Лада последний выпуск: Модели LADA, снятые с производства – Официальный сайт LADA

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в котором κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) вычисляется как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость передачи резонансной энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир
(4) 4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорно.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно приводятся для предполагаемого значения κ в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для вариации κ в квадрате. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ в квадрате таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, если вообще возможно, определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые данные указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Больше неопределенности существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близкими расстояниями донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность, обусловленную фактором ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ в квадрате) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение знания критического расстояния Фёрстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера является сложным в некоторых аспектах, но простым и надежным по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогеновой лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазово-контрастное или дифференциально-интерференционное ( DIC ) освещение.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа прикреплена стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье для получения широкоугольной флуоресценции и получения изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального излучения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительный срок службы, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител биологическая активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами, не должна изменяться. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результатов измерений резонансной передачи энергии.
• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставило значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, широкий спектр методов может быть использован для выполнения самого измерения.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно рассматривать как показатель резонансного переноса энергии, обычно используется отношение двух значений: I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и детектирования повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным, флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепи событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное снижение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение излучения донора (рис. 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль излучения акцептора (рис. 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях метод фотообесцвечивания доноров менее сложен, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения донорной эмиссии измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания акцепторной молекулы.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод коррекции обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая испускания донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рис. 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируется как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Это происходит отчасти потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может быть изменен множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресценции, классифицируются как во временной области ( в импульсном режиме , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований с помощью измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенным применением флуоресцентного резонансного переноса энергии является измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, а расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя доступны различные методы измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Джозеф Р. Лакович — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Введение в технологию флуоресцентной резонансной передачи энергии (FRET) и ее применение в биологических науках

Автор : Пол Хелд, доктор философии, отдел приложений, BioTek Instruments

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — физическое явление, впервые описанное более 50 лет назад, которое сегодня все чаще используется в биомедицинских исследованиях и открытии лекарств.FRET основан на зависящей от расстояния передаче энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Из-за своей чувствительности к расстоянию FRET использовался для исследования молекулярных взаимодействий. FRET — это безызлучательная передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Молекула-донор — это краситель или хромофор, который первоначально поглощает энергию, а акцептор — это хромофор, которому впоследствии передается энергия. Это резонансное взаимодействие происходит на расстояниях, превышающих межатомные расстояния, без преобразования в тепловую энергию и без каких-либо столкновений молекул.Передача энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донора и времени жизни возбужденного состояния, а также к увеличению интенсивности излучения акцептора. Пару молекул, которые взаимодействуют таким образом, что возникает FRET, часто называют парой донор / акцептор.

Несмотря на то, что на FRET влияет множество факторов, основных условий, которые должны быть соблюдены для возникновения FRET, относительно немного. Молекулы донора и акцептора должны находиться в непосредственной близости друг от друга (обычно 10–100 Å).Спектр поглощения или возбуждения акцептора должен перекрывать спектр излучения флуоресценции донора (рис. 1). Степень их перекрытия называется спектральным интегралом перекрытия (J). Ориентации диполей донорного и акцепторного переходов должны быть примерно параллельны. Если предположить, что донорно-акцепторные пары совместимы, наиболее важным элементом, необходимым для возникновения FRET, является близость пар. Фёрстер продемонстрировал, что эффективность процесса (E) зависит от обратного шестого расстояния между донором и акцептором (см. Уравнение 1).[1]

где Ro — расстояние Ферстера, на котором передается половина энергии, а r — фактическое расстояние между донором и акцептором. Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Ферстера (Ro). Величина Ro зависит от спектральных свойств донора и акцептора. Расстояние Ферстера от 20 до 90 Å наиболее полезно для изучения биологических макромолекул.Эти расстояния сопоставимы с диаметрами многих белков, толщиной биологических мембран и расстояниями между сайтами на мультисубъединичных белках. Любой процесс, который влияет на скорость передачи энергии, позволяет количественно оценить процесс. В результате FRET часто называют спектроскопической линейкой. Обратите внимание, что расстояние Ферстера (Ro) зависит от ряда факторов, включая квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора (fd), показатель преломления раствора (n), дипольную угловую ориентацию каждой молекулы. (k2) и спектральный интеграл перекрытия донора и акцептора (J).См. Уравнение 2.

Рис. 1. Схематическое изображение интеграла перекрытия спектров

В качестве примера влияния расстояния на эффективность передачи энергии можно использовать некоторые произвольные числа для расстояния Ферстера (Ro) и фактического расстояния (r). Если Ro произвольно задан равным 1 (Ro = 1) и расстояние между донором и акцептором также равно 1, тогда r = Ro, а уравнение эффективности будет E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 1 ⁶ ), что равно 0.5 (т.е. 50%). Эта половина максимального значения и есть то, что определяется как расстояние Фёрстера. Если расстояние в 10 раз меньше (например, r = 0,1Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 0,1 ⁶ ) = 0,999999, что значительно эффективнее. Однако, если расстояние между донором и акцептором на 10 раз больше (т.е. r = 10Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 10 ⁶ ) = 0,0000001. Эта чрезвычайная чувствительность к расстоянию — это то, что позволяет использовать FRET для экспериментов с приближением.

Обычно донорная и акцепторная части различаются, и в этом случае FRET можно обнаружить по появлению флуоресценции акцептора или по тушению донорной флуоресценции. Зонд-донор всегда представляет собой флуоресцентную молекулу. Обратите внимание, что люминесцентные молекулы ведут себя как флуоресцентные молекулы в отношении своего излучения. При соответствующем возбуждении его электроны перескакивают из основного состояния (So) на более высокий колебательный уровень. Очень быстро (в течение пикосекунд) эти электроны распадаются на самые низкие колебательные уровни (S1) и, в конечном итоге, распадаются (в течение наносекунд) обратно в состояние So, и излучается фотон света.Когда выполняются условия для возникновения FRET, затухание флуоресценции донора и передача энергии акцептору будут конкурировать за спад энергии возбуждения. При резонансной передаче энергии фотон НЕ излучается, а энергия передается молекуле-акцептору, электроны которой, в свою очередь, возбуждаются, как описано для молекулы-донора. При последующем возврате в основное состояние излучается фотон (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение состояний колебательной энергии электрона, возникающих во время FRET.

