Лада новые модели: Модельный ряд Лада 2021 – комплектации и цены на новые модели LADA

Содержание

Модельный ряд LADA у официального дилера LADA в Санкт-Петербурге Форсаж

Сегодня даже бывшие скептики, которые раньше принципиально не покупали отечественные автомобили, обращают внимание на новые модели Волжского автозавода (ВАЗ). Действительно, за последние годы модельный ряд крупнейшего российского автопроизводителя изменился не только количественно, но и качественно.

Новые отечественные машины LADA характеризуются теперь не только доступной стоимостью, но и безопасностью, эргономичностью, надежностью и стильным дизайном. На них действительно можно комфортно ездить, а по оснащению и внешнему виду они не уступают лучшим иномаркам. При этом цены 2018 года на автомобили LADA по-прежнему самые низкие в сравнении с конкурентами. И эта разница иногда двукратная.

Сколько стоит LADA в СПб?

Компания ФОРСАЖ – официальный дилер концерна АвтоВАЗ в Санкт-Петербурге. Наш автосалон предоставляет полный спектр сервисных услуг – от «тест-драйва» и продажи до планового технического обслуживания и ремонта. В следующей таблице представлены основные характеристики, цены и комплектации LADA всех актуальных моделей.

ТАБЛИЦА

Все приведенные в таблице цены и комплектации авто являются официальными и соответствуют заводским.

Почему новую LADA выгодно купить у официального дилера?

Выбор. В каталоге компании ФОРСАЖ всегда присутствует весь модельный ряд, включая любые комплектации, варианты дизайна и наборы дополнительных опций. Можно заказать автомобиль, который полностью удовлетворяет вас как в техническом, так и в эстетическом плане.
Надежность. Каждая машина в обязательном порядке проходит полную проверку и предпродажную подготовку, так что можно быть уверенным, что она находится в идеальном состоянии. Кроме того, клиент имеет право заказать полноценный тест-драйв, чтобы самостоятельно убедиться в заявленных характеристиках.
Выгода. В официальных дилерских сетях регулярно проводятся интересные акции и предлагаются значительные скидки, позволяющие сэкономить на покупке нового автомобиля. Кроме того, всем клиентам доступна услуга кредитования на самых льготных условиях.
Удобство и комфорт. Оформление договора купли-продажи, помощь на тест-драйве и квалифицированные консультационные услуги предоставляют опытные профессионалы, регулярно проходящие тренинги и участвующие в семинарах, проводимых АвтоВАЗ. Вы получите удовольствие от общения с ними.

Чтобы приобрести любую модель из нашего каталога, уточнить технические характеристики автомобилей, записаться на тест-драйв, заказать услугу кредитования или получить другую полезную информацию, свяжитесь с нами! Воспользуйтесь формой на сайте или созвонитесь с менеджерами компании LADA ФОРСАЖ по телефону.

LADA новости | Лада-Центр – официальный дилер LADA в Санкт-Петербурге

Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю АО «АВТОВАЗ», а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

Тест-драйв всех моделей ЛАДА у официального дилера Автовек в Екатеринбурге

Тест-драйв Лада в автосалоне Автовек

Новые модели автомобилей завода АВТОВАЗ кардинально отличаются от продукции, которая выпускалась предприятием ранее. Дилерский центр Автовек предлагает провести тестовую поездку на машинах LADA, позволяющую оценить управляемость, комфорт за рулем, динамические возможности техники. Запись на тест-драйв Лада осуществляется по телефону автосалона +7 (343) 253 00 53 или через форму обратной связи на официальном сайте. Пробный заезд проводится в удобное для покупателя время с учетом графика работы автосалона и требований безопасности.

