%) показали плацентарные и эмбриональные поражения, а 14 были оценены с помощью генотипирования ПЦР (см. Выше). И плацента, и эмбрион развивались нормально примерно до E9.5. В этом гестационном возрасте (сразу после слияния хориоаллантоидов) начинает развиваться плацентарный лабиринт (12). Общей чертой VHL — / — эмбрионов было отсутствие эмбрионального эндотелия и эмбриональных кровеносных сосудов в плацентарном лабиринте.Эмбриональные сосуды с ядросодержащими эритроцитами были идентифицированы на краю лабиринта, но не было обнаружено сосудов, вторгающихся в лабиринт (рис. 4 b ). Трофобласты казались нормальными и жизнеспособными примерно до E9.5, но не развивались до развития синцитиотрофобластов. Следовательно, VHL — / — эмбрионы обнаруживают дефектный васкулогенез внутри плацентарного лабиринта, но не на других участках.

Рисунок 4

Гистопатология нормальных и VHL — / — эмбрионов.( a ) Окрашивание гематоксилином и эозином нормального плацентарного лабиринта E10.5, показывающее трофобласты и ядросодержащие эритроциты в эмбриональных сосудах и безъядерные материнские эритроциты (× 300). ( b ) Окрашивание гематоксилином и эозином плацентарного лабиринта VHL — / — E10.5 без эмбрионального васкулогенеза (× 300). Обратите внимание на наличие зародышевых сосудов с ядросодержащими эритроцитами на краю тонкого лабиринта, которые не вторглись в лабиринт (стрелки). ( c ) Окрашивание гематоксилином и эозином VHL — / — E11.5 плацентарный признак кровоизлияния в аномальный лабиринт (× 150).

К ст. E11.5 — E12.5 лабиринт плаценты показал сильное разрушение, потерю нормальной структуры и кровоизлияние (рис. 4 c ). Эти аномалии в конечном итоге привели к развитию геморрагического и некротического участка плаценты. Эмбрионы VHL — / — в целом были нормальными гистологически до тех пор, пока не развилось поражение плаценты, после чего эмбрион стал некротическим. В качестве контроля оценивали фенотипически аномальные эмбрионы и плаценты от нормальных скрещиваний мышей C57BL / 6.Два из 36 эмбрионов (6%) из четырех пометов между E8.5 и E12.5 были определены как аномальные при макроскопическом исследовании. В то время как эмбриональные аномалии были отмечены гистологически у этих эмбрионов, ни у одного из них не были обнаружены характерные поражения плаценты, наблюдаемые у мышей VHL . Следовательно, очевидно, что эмбриональная летальность, наблюдаемая у мышей с дефицитом VHL , связана с отсутствием плацентарного васкулогенеза и последующей плацентарной недостаточностью.

Экспрессия VHL и фактора роста эндотелиальных клеток (VEGF) в плаценте.

Экспрессия VHL была проанализирована в плацентарном лабиринте нормальных и аномальных эмбрионов. Высокие уровни экспрессии мРНК VHL были обнаружены при гибридизации in situ в плацентарном лабиринте нормальных эмбрионов на ст. E10.5 — E12.5 (фиг. 5 a ). Более низкие уровни экспрессии VHL были обнаружены в желточном мешке и других эмбриональных тканях (данные не показаны). Отсутствие мРНК VHL обнаружено у эмбрионов VHL — / — (рис.5 б ). Кроме того, VHL был обнаружен иммуногистохимическим окрашиванием в лабиринтных трофобластах, аллантоисной мезодерме и некоторых плацентарных эмбриональных эндотелиях нормальной плаценты и эмбрионов (рис. 5 c и d ). Следовательно, мРНК и белок VHL обычно экспрессируются в плацентарном лабиринте и мезодерме, а потеря экспрессии у VHL-дефицитных эмбрионов связана с отсутствием васкулогенеза в этом месте.