Измерение

Обнаружение и количественное определение FRET, безусловно, может быть выполнено различными способами. Поскольку FRET может приводить как к уменьшению флуоресценции молекулы донора, так и к увеличению флуоресценции акцептора, может быть выполнено определение метрики соотношения двух сигналов. Преимущество этого метода заключается в том, что измерение взаимодействия не зависит от абсолютной концентрации датчика.Поскольку не все акцепторные части являются флуоресцентными, их можно использовать в качестве средств для гашения флуоресценции. В этих случаях те взаимодействия, которые приводят к тому, что флуоресцентная донорная молекула приближается к такой молекуле, могут привести к потере сигнала. И наоборот, реакции, которые устраняют близость флуоресцентного донора и тушителя, могут привести к увеличению флуоресценции. Одним из таких примеров могут быть анализы протеазы. Эти анализы обычно включают флуоресцентный фрагмент на одном конце и гасящую молекулу на другом конце, разделенные пептидом, содержащим последовательность расщепления протеазой.

Некоторые примеры

Генетически кодируемые флуоресцентные красители, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и родственные молекулы синего, голубого, желтого и красного цветов, обеспечивают способность выполнять FRET in vitro, особенно в живых клетках [2]. Эти белки образуют пары FRET друг с другом, а также с обычными красителями. Они могут быть связаны с другими белками генетически или ковалентно, но при этом сохранять свою флуоресцентную способность. Эти красители могут быть генетическими элементами, которые могут быть связаны с другими генами с образованием химерных белков.Эти химерные белки содержат GFP (или связанный с ним флуоресцентный белковый элемент) и предполагаемый связывающий домен. С различными химерными белками (один донор и один акцептор) можно исследовать белок-белковые взаимодействия. Только когда пары донор / акцептор взаимодействуют посредством белок-белковых взаимодействий, результатом будет FRET. (Рисунок 3)

Рис. 3. Схематическое изображение взаимодействия двух разных флуоресцентных белковых химер. Белок-белковые взаимодействия между белками, помеченными A и B, приводят к тому, что синий флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок находятся в достаточно близком расстоянии, чтобы позволить FRET возникать.В этом примере возбуждение синего флуоресцентного белка приводит к испусканию флуоресценции зеленым флуоресцентным белком.

Органические цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, которые излучают в красном диапазоне (> 550 нм), обладают рядом преимуществ. Их диапазон излучения таков, что часто снижается фоновая флуоресценция. Кроме того, большие расстояния (> 100 Å) могут быть измерены в результате высоких коэффициентов экстинкции и хороших квантовых выходов. Даже донорно-акцепторные пары с разделенными спектрами излучения (т.е. низкий интеграл перекрытия) приводят к приемлемым расстояниям Фёрстера. Например, Cy3, который излучает максимум на 570 нм, и Cy5, который излучает на 670 нм, имеют расстояние Ферстера> 50 Å. Большое расстояние между парами позволяет измерять излучение акцептора в результате FRET без помех от излучения донора. Кроме того, эти молекулы могут быть напрямую связаны с определенными участками в синтетически полученных нуклеиновых кислотах, что позволяет использовать FRET для оценки отжига нуклеиновых кислот.

Рисунок 4.Схематическое изображение FRET, возникающего между флуоресцентными фрагментами Cy3 и Cy5 при отжиге меченых олигонуклеотидов.

В примере, изображенном на фиг. 4, два комплементарных олигонуклеотида РНК помечены Cy3 и Cy5 соответственно. Когда эти меченые молекулы не отжигаются (рис. 4A), возбуждение РНК-олигонуклеотида, меченного Cy3, светом с длиной волны 540 нм приводит только к испусканию света Cy3 с длиной волны 590 нм, в то время как комплементарная РНК-олиго, меченная Cy5, не излучает любой свет с длиной волны 590 нм или его истинная длина волны излучения 680 нм.Однако, когда двум олигонуклеотидам позволяют отжигаться, непосредственная близость молекул позволяет происходить переносу FRET. Это приводит к испусканию света с длиной волны 680 нм, когда отожженная молекула возбуждается светом с длиной волны 540 нм. Обратите внимание, что не все излучение Cy3 на длине волны 590 нм теряется, но значительная его часть теряется.

Рис. 5. Схематическая диаграмма активности FRET, используемой ВСП

(VSP) — это технология анализа на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), используемая для обнаружения лекарств с высокопроизводительным ионным каналом.Донор FRET представляет собой связанный с мембраной кумарин-фосфолипид (CC2-DMPE), который связывается только с внешней стороной клеточной мембраны. Акцептор FRET представляет собой мобильный, отрицательно заряженный, гидрофобный оксонол [DiSBAC ₂ (3) или DiSBAC ₄ (3)], который будет связываться с любой стороной плазматической мембраны в ответ на изменения мембранного потенциала (рис. 5). В ВСП используется зависимость от расстояния. FRET может иметь место только тогда, когда акцептор DISBAC ₂ (3) расположен на внешней стороне клеточной мембраны.Покоящиеся клетки имеют относительно отрицательный потенциал, поэтому два зонда связываются с внешней стороной клеточной мембраны, что приводит к эффективному FRET. Возбуждение донорного зонда CC2-DMPE (при ~ 400 нм) генерирует сильный красный сигнал флуоресценции (при ~ 590 нм) от зонда-акцептора оксонола. Когда мембранный потенциал становится более положительным, как это происходит при деполяризации клеток, оксонольный зонд быстро перемещается (в субсекундном временном масштабе) на другую сторону мембраны (рис. 5). Таким образом, каждый оксонольный зонд «чувствует» и реагирует на изменения напряжения в ячейке.Эта транслокация разделяет пару FRET, поэтому возбуждение донорного зонда CC2-DMPE теперь генерирует сильный синий сигнал флуоресценции (при ~ 460 нм) от зонда CC2-DMPE. Ожидается, что деполяризация клетки, которая заставляет DISBAC ₂ (3) перемещаться на внутреннюю сторону мембраны, приведет к снижению активности FRET.

Соединения лантанидов, такие как европий и тербий, эффективно используются в качестве доноров в реакциях FRET. Эти соединения обеспечивают очень хорошее соотношение сигнал / шум в результате их длительного периода полураспада флуоресценции и спектральных характеристик.Эмиссия этих соединений имеет резко пиковый профиль с большим стоксовским сдвигом от возбуждения. Кроме того, длительный период полураспада флуоресценции позволяет начать измерение после прекращения возбуждающего света. Задержка между возбуждением и измерением (диапазон мсек) позволяет рассеяться фоновой флуоресценции от молекулы органического акцептора с периодом полураспада в наносекундном диапазоне. Таким образом, при соответствующей задержке измеряется только донорно-акцепторная эмиссия.

Донорная молекула не всегда должна включать флуоресцентное соединение.Люминесцентные молекулы излучают фотоны очень похоже на флуоресценцию. Основное различие состоит в том, что электронное возбуждение не является результатом поглощения фотонов, а, скорее, высвобождением химической энергии, содержащейся в молекуле. Когда возбужденные электроны возвращаются к своему основному положению, энергия может быть высвобождена в виде фотона света или передана через RET молекуле-акцептору, если условия верны. Хотя количество молекул, которые можно использовать, более ограничено, эта технология имеет то преимущество, что отсутствует внешнее возбуждение молекулы акцептора.