Перед посещением дилерского центра следует выбрать несколько моделей, установить приоритетные цели пробной поездки, что позволит определить сильные и слабые стороны машины. Если планируется эксплуатация техники на дорогах общего пользования, то подойдут модели Vesta или Granta. Модификации Cross или модель XRAY с увеличенным клиренсом справятся с грунтовыми дорогами с небольшой колеей. А для среднего бездорожья завод предлагает машины Niva Travel и Legend с системой полного привода и 2-скоростным раздаточным редуктором в трансмиссии.

Для детального ознакомления предлагается эксклюзивный длительный тест от салона Автовек, клиент может получить автомобиль на сутки или более. Предложение действует для покупателей, твердо решивших приобрести машину марки Лада, условия оговариваются с менеджером отдела продаж. В ходе расширенного тест-драйва покупатель оценивает вместимость багажного отделения либо удобство посадки за рулем при поездках на большие расстояния.

Правила проведения тест-драйва автомобилей Лада

При совершении тестовой поездки необходимо соблюдать правила дорожного движения, действующие на территории России. Клиент может управлять автомобилем с тем типом коробки передач, который указан в водительском удостоверении. Если в документах отсутствует подобная информация, то возможен тест-драйв на машине с любым видом трансмиссии. Клиент самостоятельно определяет модель, тип кузова автомобиля Лада для пробной поездки. В автосалоне Автовек доступны машины с кузовами седан, универсал и лифтбэк.

Как проходит тест-драйв Лада в автосалоне Автовек

При проведении тест-драйва оценивают:

Эластичность двигателя в разных режимах движения. Проверку производят при разгоне с места, при ускорении со скорости 80 км/ч на разных передачах.

Мощность мотора, от которой зависит интенсивность разгона.
Динамику торможения, способность тормозов останавливать автомобиль на разных типах покрытия. Проверку проводят на пустынном участке дороги, предварительно убедившись в отсутствии попутного транспорта.
Настройки ходовой части, влияющие на уровень комфорта и управляемость машины. Необходимо оценить поведение техники при преодолении неровностей на дороге.
Габариты и маневренность автомобиля, в ходе поездки следует припарковаться в разрешенной зоне. Оценивается чувствительность управления, усилие для поворота рулевого колеса, работа электронных ассистентов.

Вместимость салона, клиент может пересесть на задний ряд сидений и определить запас пространства для ног.

Предлагаемый салоном маршрут имеет протяженность 5 км, проходит по дорогам с твердым покрытием и небольшому участку укатанной грунтовки. Управлять автомобилем может человек, имеющий действующие права категории В, стаж или опыт вождения не учитываются. Испытать динамику, проверить шумоизоляцию салона автомобилей Лада можно в светлое время суток (с 9:00 до 18:00 зимой и с 9:00 до 20:00 летом). При выезде с территории автосалона и на первой половине маршрута за рулем находится менеджер, затем машину испытывает потенциальный покупатель.

АвтоВАЗ выпустит четыре новых модели Lada до 2025 года — Где и что

Российский автопроизводитель «АвтоВАЗ» выпустит четыре принципиально новых модели LADA до 2025 года. Об этом в понедельник, 19 апреля, заявил в своем видеообращении президент компании Ив Каракатзанис.

Прототип новой LADA Niva. Фото АвтоВАЗ

По словам топ-менеджера, завод продолжает модернизировать производство, наращивать инженерные компетенции и улучшать условия труда своих сотрудников. Выполнение этих задач является необходимым условием для выпуска четырех «принципиально новых моделей», которые появятся до 2025 года.

<center><ins class="adsbygoogle" style="display:inline-block;width:580px;height:400px" data-ad-client="ca-pub-1812626643144578" data-ad-slot="8813674614"></ins> <script>(adsbygoogle=window.adsbygoogle||[]).push({});</script></center>

4 новые модели Lada, которые появятся в 2021 году – Daily-Motor

В Сети назвали четыре новые модели Lada, которые должны выйти в продажу в России в 2021 году.

Фото: открытые источники

«АвтоВАЗ» продолжает наращивать продажи автомобилей в России. По итогам октября дилеры Lada реализовали 37 тысяч 30 новых машин, что является лучшим результатом для компании с октября 2014 года.