Рисунок 5

Анализ экспрессии VHL и VEGF в норме и VHL — / — E10.5 эмбрионов. ( a ) Микрофотография в темном поле VHL in situ гибридизации нормального эмбриона с использованием антисмыслового зонда (× 30). Высокие уровни экспрессии VHL наблюдаются в плацентарном лабиринте. ( b ) Микрофотография в темном поле VHL in situ. гибридизация эмбриона VHL — / — с использованием антисмыслового зонда, показывающая отсутствие значительной гибридизации (× 30). ( c и d ) Авидин-биотиновый комплекс иммуногистохимии нормального VHL + / + E10.5 плацента, показывающая экспрессию VHL в аллантоидной мезенхиме ( c , × 750) и трофобластах плацентарного лабиринта ( d , × 300). ( e ) Иммуногистохимический анализ комплекса авидин-биотин нормальной плаценты E10.5, показывающий экспрессию VEGF в трофобластах плацентарного лабиринта (× 300). ( f ) Иммуногистохимический анализ авидин-биотинового комплекса плаценты VHL — / — E10.5, показывающий значительно сниженные уровни белка VEGF в трофобластах плацентарного лабиринта (× 300).

Поскольку экспрессия VEGF негативно регулируется VHL в клеточных линиях почечной карциномы (13–15), а VEGF, как известно, регулирует васкулогенез (16–19), плаценты от нормальных и VHL-дефицитных эмбрионов анализировали на белок VEGF. Высокие уровни белка VEGF были обнаружены в трофобластах плацентарного лабиринта нормальных эмбрионов E10.5 (рис. 5 и ), демонстрируя, что и VHL, и VEGF одновременно экспрессируются в трофобластах плацентарного лабиринта. Однако, вопреки тому, что можно было бы предсказать из вышеупомянутых исследований, уровни белка VEGF были значительно снижены в лабиринтных трофобластах VHL-дефицитной плаценты (рис.5 ф ). Эти результаты предполагают, что VHL-регуляция экспрессии VEGF может отличаться в трофобластах плацентарного лабиринта по сравнению с клетками карциномы почек.

ОБСУЖДЕНИЕ

Среди самых ранних событий дифференцировки у эмбрионов млекопитающих те, которые направляют клетки к развитию внеэмбриональных тканей, плаценты, желточного мешка и амниона (20). Плацента происходит из клеток трофобласта, а мезодермальные клетки — из внутренней клеточной массы, и эти типы клеток кажутся гистологически нормальными у мышей с дефицитом VHL .Однако потеря нормальной экспрессии VHL в трофобластах и ​​мезодермальных клетках, по-видимому, объясняет отсутствие васкулогенеза в плацентарном лабиринте, что приводит к плацентарной недостаточности. С другой стороны, желточный мешок происходит из энтодермальных клеток внутренней клеточной массы, а мезенхимальные клетки в стенке желточного мешка конденсируются с образованием островков крови (20). Островки крови дифференцируются с образованием эндотелиальных клеток сосудов и примитивных клеток крови. Экспрессия VHL обнаруживается в энтодерме желточного мешка, но не в эндотелии нормальных эмбрионов (данные не показаны).У мышей с дефектом VHL большинство исследованных желточных мешков выглядело нормальным, и можно было легко различить примитивные клетки крови. Однако у некоторых эмбрионов желточные мешки выглядели атрофированными и имели уменьшенное количество кровяных островков (данные не показаны). Таким образом, в то время как VHL может играть некоторую роль в развитии желточного мешка и островков крови, основной причиной эмбриональной летальности у мышей с дефицитом VHL является плацентарная недостаточность.

Было показано, что контроль экспрессии VEGF происходит как на уровне инициации транскрипции, так и в ответ на гипоксию за счет стабильности мРНК (21-24).Отрицательная регуляция экспрессии VEGF с помощью VHL была ранее продемонстрирована на линиях клеток карциномы почек, содержащих инактивированный эндогенный VHL и экспрессирующих высокие уровни VEGF (13-15). Повторная экспрессия VHL дикого типа после переноса гена приводит к снижению уровней VEGF в этих клетках из-за снижения стабильности мРНК VEGF, а не транскрипции (14, 15). Однако в этом исследовании было обнаружено, что экспрессия VEGF снижена в VHL-дефицитных трофобластах плацентарного лабиринта. Принимая во внимание, что трофобласты плацентарного лабиринта, обнаруженные в плаценте с дефицитом VHL, казались нормальными и жизнеспособными, потребуются дальнейшие исследования, чтобы определить, связано ли это снижение напрямую с инактивацией VHL (что указывает на альтернативную форму регуляции в трофобластах плацентарного лабиринта, чем наблюдаемая в клетках карциномы почек) или вторичный эффект и ранний индикатор плацентарной недостаточности.