Проблемы

При разработке экспериментов FRET необходимо учитывать ряд вопросов. Самая очевидная проблема — это близость. В зависимости от схемы анализа, непосредственная близость будет либо установлена, либо устранена во время анализа, что приведет к изменению сигнала, который можно измерить. Необходимо выбрать подходящие пары донор / акцептор. Пары должны иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь достаточную разницу в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга.Выбор фильтров для выбора длины волны флуоресценции также имеет решающее значение для успеха или неудачи экспериментального обнаружения FRET. Фильтр возбуждения для донора должен иметь возможность избирательно возбуждать молекулу донора, сводя к минимуму прямое возбуждение молекулы акцептора. Загрязняющее прямое возбуждение акцепторной молекулы может быть учтено с помощью соответствующих контролей, но большие количества затрудняют интерпретацию данных. Как показано на рисунке 1, фильтры, используемые для возбуждения Cy3, минимизировали возбуждение Cy5, обеспечивая при этом достаточный сигнал возбуждения для Cy3.

Еще одна важная проблема, связанная с обнаружением FRET, связана с концентрацией аналита. Только те молекулы, которые взаимодействуют друг с другом, приведут к FRET. Если присутствуют большие количества донорных и акцепторных молекул, но они не взаимодействуют, количество происходящего FRET будет довольно низким. В этом примере, хотя донорные и акцепторные молекулы могут быть очень легко обнаружены по отдельности, фактического количества активности FRET может быть недостаточно для обнаружения. Что касается FRET, фактически измеряемым «аналитом» являются пары донор / акцептор, а не отдельные компоненты.Кроме того, как донорные, так и акцепторные молекулы должны иметь достаточную концентрацию для того, чтобы иметь место FRET. Большинство связывающих событий — это динамический процесс, который достигает устойчивого состояния. Если одного из компонентов реакции не хватает, то общее связанное количество будет естественно низким. Например, временные трансфекции с двумя разными генетическими элементами, которые приводят к тому, что один из элементов не эффективно транслируется в белок, приведут к низким уровням FRET. Клеточная локализация также может иметь значение.Если одна молекула находится в цитоплазме, а другая — в ядре, взаимодействия друг с другом не будет, несмотря на достаточное количество каждой из них.

Приложения FRET

• Структура и конформация белков [3]
• Пространственное распределение и сборка белков [4]
• Взаимодействия рецептор / лиганд [5]
• Иммуноанализ [6]
• Структура и конформация нуклеиновых кислот [7]
• ПЦР в реальном времени и определение SNP [8,9]
• Гибридизация нуклеиновых кислот [10]
• Распределение и транспорт липидов [11]
• Анализы слияния мембран [12]
• Определение потенциала мембраны [13, 14]
• Анализы флуорогенных протеаз [15]
• Индикаторы циклического AMP [16]

Узнать больше о Synergy HTX
Многорежимный считыватель

Список литературы

1. Förster, T.(1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция Ann. Phys 2: 55-75.
2. Tsien, R. (1998) Ann. Обзор Biochem, 67: 509-544
3. Jonsson T, Waldburger CD, Sauer RT, (1996) Нелинейные отношения свободной энергии в разворачивании репрессора дуги подразумевают существование нестабильных, нативных промежуточных продуктов сворачивания. «. Biochemistry 35: 4795-4802.
4. Watson BS, Hazlett TL, Eccleston JF, Davis C, Jameson DM, Johnson AE. (1995) Расположение макромолекул в аминоацил-тРНК.фактор элонгации Tu.GTP тройной комплекс. Исследование передачи энергии флуоресценции. Биохимия 34: 7904-7912
5. Бергер В., Принц Х., Стриссниг Дж., Канг Х.С., Хаугланд Р., Глоссманн Х. (1994) Сложный молекулярный механизм связывания дигидропиридина с Ca (2 +) — каналами L-типа, выявленный с помощью резонансной передачи энергии флуоресценции. Биохимия 33: 1875-11883.
6. Ханна П.Л., Ульман Э.Ф. (1980) 4 ‘, 5’-Диметокси-6-карбоксифлуоресцеин: новый диполь-дипольный акцептор переноса энергии флуоресценции, пригодный для флуоресцентных иммуноанализов.Анал Биохим 108: 156-161.
7. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Лилли Д.М. (1994) Структура раствора четырехстороннего соединения ДНК в условиях с низким содержанием соли: анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии. Biophys J 66: 99-109.
8. Ли Л.Г., Ливак К.Дж., Мулла Б., Грэм Р.Дж., Винаяк Р.С., Вуденберг TM. (1999) Семицветное, однородное обнаружение шести продуктов ПЦР. «Biotechniques 27: 342-349.
9. Мякишев М.В., Хрипин Ю., Ху С., Хамер Д.Х. 2001) Высокопроизводительное генотипирование SNP с помощью аллель-специфической ПЦР с универсальными праймерами, меченными переносом энергии.Genome Res 11: 163-169.
10. Parkhurst KM, Parkhurst LJ. (1995) Кинетические исследования резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием олигонуклеотида с двойной меткой: гибридизация с олигонуклеотидным комплементом и одноцепочечной ДНК. Биохимия 34: 285-292.
11. Николс Дж. У., Пагано РЭ. (1983) Анализ резонансной передачи энергии белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. J Biol Chem 258: 5368-5371.
12. Uster PS (1993) Микроскопия резонансного переноса энергии in situ: мониторинг слияния мембран в живых клетках.Методы Энзимол. 221: 239-246.
13. Hoffman, R. и Held, P. Примечание по применению BioTek.
14. Gonzalez JE, Tsien RY. (1995) Измерение напряжения путем резонансного переноса энергии флуоресценции в отдельных клетках. Biophys J 69: 1272-1280.
15. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. (1990) Новые флуорогенные субстраты для анализа ретровирусных протеаз с помощью резонансной передачи энергии. «Science 247, 954-958.
16. . Адамс С.Р. и др. (1993) Оптические зонды для циклического AMP, флуоресцентные и люминесцентные зонды для определения биологической активности, Mason W.T., Ed.С. 133-149.

«Мы просто собирались джемовать, а потом идеи начали поступать:« No Fret выпускает дебютный сингл

». То, что началось с того, что два друга играли вместе ради развлечения, превратилось в No Fret, новую группу, в которую входят два местных музыканта.