В следующем году модельная линейка Lada должна серьезно расшириться. Ожидается, что в продажу выйдет сразу четыре новые модели бренда.

Lada Largus FL

Lada Largus FL должен был выйти в продажу в этом году, но, по слухам, доберется до дилеров только в 2021-м. Прототипы этой модели тестируются в окрестностях Тольятти уже несколько месяцев, что позволяет фотошпионам регулярно их фотографировать. С фейслифтингом новый «Ларгус» получит новую головную оптику от Renault Logan 2 поколения, радиаторную решетку с крупной ладьей Lada, новый бампер, крылья и капот. Кроме того, в максимальной комплектации реформенная модель обзаведется «вестовскими» боковыми зеркалами с подогревом и электроприводом складывания.

Lada Granta (2 поколение)

Слухи о новой генерации Lada Granta ходят уже давно. Со сменой тележки автомобиль переедет на архитектуру Global Acess (B0), лежащую в основе Lada Largus и Renault Logan. Новое поколение бюджетника получит доработанную подвеску, усовершенствованное рулевое управление и новые задние тормоза с надежными механизмами самоподвода стояночного тормоза. Дизайн пока держится в секрете, но машину несколько раз показывали на неофициальных рендерах.

Lada Vesta FL

Пожалуй одной из самых знаменательных новинок следующего года от «АвтоВАЗа» станет обновленная Lada Vesta. Как и в случае с «Грантой», как будет выглядеть автомобиль, неизвестно, но есть пару предположений от независимых дизайнеров. Ожидается, что новая «Веста» получит модернизированный внешний облик, более современный и комфортабельный интерьер, но сохранит моторную линейку и список трансмиссий.

Lada Vesta SW Sport

Спортивный универсал Lada Vesta SW Sport много раз ловили в ходе тестовых испытаний, но информации о том, когда он появится в продаже, до сих пор нет. Предполагалось, что автомобиль выйдет летом этого года, но помешала пандемия. Теперь появления Vesta SW Sport придется подождать до 2021 года.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

новых моделей димера липопротеин-липазы

Abstract

Липопротеин-липаза (LPL) — это димерный фермент, отвечающий за выведение из крови липопротеинов, богатых триглицеридами. Хотя LPL играет ключевую роль в здоровье сердечно-сосудистой системы, экспериментально полученная трехмерная структура не была определена. Такая структура может помочь в понимании мутаций в LPL, которые вызывают у пациентов семейную недостаточность LPL, и помочь разработать терапевтические стратегии для нацеливания на LPL. Основным препятствием для структурных исследований LPL является то, что LPL является нестабильным белком, который трудно продуцировать в количествах, необходимых для ЯМР или кристаллографии.Мы представляем обновленные структурные модели LPL, созданные путем комбинирования дисульфидного картирования, компьютерного моделирования и данных, полученных из одномолекулярного резонансного переноса энергии Ферстера (smFRET). Мы являемся пионерами в технике smFRET для использования с LPL, разрабатывая условия для визуализации активной LPL и определения позиций в LPL для прикрепления флуорофоров. Используя этот подход, мы измеряем межмолекулярные взаимодействия LPL-LPL для создания экспериментальных ограничений, которые информируют новые вычислительные модели димерной структуры LPL.Эти модели предполагают, что LPL может димеризоваться с использованием интерфейса, который отличается от интерфейса димеризации, предполагаемого контактами упаковки кристаллов, наблюдаемыми в структурах липазы поджелудочной железы.