Принимая во внимание, что ряд факторов, как известно, стимулирует или ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток и образование сосудов (25), VEGF является единственным известным фактором, который, как было показано, участвует в васкулогенезе (16-19). VEGF является лигандом для семейства рецепторных тирозинкиназ, которое включает Flt-1 / VEGF-R1, Flk-1 / VEGF-R2 и Flt-4 / VEGF-R3 (26, 27). Мыши с дефицитом VEGF, Flt-1 или Flk-1 были разработаны и демонстрируют эмбриональную летальность от E9.5 до E11.5 (16-19), подобно эмбрионам с дефицитом VHL, описанным в этом отчете.Летальность у мышей с рецепторами VEGF и VEGF, по-видимому, связана с дефектами васкулогенеза, а также с развитием кровяных островков (гематопоэзом). Интересно, что гетерозиготные по VEGF мыши также обнаруживают эмбриональную летальность от E10.5 до E11.5 (18-19), указывая тем самым, что доза гена важна для VEGF. Эти результаты предполагают, что пониженные уровни VEGF, наблюдаемые у гомозиготных эмбрионов VHL , могут играть важную роль в эмбриональной летальности.

Эмбриональная летальность в результате аномального развития плаценты также наблюдалась у мышей Mash-2 (28) и VCAM1 (29).Mash-2 представляет собой фактор транскрипции основная спираль-петля-спираль и обычно экспрессируется в трофобластах (28). Мыши с дефицитом Mash-2 имеют отсутствие диплоидных предшественников трофобластов на E8.5 и умирают из-за плацентарной недостаточности. Химерное восстановление дефекта плаценты привело к появлению Mash-2 и мутантов, которые были жизнеспособными и явно нормальными, что указывает на некритическую роль Mash-2 в эмбриональном развитии. У мышей VCAM1 аллантоис не может слиться с хорионом на E8.5, что приводит к аномальному развитию плаценты и гибели эмбриона на E9.5 — E11.5 (29). Однако этот дефект не является полным. У некоторых эмбрионов с дефицитом VCAM1 аллантоис сливается с хорионом, но аллантоисная мезодерма развивается ненормально. Кроме того, меньшая часть мышей с дефицитом VCAM1 выжила и фертильна.

Результаты, представленные в этом отчете, демонстрируют, что VHL необходим для нормального развития внезародышевых сосудов. Эмбриональная летальность у мышей с дефицитом VHL на аналогичной стадии беременности также была обнаружена другой группой (N.Клей, личное сообщение). Определение любых дополнительных онтогенетических ролей VHL должно предшествовать попыткам спасти развивающиеся эмбрионы от плацентарной недостаточности. Гетерозиготные мыши VHL жили более 15 месяцев без признаков серьезного заболевания, что указывает на то, что гаплонедостаточность VHL не может быть критическим признаком для нормальной функции VHL. Генотипирование показало, что большинство, если не все, протестированные опухоли VHL демонстрируют делеционную инактивацию унаследованного аллеля VHL дикого типа и сохранение унаследованного инактивированного аллеля, как это было предсказано для гена-супрессора опухоли.Развитие опухолей у мышей VHL может происходить по аналогичному механизму, но для развития может потребоваться более 15 месяцев. Дальнейший анализ мышей VHL должен дать нам лучшее понимание роли VHL в развитии и онкогенезе.

Благодарности

Мы с благодарностью выражаем признательность д-ру Н. Клею за обсуждение VHL-дефицитных мышей, д-р. F. Latif и M. Lerman за обмен информацией о последовательности кДНК мыши VHL перед публикацией, Dr.C. Fox и C. Rehm, Лаборатории молекулярной гистологии, Гейтерсбург, Мэриленд, за проведение исследований гибридизации in situ и , Б. Каспрзак за иммуногистохимию и К. Ф. Дадли и С.-П. Хуан за техническую помощь. Эта работа была частично поддержана контрактом службы общественного здравоохранения с компанией Science Applications International Corporation, Фредерик, Мэриленд.

Сноски

• ↵ † Текущий адрес: Департамент биохимии и молекулярной биологии, Stanley S.Онкологический центр Скотта, Медицинский центр Университета штата Луизиана, Новый Орлеан, Лос-Анджелес, 70112.

СОКРАЩЕНИЯ

ES,

зародышевый стебель;

E,

гестационный день;

VEGF,

фактор роста эндотелиальных клеток сосудов

.