Рори Александзандер и Джонни Моадел только что выпустили свой дебютный сингл «There I Am», интроспективную песню с альтернативным / инди-чувством, которая ставит под сомнение необходимость увязнуть в мелочах повседневной жизни в пользу более широкая картина жизни.Сингл вышел на стриминговые платформы 26 февраля

Моадель вырос в Монро и теперь называет Истон своим домом, а Алексзандер вырос в Риджфилде и после окончания юридической школы вернулся домой, когда разразилась пандемия.

Они познакомились несколько лет назад, когда работали ассистентами на съемках первого художественного фильма старшего брата Александера.

«Мы просто подружились, и по странному совпадению, когда мы лучше узнали друг друга, мы узнали эту интересную маленькую деталь, которую мой старший брат давал Рори уроки игры на барабанах, когда он был ребенком», — сказал Моадель.

После нескольких лет совместных джемов и поддержки других музыкантов на живых выступлениях, Alexzander сказал, что они решили записать свою собственную музыку и «посмотреть, сможем ли мы создать свой собственный грув».

Вдохновленные Нилом Янгом, Томом Уэйтсом, Дэвидом Боуи и Radiohead, и это лишь некоторые из них, они начали встречаться в подвальной студии Александра несколько раз в неделю, начиная с января 2020 года.

К счастью, оба работали дома и держали свои внутренние круги небольшими, поэтому они чувствовали себя в безопасности, работая вместе после того, как разразилась пандемическая изоляция.В прошлом году они не только нашли свое звучание, но и создали репертуар из 12 песен, которые они планируют выпустить как синглы.

То, что начиналось как развлечение, превратилось в полномасштабный увлекательный проект.

«Я писал много поп-музыки не для себя, и я действительно хотел сделать что-то свое, — сказал Александер. «Я позвонил Джонни, и у нас действительно не было никаких ожиданий. Мы просто собирались джемовать, а потом идеи начали появляться.

«There I Am» вышел, и мы приступили к работе над следующим синглом. Мы пытаемся записывать и писать как можно больше, развивать присутствие в Интернете и двигаться дальше. Надеюсь, когда все откроется, мы сможем давать концерты ».

Название No Fret было вдохновлено тем, что они писали музыку для других артистов и теперь могут быть аутентичными.

«Мы потратили столько лет на создание музыки для других людей… не то чтобы нам это не нравилось, но это было не совсем честно по отношению к нам», — сказал Александзандер.

«Я чувствую, что No Fret — это своего рода образ мышления, при котором мы создаем что-то честное, и мы не обязательно беспокоимся о том, что думают другие люди — мы делаем это за нас. Мы действительно сосредотачиваемся на общей картине того, почему мы вообще создаем музыку ».

Создание музыки сегодня на 180 градусов отличается от того, что было 10 или 20 лет назад, когда группы выпускали альбом, а затем гастролировали в его поддержку. Многие артисты сейчас выпускают синглы и постоянный поток контента, чтобы держать их в поле зрения публики, а также удовлетворять занятую и отвлеченную жизнь публики.

«Я думаю, что мы планируем выпустить больше синглов, чтобы контент продолжал выпускаться постоянно», — сказал Александер, когда его спросили, не скоро ли выходит альбом.

«Я думаю, что выпуск альбома — это большая потребность людей. У многих нет времени сесть и послушать целый альбом ».

Цифровой подход также имеет свои преимущества и предлагает некоторые творческие возможности.

«У нас тоже была эта идея, потому что у нас много музыки.У нас есть более длинные песни, а затем у нас есть эти короткие и интересные маленькие песни, которые были вдохновлены Beatles в их «Белом альбоме» или «Abbey Road», где у них есть большая песня, а затем у них есть минутное веселье, интересное песня », — добавил он.

«Мы могли бы выпускать песни с длинной и короткой песнями, чтобы получилась цифровая сторона B».

Открытость для возможностей и экспериментов не новость для No Fret. Их первый сингл начался с того, что Alexzander играл с аналоговым карманным битмейкером и гитарным лупом.

«Как только я это услышал, мои уши заблестели», — сказал Моадель. «Это в некоторой степени началось как дань уважения Radiohead, а затем эволюционировало», — сказал он.

«Весь процесс был естественным, органическим. То, что мы делаем, так честно и естественно, и мы просто делаем то, что нам нравится, просто хорошо проводим время ».

No Fret оправдывает свое название, не беспокоясь о том, что думают другие люди.

Для получения дополнительной информации о группе посетите сайт nofret.группа.

Эта история была обновлена, чтобы прояснить, как встретились участники группы.

PerkinElmer запускает первый в отрасли набор для анализа связывания GPCR TR-FRET и наборы бета-аррестина, чтобы помочь усовершенствовать терапевтическое открытие

Новые предложения пополнили лидирующий портфель GPCR PerkinElmer по характеристикам и скрининговым анализам, скрининговым библиотекам и оптимизации рабочего процесса

WALTHAM, Массачусетс.- 26 января 2021 г. — PerkinElmer, мировой лидер, приверженный инновациям для более здорового мира, сегодня объявил о добавлении новых наборов для анализа, которые помогут в дальнейшем открытии терапевтических открытий GPCR (G Protein-Coupled Receptor). Новые предложения PerkinElmer расширяют лидирующий портфель компании по анализу GPCR, который включает инновационные анализы, считыватели планшетов, технологии автоматизации и программные решения в сочетании с библиотеками siRNA, shRNA, CRISPR и кДНК / ORF, чтобы помочь ученым более легко и точно характеризовать рецепторы, скрининг соединений и оптимизировать рабочие процессы.

Новые анализы, которые позволяют исследователям использовать предпочтительные модели клеток по своему выбору, включают набор HTRF GTP Gi binding kit, первый в отрасли анализ связывания GTP на основе TR-FRET; набор для набора B-arr2; и общие комплекты HTRF для B-Arrestin 1, B-Arrestin 2 и AP2. Эти анализы помогут ученым и дальше лучше понимать важную роль, которую GPCR играют в заболевании, путем изучения взаимодействия, экспрессии и потенциальной модуляции внутриклеточных белков, участвующих в механизмах передачи сигналов GPCR.

Кроме того, когда новые наборы используются как часть широкого диапазона решений PerkinElmer для GPCR, пользователи могут полностью охарактеризовать изучаемые GPCR — от связывания лиганда с платформой Tag-Lite® и второго мессенджера с cAMP и IP-One. ™ для последующей передачи сигналов GPCR с помощью сотен доступных анализов. С недавним приобретением Horizon Discovery портфель PerkinElmer также включает siRNA, shRNA, CRISPR guide RNA и библиотеки кДНК / ORF, такие как ON-TARGETplus ™, SMARTvector ™ и Edit-R ™, а также службы скрининга, которые помогают исследователям лучше исследовать влияние модуляции и редактирования генов на драйверы болезни GPCR.