ВВЕДЕНИЕ

Липопротеинлипаза (LPL) — это димерная липаза, которая гидролизует триглицериды из липопротеинов, богатых триглицеридами, с высвобождением свободных жирных кислот для использования в тканях. LPL также увеличивает клиренс остаточных липопротеиновых частиц гепатоцитами ¹. Гомозиготные мутации, приводящие к потере функции LPL, вызывают семейный дефицит LPL, редкое заболевание, приводящее к тяжелой гипертриглицеридемии ².Более 100 миссенс-мутаций, распределенных по двум доменам LPL, могут вызывать семейную недостаточность LPL ³. Первый из этих двух доменов — это N-концевой домен, который состоит из складки альфа-бета гидролазы, которая содержит каталитическую триаду, ответственную за ее липазную активность. Этот активный центр покрыт спиральной крышкой из 22 остатков, которая открывается при взаимодействии с богатыми липидами субстратами ^{4, 5}. N-концевой домен также содержит сайт связывания активатора LPL APOCII ⁶.C-концевой домен LPL представляет собой бета-сэндвич, важный для распознавания субстрата и связывания с партнерами, такими как рецепторы липопротеинов и якорь LPL на эндотелии капилляров, GPIHBP1 ^{7, 8}. Никакая трехмерная структура LPL не была решена, но родственная мономерная липаза, известная как панкреатическая липаза (PL), идентична на 30%, и ее кристаллическая структура была использована в качестве исходной модели для LPL ⁹.

Модели структуры LPL были описаны в двух предыдущих публикациях ^{10, 11}.О первом было сообщено в 1990 году, вскоре после того, как была решена кристаллическая структура PL ⁹. Последовательности LPL и PL были выровнены, наложены с помощью программы TURBO, и энергии были минимизированы с помощью XPLOR ¹⁰. Димеры LPL моделировали путем наложения координат LPL на кристаллографический димер PL без оптимизации связывающих поверхностей ^{5, 10}. В этой модели две молекулы LPL были помещены вместе в конформации голова к хвосту и повернуты вдоль своей продольной оси, чтобы оставить место для открывания крышек.В более позднем исследовании, в 2002 году, были созданы модели LPL с использованием системы молекулярного моделирования INSIGHT II ¹¹. В этой публикации модели LPL с открытыми и закрытыми веками были основаны на структурах человека, свиньи и лошади PL ^{5, 11–13}. Чтобы создать модель димера LPL, модели мономеров LPL были снова наложены на кристаллографическую структуру димера PL, а затем была проведена минимизация энергии с использованием INSIGHT II ^{5, 11}. Последняя модель димера показывает мономеры в конфигурации «голова к хвосту» и с обеими крышками, расположенными на одной и той же поверхности комплекса ¹¹.Ни одно исследование не предоставляет молекулярные координаты для модели димера LPL. Однако при осмотре две модели в целом похожи, хотя в первой модели два мономера LPL кажутся более смещенными друг от друга. За годы, прошедшие с момента создания этих LPL-моделей, предсказание структуры белка улучшилось благодаря развитию новых вычислительных инструментов и доступности большей вычислительной мощности ^{14, 15}.

Хотя экспериментальная поддержка конфигурации голова к хвосту сильна, существует мало свидетельств, описывающих точные молекулярные детали того, как два мономера LPL объединяются.Ранние доказательства конфигурации головы к хвосту пришли из исследования химер LPL-HL, и это исследование показало, что C-концевой домен одного мономера влияет на выбор субстрата с помощью N-концевого домена др. ¹⁶. Дальнейшее подтверждение ориентации головы к хвосту было получено в исследовании, в котором мономеры LPL либо с мутациями N-концевого каталитического сайта, либо с мутациями связывания C-концевого субстрата были неактивны индивидуально, но приобретали активность при смешивании вместе ¹¹.Кроме того, вариант с тандемным повторением LPL, созданный с использованием двух мономеров LPL, соединенных восьми аминокислотным линкером, был активен, и короткий линкер будет ограничивать этот вариант конформацией голова к хвосту ¹⁷. Таким образом, широко распространено мнение, что N-концевой каталитический домен одного мономера LPL контактирует с C-концевым доменом другого мономера LPL. Следующая задача — получить молекулярное понимание границы раздела между этими двумя мономерами. Хотя было идентифицировано много миссенс-мутаций, негативно влияющих на активность LPL, фолдинг, димеризация и активность LPL тесно связаны, что делает трудным окончательно показать, что отдельные мутации влияют на интерфейс димеров ¹⁸.Напр., Биохимическая характеристика миссенс мутаций LPL, идентифицированных у пациентов с семейным дефицитом LPL, показала, что большинство из них никогда не складывается в стабильную, нативную конформацию мономера и, следовательно, не может образовывать димеры ¹⁹.