«Поскольку препараты, нацеленные на GPCR, составляют более 30% всех терапевтических средств, одобренных FDA, и 20% всех изучаемых лекарств, эта область исследований и разработок была невероятно плодотворной и имеет огромный потенциал на будущее», — сказал Алан Флетчер. Вице-президент и генеральный директор по естественным наукам, PerkinElmer. «Добавляя эти новые тесты к нашим и без того надежным возможностям GPCR, мы даем исследователям комплексное решение для продолжения раскрытия роли GPCR в развитии болезни, чтобы можно было найти новые и более эффективные терапевтические средства.”

Для получения дополнительной информации о новых наборах и обширной линейке предложений PerkinElmer GPCR посетите: https://www.perkinelmer.com/category/gpcr-research-reagents и https://horizondiscovery.com/en/screening/screening -библиотеки.

О компании PerkinElmer

PerkinElmer позволяет ученым, исследователям и клиницистам решать самые важные задачи в области науки и здравоохранения. С миссией, направленной на инновации для более здорового мира, мы предоставляем уникальные решения для обслуживания рынков диагностики, наук о жизни, пищевых продуктов и прикладных товаров.Мы стратегически сотрудничаем с клиентами, чтобы получать более раннюю и точную информацию, подкрепленную глубоким знанием рынка и технической экспертизой. Наша преданная своему делу команда, насчитывающая около 14 000 сотрудников по всему миру, с энтузиазмом помогает клиентам создавать более здоровые семьи, улучшать качество жизни и поддерживать благополучие и долголетие людей во всем мире. Компания сообщила о выручке примерно в 2,9 миллиарда долларов в 2019 году, обслуживает клиентов в 190 странах и является составной частью индекса S&P 500.Дополнительную информацию можно получить по телефону 1-877-PKI-NYSE или на сайте www.perkinelmer.com.

Контактное лицо для СМИ:
Дженнифер Макнил
[email protected]
+1 508.380.2902

Bioauxilium представляет THUNDER ™, новое поколение наборов для анализа сигналов клеток TR ‑ FRET

Содержание пресс-релиза от Business Wire. Сотрудники AP News не участвовали в его создании.

Нажмите, чтобы скопировать

MONTREAL — (BUSINESS WIRE) — 19 февраля 2020 г.-

Bioauxilium Research Inc., канадская биотехнологическая компания, специализирующаяся на разработке и производстве наборов для анализа резонансной энергии Фёрстера с временным разрешением (TR ‑ FRET) мирового класса, объявила сегодня о выпуске своей патентованной безотмывочной платформы THUNDER ™ TR ‑ FRET с введение 68 новых наборов для анализа клеточной сигнализации. Эти высококачественные, полностью проверенные, но доступные наборы киназ на основе клеток были разработаны для обеспечения простого, быстрого и чувствительного полуколичественного определения конкретных внутриклеточных фосфорилированных и / или общих белков в клеточных лизатах.

Готовые к использованию наборы THUNDER ™ для анализа клеточных сигналов основаны на формате сэндвич-иммуноанализа с более высокой специфичностью. Однако, в отличие от обычного и улучшенного ИФА, они используют протокол без промывки с добавлением только одного реагента и этапом инкубации. Этот оптимизированный протокол значительно сокращает время работы и вариабельность анализа и легко поддается автоматизации для высокопроизводительного скрининга (HTS). Анализы можно проводить в том же небольшом объеме, используя 96-луночные планшеты с половинной площадью или 384-луночные планшеты с низким объемом.

Наборы для анализа THUNDER ™ сочетают в себе тщательно проверенные антитела, наилучшие совместимые флуорофоры FRET и строгие производственные стандарты для обеспечения специфичности, улучшенных характеристик анализа TR ‑ FRET и согласованности от партии к партии. Все наборы проходят строгий процесс проверки с использованием лизатов клеток, обработанных активаторами и ингибиторами, специфичными для определенного пути, для дальнейшего подтверждения целевой специфичности и демонстрации эффективности в реальных условиях анализа. Данные валидации включены в прилагаемые таблицы данных, которые являются наиболее полными на рынке.Все наборы доступны в нескольких размерах, подходящих как для лабораторных экспериментов, так и для высокопроизводительных экранов.

«THUNDER ™ — это доступная платформа для клеточного анализа, которая обеспечивает легкий доступ к мощной технологии TR ‑ FRET для всех исследователей, стремящихся количественно определить небольшое количество эндогенных белков в клетках», — сказал Хайме Падрос, доктор философии, президент, Биоауксилиум. «Мы считаем, что THUNDER ™ впервые представляет собой реальную и экономичную альтернативу ELISA и другим запатентованным TR ‑ FRET, а также технологиям анализа на основе шариков.”

THUNDER ™ доступны по всему миру и могут быть приобретены непосредственно через веб-сайт Bioauxilium или через одного из официальных дистрибьюторов Bioauxilium.

Технология THUNDER ™ TR ‑ FRET также доступна по запросу клиентов Bioauxilium для индивидуальной маркировки антител и услуг по разработке анализов.

Для получения дополнительной информации о Bioauxilium и THUNDER ™ посетите сайт www.bioauxilium.com.

О компании Bioauxilium Research Inc.
Bioauxilium — частная канадская биотехнологическая компания, основанная опытными учеными отрасли.Он сосредоточен на проектировании, разработке и производстве высококачественных, полностью проверенных наборов для анализа, которые упрощают лабораторный рабочий процесс и ускоряют биомедицинские исследования. С момента своего создания в 2013 году компания Bioauxilium лицензировала сотни наборов для анализа TR ‑ FRET, позволяющих количественно определять клеточные белки и биомаркеры. Наборы Bioauxilium основаны на запатентованной технологии THUNDER ™ TR-FRET. Они предлагаются по отличной цене и поддерживаются квалифицированной технической поддержкой. Bioauxilium также предоставляет на контрактной основе индивидуальные услуги по разработке анализов с использованием различных технологий.

См. Исходную версию на businesswire.com: https://www.businesswire.com/news/home/2020021

03/en/

КОНТАКТ: Хайме Падрос, президент

514-312-9033 доб. 101

[email protected]

КЛЮЧЕВОЕ СЛОВО: СЕВЕРНАЯ АМЕРИКА КАНАДА

КЛЮЧЕВОЕ СЛОВО ОТРАСЛИ: ТЕХНОЛОГИИ ЗДОРОВЬЯ ДРУГИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИССЛЕДОВАНИЯ НАУКА БИОТЕХНОЛОГИИ

ИСТОЧНИК: Bioauxilium Research Inc.

Авторские права Business Wire 2020.

PUB: 19.02.2020 09:44 AM / DISC: 19.02.2020 09:44 AM

http://www.businesswire.com/news/home/2020021

03/en

Подсветка ферментного препарата выпуск по FRET

Было разработано новое поколение ферментно-чувствительных конъюгатов сополимер HPMA-лекарственное средство, в которых используется ферментно-чувствительный олигопептидный линкер. Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) применяли для исследования ферментативно-чувствительной способности клеток и животных.

За последние несколько десятилетий была разработана концепция систем доставки лекарств на основе полимеров, которые продемонстрировали превосходные свойства по сравнению с низкомолекулярными лекарствами.Например, конъюгаты сополимера N — (2-гидроксипропил) метакриламида (HPMA), содержащие доксорубицин (DOX), были первыми противораковыми конъюгатами на основе синтетического полимера, которые прошли клинические испытания. Копечек и его сотрудники из Университета Юты разработали новое поколение ферментно-чувствительных конъюгатов сополимер HPMA-лекарство, в которых используется олигопептидный линкер, чувствительный к катепсину B, который не только включается в боковые цепи для прикрепления / высвобождения лекарственного средства, но также вставляется в полимерный каркас для разложения.Фермент катепсин B сверхэкспрессируется в различных раковых клетках, таких как меланома, опухоли груди, яичников, легких, желудка и толстой кишки. В этой конструкции ферментно-чувствительный линкер стабилен во время транспортировки, но расщепляется катепсином B внутри раковых клеток-мишеней. Следовательно, это новое поколение ферментно-чувствительных разлагаемых носителей остова способно высвобождать лекарственные средства в раковых клетках, которые экспрессируют высокий уровень катепсина B. Эта конструкция может повысить соотношение высвобождения лекарственного средства опухолью к неопухолевому.

В своем исследовании метод резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) был применен для изучения ферментативно-зависимой системы доставки лекарств на основе сополимера HPMA как в клетках, так и у животных. FRET — это процесс, в котором энергия передается от флуорофора, выступающего в качестве донора, к другому хромофору или акцептору посредством диполь-дипольного взаимодействия на большие расстояния. За последнее десятилетие визуализация FRET оказалась чрезвычайно полезным инструментом для визуализации белок-белковых взаимодействий и конформационных изменений белков с высоким пространственным разрешением в микроскопии.Здесь этот метод был использован для разработки систем доставки лекарств. Пара FRET (донор Cy5 и акцептор Cy7) была включена в новую систему доставки. При воздействии фермента катепсина B линкер расщепляется, что приводит к разделению пары флуорофоров и потере сигнала FRET.

Чувствительное к ферментам высвобождение лекарственного средства конъюгатов сополимер-лекарственное средство визуализировали на уровне клеток, тканей и всего тела. Результаты визуализации продемонстрировали, что высокая экспрессия катепсина B в опухолевых клетках может вызывать быстрое высвобождение лекарств из конъюгатов и, таким образом, опосредовать относительно высокую концентрацию активного свободного лекарственного средства внутри опухолевых клеток.Следовательно, новое поколение конъюгатов сополимер HPMA-лекарственное средство может более эффективно убивать раковые клетки-мишени, снижая при этом токсичность для нормальных тканей.

В совокупности работы, представленные группой Kopeček, дают более глубокое понимание взаимосвязи функции и механизма этой новой системы доставки лекарств. Эта информация улучшит понимание поведения ферментно-чувствительных полимерных носителей и поможет сформировать дизайн высокоэффективных систем доставки с уменьшенными побочными эффектами.

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET)

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — это биофизический метод, важный для измерения расстояний в нанометровом масштабе и изменений, происходящих на расстоянии в биологических системах. Он анализирует макромолекулярные взаимодействия между флуоресцентными молекулами, имеющими близкую природу. Кинетика ассоциации / диссоциации между биологическими макромолекулами может быть проведена с помощью этого метода. Расстояние между взаимодействующими молекулами рассчитывается с помощью анализа FRET.Эта передача поглощенной световой энергии между двумя хромофорами происходит без излучения. Расстояние между молекулами измеряется с помощью оптической дифракции с ограниченным разрешением. Одиночные нити меченых красителем нитей ДНК гибридизуют, и оптические свойства двойного стандарта измеряют флуоресцентной спектроскопией.

Теоретические соображения

Атом или молекула переходят в более высокое состояние за счет поглощения фотона подходящей длины волны.Это возбуждение вызывает сдвиг атома или молекулы из основного состояния s0 в более высокое энергетическое состояние s1. Снятие возбуждения произойдет в одном из следующих процессов.

1. Тепло: Столкновение молекулы с окружающей средой приводит к высвобождению этой энергии (фотона) в виде тепловой энергии. Это безызлучательный процесс.
2. Флуоресценция: Фотон излучается обратно в результате перехода молекул из возбужденного состояния в основное состояние. Энергия, выделяемая при флуоресценции, обычно меньше, чем поглощенная энергия, небольшая часть энергии выделяется в виде тепла (стоксов сдвиг).
3. Фосфоресценция: молекула претерпевает безызлучательный переход в триплетное состояние (T1). На другом этапе молекула возвращается в основное состояние путем испускания протона.
4. Передача энергии: Возбужденная молекула (донор) передает энергию непосредственно соседней молекуле (акцептору). Молекула акцептора возбуждается электронно. Этот безызлучательный перенос может происходить как по Форстеру, так и по Декстеру. Это основной принцип анализа FRET.

1. Передача энергии излучения

Механизм передачи энергии от молекулы донора к акцептору представляет собой двухэтапный процесс.Молекула Донора из возбужденного состояния возвращается в основное состояние путем высвобождения фотона. На втором этапе фотон, освобожденный от молекулы-донора, возбуждает молекулу-акцептор. Теперь молекула-акцептор переходит в возбужденное состояние. Этот механизм называется тривиальной формой передачи энергии.

Эффективность этого процесса зависит от следующих четырех параметров:

1. квантовый выход DΦe D * для испускания фотона
2. числовая плотность nA молекул в основном состоянии A, которые могут поглотить испускаемый фотон
3. сечение поглощения A или вероятность, с которой A поглотит излучаемый фотон
4. перекрытие спектра излучения флуоресценции D * и спектра поглощения (или возбуждения) A.

Возможен также механизм безызлучательной передачи этой энергии. Передача энергии от молекулы-донора D к молекуле-акцептору A, энергия также может передаваться безызлучательным способом. Это может происходить двумя способами:

1. а) столкновением (точнее: обменным взаимодействием) (передача энергии Декстера)
2. b) кулоновским взаимодействием (передача энергии Форстера)

В случае передачи энергии Декстера возбужденные электронные орбитали молекулы донора сталкиваются с электронными орбиталями молекулы акцептора.Результат — перенос электронных орбиталей. Столкновение изменяет спин как в акцепторной, так и в донорной молекуле.