Понимание интерфейса димера LPL может пролить свет на причины, по которым некоторые мутации LPL приводят к потере функции, а также может поддержать усилия по стабилизации LPL для использования в генной терапии или заместительной терапии белков. Однако в настоящее время нет экспериментально полученной структуры LPL.Одна из основных проблем при использовании традиционных биофизических методов для изучения LPL состоит в том, что LPL подвергается обширным посттрансляционным модификациям. LPL гликозилирован и содержит десять цистеинов, которые образуют пять дисульфидных связей. Кроме того, LPL требует взаимодействия с фактором созревания липазы 1 (LMF1), который способствует укладке LPL внутри эндоплазматического ретикулума ^{20, 21}. Эти требования ограничивают экспрессию LPL системами млекопитающих. Очистка из культуры клеток млекопитающих дает низкие урожаи, но это единственный способ изучить соответствующие мутации LPL.Кроме того, достижение высоких концентраций белка LPL крупного рогатого скота или человека, необходимых для рентгеновской кристаллографии, ЯМР, аналитического ультрацентрифугирования и калориметрии изотермического титрования, является сложной задачей, что ограничивает использование этих методов для понимания взаимосвязей LPL структура-функция и взаимодействия LPL с регуляторными факторами. .

Одномолекулярные методы обеспечивают новый подход к характеристике LPL за счет экспоненциального уменьшения количества LPL, необходимого для проведения биофизических измерений.Например, поверхностный плазмонный резонанс, который использовался для изучения взаимодействий LPL ^{22, 23}, требует в несколько сотен раз больше белка на образец, чем эксперименты с одной молекулой. Ранее мы использовали атомно-силовую микроскопию (АСМ), чтобы показать связывание LPL и ANGPTL4 в определенном комплексе ²⁴, но АСМ обеспечивает только моментальный снимок связывания и не может предоставить информацию о динамике или структурной информации с высоким разрешением. Таким образом, мы обратились к резонансному переносу энергии Фёрстера одиночной молекулы (smFRET) в качестве альтернативного подхода для измерения связывания LPL / партнера и динамики.smFRET позволяет оценивать расстояния в отдельных белках или белковых комплексах, которые были помечены двумя разными флуорофорами (донором и акцептором), которые могут передавать энергию за счет диполь-дипольных взаимодействий

smFRET дает представление о взаимодействиях белков, которые не могут быть получены из объемных измерений, которые средние по ансамблю доходности. smFRET — это хорошо зарекомендовавший себя метод изучения динамики индивидуальных взаимодействий белок-ДНК ^25–28 и взаимодействий белок-белок ²⁵.Используя smFRET, наблюдались измерения динамики в реальном времени, происходящие в отдельных белках в ответ на взаимодействия связывания ²⁹. smFRET также особенно полезен для идентификации и измерения времени жизни различных комплексов и переходных состояний ²⁶, а также конформационных изменений ^{30, 31}. Здесь мы демонстрируем использование smFRET для изучения взаимосвязей между структурой LPL. Измерения FRET могут генерировать экспериментальные ограничения для поддержки вычислительных моделей белковых структур, и мы применяем эту технику для получения информации о новых моделях димерной структуры LPL ^32–34.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярное клонирование

Человеческий LPL был клонирован в pCDNA5 / FRT / TO (ThermoFisher Scientific) с добавлением либо 6-кратной полигистидиновой метки, либо метки V5 (GKPIPNPLLGLDST на С-конце). Отдельные цистеины в положениях S12, S36, S63, S97, S193, V224, S240, S251, S259, S323, S346 и S384 вводили с использованием сайт-направленного мутагенеза Quickchange.