3Д * + 1А → 1Д + 3А *

Для реализации механизма переноса Декстера расстояние между молекулами донора и акцептора должно быть очень маленьким. Спиновое взаимодействие экспоненциально затухает с увеличением расстояния между молекулами акцептора и донора. Эффективно происходит на расстоянии 1 мм. Это делает механизм передачи энергии Декстера неприменимым для лабораторных экспериментов.

Механизм Форстера может применяться на больших расстояниях, поэтому его можно использовать в лабораторных условиях. Двухступенчатый процесс девозбуждения донора и возбуждения акцептора объясняется кулоновскими диполь-дипольными взаимодействиями. Прямого столкновения донорной и акцепторной молекул не требуется. Этот механизм можно объяснить молекулярным транслятором (D) и получением молекулы (A).

Константа скорости kr для спектроскопического перехода, описываемого теорией возмущений, может быть выражена «золотым правилом» Ферми:

Здесь — плотность конечных состояний, соответствующих переходу (т.е. плотность изоэнергетических донорно-акцепторных состояний)

i — волновая функция начального состояния

f — волновая функция конечного состояния

ч — оператор взаимодействия.

Вероятность радиационного перехода между возбужденным состоянием и основным состоянием определяется соотношением

дипольный момент перехода R. Он определяется как:

R = φ2 * er⋅φ1dV (2)

Здесь φ1 — электронная волновая функция молекулы в возбужденном состоянии

φ2 — сопряженная комплексная волновая функция молекулы в основном состоянии

е — это электрический заряд

r — пространственная координата.

В несколько упрощенном виде интеграл φ2 * ⋅er⋅φ1dV описывает смещение распределения заряда между основным и возбужденным состояниями при индуцировании оптического перехода переменным электромагнитным полем световой волны. Дипольный момент перехода донора теперь может безызлучательно взаимодействовать с дипольным моментом перехода акцептора. Таким образом, может происходить передача энергии возбуждения между двумя молекулами. Классически энергия взаимодействия между двумя диполями определяется как:

Эдиполь-диполь = κ / 4πϵ0 (мкДмкА / r3DA)

κ — геометрический фактор (зависит от ориентации диполей относительно друг друга)

ε0 — постоянная электрического поля (8,854 * 10-12 Ф / м)

мкД — значение электрического дипольного момента донора

мкА — значение электрического дипольного момента акцептора

rDA — (среднее) расстояние между диполями.

Если все константы объединены в одну константу, получается радиус Форстера r0, который становится следующим соотношением, которое также известно как уравнение Форстера:

Радиус Форстера — это расстояние, на котором 50% возбужденных молекул донора будут дезактивированы механизмом Форстера. Радиусы Форстера характерны для конкретной донорно-акцепторной пары и собраны в литературе для нескольких таких пар. Уравнение Форстера полезно при измерении эффективности передачи энергии E, т.е.е. часть всех фотонов, поглощенных донором, которые были переданы акцептору. Эффективность передачи энергии определяется по формуле:

Его можно определить по относительному выходу флуоресценции донора в присутствии (FDA) и в отсутствие (FD) акцептора:

Так как метод зависит от радиуса Форстера механизма Форстера и, как правило, радиусов Форстера. Весь процесс зависит от размеров биологически значимых макромолекул (20-90 А).Таким образом, этот метод идеально подходит для анализа стерической информации о таких молекулах. Таким образом, метод применим для измерения расстояний значительно ниже ограниченного дифракцией пространственного разрешения в оптической спектроскопии, соответствующего 200 нм для коротковолнового видимого (синего) света. Многие белки, структуры ДНК, толщина биологических мембран и расстояния между субъединицами больших белков имеют размер типичных радиусов Форстера. Любое изменение расстояния между донором и акцептором изменит эффективность FRET E, которую затем можно использовать для определения молекулярных структур.Например, если белок помечен соответствующими донорными и акцепторными красителями в разных положениях, можно легко отслеживать структурные изменения молекулы (например, из-за эффектов сольватации). Для этого необходимо определить эффективность передачи энергии в присутствии и в отсутствие акцептора. Если известен форстеровский радиус используемой пары донор-акцептор, то расстояние между донором и акцептором можно рассчитать в любое время.

Источником возбуждающего света может быть ксеноновая лампа высокого давления.Флуоресцентный спектрометр использует два монохроматора: первый предназначен для возбуждающего света, а второй — для испускаемого флуоресцентного света. Два пути луча для возбуждения и излучения обычно ориентированы перпендикулярно друг другу, чтобы минимизировать влияние рассеянного возбуждающего света. Поскольку флуоресцентный свет слабый и изотропно излучается во всех направлениях, требуются специальные зеркала для сбора как можно большего количества фотонов. Излучаемый свет обычно регистрируется фотоумножителем.В то время как обычный спектрометр UV / VIS обычно имеет двухлучевую конфигурацию, флуоресцентные спектрометры обычно являются однолучевыми. Еще одно важное отличие касается ширины щели монохроматоров. Для УФ (спектроскопия поглощения видимого света желательно использовать как можно более узкую щель (например, 1 нм) для оптимального спектрального разрешения. В флуоресцентной спектроскопии ширина щели обычно больше (например, от 2 до 5 нм для возбуждающего света, от 5 до 20). нм для испускаемой флуоресценции), так что детектор может уловить достаточно много света.Несколько более низкое спектральное разрешение допустимо, поскольку спектры флуоресценции растворенных молекул в жидкой фазе обычно спектрально широки и слабо структурированы. Обратите внимание, что флуоресцентная спектроскопия может выполняться в двух режимах:

a.) Для фиксированной длины волны возбуждения измеряется спектр излучения.

b.) Для фиксированной длины волны излучения измеряется спектр возбуждения.

Также возможно сканировать длины волн возбуждения и излучения, в результате чего получается массив спектров, известный как двумерные спектры.

Целью эксперимента является определение эффективности передачи энергии подходящей пары донорных и акцепторных красителей (донор (D) Cy3 и акцептор (A) Cy5) после гибридизации меченых красителем одиночных цепей ДНК.

Последовательность донорной цепи —

Cy3

|

CCC AAA CTA AAC TTA ACT AAA CTA AAC CCC

, а последовательность акцепторной цепи —

GGG TTT GAT TTG AAT TGA TTT GAT TTG GGG

|

Cy5

Обратите внимание, что здесь для ясности вторая нить не записана в обычных обозначениях от конца 5´ до конца 3´.