Экспрессия и очистка белка

LPL

LPL временно или стабильно трансфицировали в клетки FLIP-IN HEK 293 FRT (ThermoFisher Scientific) с использованием Fugene 6.Экспрессию и очистку LPL проводили, как описано ранее ³⁵. Для удаления продуктов расщепления потребовалась промывка ≥ 75 объемов колонки. Белок концентрировали, разделяли на аликвоты, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до использования или немедленной маркировки.

Приготовление флуоресцентного цистеина, меченного LPL

Однократные цистеиновые мутанты LPL были очищены (конечный буферный состав — 1,5 М NaCl, 10% глицерин, 20 мМ Бис-Трис pH 6,5) и инкубирован с приблизительно 10-кратным избытком Alexa Fluor. ® Малеимидные красители (Invitrogen).Метку добавляли по каплям к раствору белка с последующим осторожным перемешиванием. Реакции давали возможность продолжаться в светозащитных пробирках в течение 45 минут при 4 ° C или на льду. Для образцов, в которых использовался биотинилированный LPL, затем добавляли 1-2 молярный избыток сложного эфира биотин-N-гидроксисукцинимида (Sigma) и реакции позволяли протекать на льду еще 10 минут. И для биотинилированных, и для небиотинилированных образцов LPL затем разбавляли до менее 500 мМ NaCl 20 мМ бис-трис pH 6,5 и повторно очищали на высокоэффективной колонке HiTrap с гепарин-сефарозой (GE Healthcare Life Sciences) для удаления избытка биотина и / или этикетка.Избыточная метка протекала через колонку с гепарином, тогда как очищенный, меченый LPL связывался и элюировался нормально. Альтернативно, за маркировкой может следовать удаление избытка красителя с использованием двух тандемных колонок для обессоливания 7 кДа Zebra (ThermoFisher Scientific). Образцы LPL разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C до использования. Если образцы концентрировались, образцы фильтровали шприцем через фильтр PDVF 0,2 мкм для удаления агрегатов.

Анализы активности LPL

Для определения активности LPL в кондиционированной среде плазмиды, несущие WT или мутантные варианты LPL, временно трансфицировали в клетки HEK293.LPL высвобождался с поверхности клеток посредством добавления гепарина, среда собиралась и секретируемая в среде LPL анализировалась на активность с использованием 10 мкМ DGGR, по существу, как описано ранее ³⁵.

Для определения активности LPL на поверхности 96-луночный планшет с черной стороной и прозрачным дном функционализировали путем кратковременной инкубации с биотинилированным бычьим сывороточным альбумином (Sigma, 1 мг / мл, 5 минут), трижды промывали PBS. , инкубировали со стрептавидином (Invitrogen, 0,1 мг / мл, 20 минут) и снова промывали PBS.Планшеты оставались на льду с PBS в лунках до тех пор, пока эксперимент не был готов к продолжению. Затем лунки обрабатывали следующим образом: A) без LPL (буфер), B) биотинилированный бычий LPL (~ 150 нМ, 5 минут инкубации), C) гепарин-биотин (Sigma, 1 мг / мл, 5 минут) + бычий LPL ( 150 нМ, 5 минут). Лунки еще трижды промывали PBS и добавляли субстрат (150 мМ NaCl, 0,4% Triton-X, 20 мМ Tris 8,0, 14 мкМ DGGR). Лунки возбуждали при 529 нм с отсечкой 590 нм и считывали эмиссию при 600 нм на планшет-ридере SpectaMax 5.