1. Маточные растворы A (примерно 10 мкМ) как меченых, так и немеченых растворов одноцепочечной ДНК. Из них сначала необходимо гибридизировать все возможные комбинации двойных цепей ДНК: а) донор / акцептор (Cy3 / Cy5), б) донор / голый (Cy3 / N), в) акцептор / голый (Cy5 / N), г ) голый / голый (N / N).
2. Регистрируют спектры поглощения всех двойных нитей с помощью абсорбционного спектрометра UV / VIS. Это позволит вам а) точно определить концентрацию растворов и б) выбрать лучшую длину волны возбуждения для измерений флуоресценции.Вам также потребуется контролировать два эталонных спектра кюветы: один — для кюветы, заполненной только буферным раствором, и другой — для пустой (заполненной воздухом) кюветы. Таким образом, всего вы зарегистрируете шесть спектров поглощения.
3. Регистрируют два спектра флуоресценции для каждого красителя, содержащего двухцепочечные растворы (Cy3 / Cy5, Cy3 / N и Cy5 / N), один для максимума поглощения lAA акцептора и один для максимума поглощения lD A донора. В результате получится набор из шести спектров флуоресценции.
4. Определите радиус Форстера экспериментально и теоретически и сравните значения друг с другом. Из измеренных спектров поглощения и флуоресценции донорных и акцепторных красителей вы можете рассчитать интеграл перекрытия уравнения. что, в свою очередь, позволит вам определить теоретическое значение радиуса Форстера из оптических свойств отдельных красителей. Экспериментально радиус Форстера может быть получен из измеренной эффективности передачи энергии и известной геометрии гибридизированных двойных нитей.

По отношению к

1) Пробоподготовка

Для пробоподготовки необходимо использовать микропипетки (пипетки Eppendorf). Смешайте 30 мкл каждого однониточного раствора в микропробирке, которую можно использовать для термоциклера Peqlab Primus 25. Поместите четыре смеси в термоциклер. Включите термоциклер, выберите и запустите программу, нажав кнопку RUN. Сначала образцы выдерживают при температуре 25 ° C в течение 30 с, затем нагревают до 95 ° C в течение 2 минут, затем медленно охлаждают до 25 ° C со скоростью 0.2 ° C / с, и, наконец, они будут храниться при 25 ° C еще 8 минут. После прохождения этой процедуры, которая займет около 20 минут, образцы будут гибридизированы.

По отношению к

2) Регистрация спектров поглощения

Оптическая кювета имеет длину оптического пути 3 мм. Перед каждым использованием его необходимо тщательно очищать. Удалите оставшуюся жидкость из кюветы с помощью микропипетки, установленной на объем прибл. 80 мкл и верните его в микропробирку.Затем заполните кювету 100 мкл бидистиллированной воды (ddh3O). Очистите кювету, повторив (трижды) аспирацию и выдачу наконечника пипетки. Вылейте воду и удалите оставшуюся воду со дна кюветы с помощью микропипетки. Повторите эту процедуру трижды с ddh3O и еще три раза с этанолом. После сушки кюветы азотом она готова к заполнению следующей пробой. Будьте осторожны при смене наконечников пипеток, чтобы не загрязнить или не разбавить образцы.Не касайтесь оптической поверхности кюветы пальцами и убедитесь, что при наложении пробки в кювете остается небольшой пузырек воздуха. Старайтесь избегать слишком большого количества этапов очистки кюветы, снимая спектры поглощения и флуоресценции одного и того же образца. Только образец, содержащий первый краситель, вам придется приготовить дважды, поскольку вы еще не знаете максимум поглощения второго красителя, который вам нужно знать для измерений флуоресценции в качестве второй длины волны возбуждения. Зарегистрируйте шесть спектров поглощения, как описано в приложении 1, в диапазоне длин волн от 200 до 750 нм.Не используйте автоматическую коррекцию фона, так как ручная коррекция фона (и ее обсуждение) будет частью анализа данных. Сохраните данные на карте памяти или подобном.

По отношению к

3) Регистрация спектров флуоресценции

Определите длины волн λAA и λAD акцепторных и донорных максимумов поглощения для двойных нитей, каждая из которых состоит из одной голой и одной меченой красителем нити. Используйте λAA и λAD в качестве длин волн возбуждения для регистрации спектров флуоресцентного излучения для всех трех красителей, содержащих двухцепочечные растворы..

Анализ и обсуждение данных

1) Графическое отображение спектров поглощения. Выполните коррекцию фона для спектров поглощения красителя, содержащего двойные нити, и отобразите скорректированные по фону спектры в соответствующем диапазоне длин волн.

Определите концентрации c в ваших пробах. Используйте закон Ламберта-Бера

с декадными молярными коэффициентами поглощения

εD = 150000 M − 1 см − 1 для Cy3 (при 550 нм) и

εA = 250000 M − 1 см − 1 для Cy5 (при 650 нм).

Здесь A — оптическая плотность,

ε — декадный молярный коэффициент поглощения,

с — длина пути поглощения,

c — концентрация,

— это интенсивность прошедшего излучения, а

I0 — интенсивность падающего излучения.

Оцените относительную и абсолютную концентрацию комплексов 1: 1 (Cy3 / Cy5).

2) Графическое отображение спектров флуоресценции. Определите эффективность передачи энергии.FDA и FD представляют собой интегрированные интенсивности флуоресценции гибрида донор-голый и гибрида доноракцептор. Сравнение амплитуд спектров флуоресценции в их соответствующих максимумах дает приблизительное значение для отношения FDA / FD, но не является достаточно точным, поскольку два спектра флуоресценции перекрываются. Предложите лучшую процедуру определения этого соотношения.

3) Оцените интеграл спектрального перекрытия J. В интеграле необходимо нормализовать спектр флуоресценции донора относительно его площади, так что

Эта сумма представляет собой интеграл перекрытия J.Единица J — длина в степени 6 на количество вещества, например см6 / моль, л / (моль-см3) -нм4, л / моль-см3 и т.п. Используйте интеграл перекрытия для вычисления радиуса Форстера r0. Насколько меньше J было бы, если бы спектр флуоресценции донора и спектр поглощения акцептора были сдвинуты дальше друг от друга на 50 нм? Как это повлияет на радиус Форстера и эффективность передачи энергии?

4) Оцените расстояние rgeo между двумя красителями донорно-акцепторной пары, исходя из геометрии двойной цепи Cy3 / Cy5.Используйте значение 0,34 нм в качестве среднего расстояния между двумя соседними парами оснований. Затем используйте эффективность передачи энергии E, определенную в 2), и радиус Форстера r0, определенный в 3), чтобы получить экспериментальное значение для расстояния между двумя красителями. Обсудите неточности. Вместо использования значения 0,34 нм на пару оснований можно также измерить расстояние до известной структуры ДНК с помощью программы визуализации, такой как VMD.