Активность флуоресцентно меченого LPL

Очищенный LPL ^S384C был модифицирован, как описано выше, с помощью красителя Alexa Fluor®647 и обессолен через обессоливающую колонку Zebra 7 кДа (ThermoFisher Scientific). Затем количественно определяли белок. Активность равных концентраций меченого и немеченого LPL ^S384C измеряли, как описано ранее ²⁴, с добавлением 1 мМ дезоксихолата.

Подготовка слайдов для микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF)

Самодельные кварцевые слайды готовили, как описано ранее. ³⁶ с 5-минутной эпоксидной смолой (скобы), использованной для герметизации краев слайда.Поверхность предметных стекол предварительно функционализировали путем кратковременной инкубации с биотинилированным бычьим сывороточным альбумином (Sigma, 1 мг / мл, 5 минут), промывки и последующей инкубации со стрептавидином (Invitrogen, 0,1 мг / мл, 20 минут) и промывки. . Для слайдов, использующих прикрепление гепарина, биотин-гепарин (Sigma) либо добавляли непосредственно к слайдам, либо предварительно инкубировали с LPL перед добавлением. Непосредственно перед сбором данных LPL наносили на поверхность предметного стекла в буфере A (20 мМ Трис, 300 мМ хлорид натрия, 5% глицерин, 1 мМ дезоксихолат, pH 7.5) и инкубировали 5 минут. Затем несвязанный LPL промывали буфером для визуализации (буфер A с добавлением ~ 50 мкМ циклооктатетраена (Sigma), гаситель триплетного состояния для уменьшения мерцания флуорофора.) Лазерный микроскоп TIRF. Возбуждение флуорофора достигалось с помощью постоянного освещения лазерами 532 нм и 638 нм. Эмиссию флуорофора собирали с помощью объектива с водной иммерсией 1,2 N.A. с 60-кратным погружением в воду, и изображение разделяли с использованием оптического делителя DualView (Chroma), оснащенного дихроичным зеркалом 645 нм.Эмиссионные сигналы проходят через оптические фильтры перед обнаружением камерой emCCD Cascade 512 (Photometrics): полосовым фильтром 585/70 (Chroma) для излучения Alexa Fluor®555 и длиннопроходным фильтром 655 нм (Chroma) для Alexa Fluor®647. выбросы. Фильмы продолжительностью около 850 секунд были собраны с частотой кадров 100 мс с использованием собственного программного обеспечения.

Взаимодействия LPL-LPL, визуализированные с помощью smFRET с использованием TIRF-микроскопии

Эксперименты проводили, как описано выше, с использованием режима связывания биотин-гепарин.Молекулы LPL флуоресцентно метили, как описано выше, по конкретным остаткам цистеина либо на крышке, либо вне ее и смешивали вместе непосредственно перед визуализацией. Затем остаточный LPL был смыт с предметных стекол. В некоторых показанных экспериментах буфер без поглотителей кислорода использовался для ускорения отбеливания флуорофора. Во время захвата изображения только красный (акцепторный) лазер был включен для первых 10 кадров и снова после 800 ^{-го кадра}. На кадрах 10–800 был включен только зеленый лазер.

Анализ данных smFRET

Интенсивности флуоресценции отдельных молекул были извлечены из фильмов с использованием собственного программного обеспечения, как описано ранее. ³⁷. Следы анализировались только в том случае, если интенсивность флуоресценции LPL присутствовала в начале фильма. Временные кривые с интенсивностями выше или ниже пороговых интенсивностей (определенных эмпирически) для одиночных молекул были исключены из дальнейшего анализа. Затем оставшиеся следы интенсивности были сглажены с помощью нелинейного фильтра Чанга-Кеннеди, который сохраняет края ^{38, 39}.LPL-LPL-взаимодействия анализировали и рассчитывали средние значения FRET связанного комплекса.

Подготовка образцов и жидкостная хроматография Nano-Flow Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ЖХ-МС / МС)

Подготовка всех образцов белков и масс-спектрометрия проводились в центре протеомики Duke. После разделения 1D-SDS-PAGE интересующую область молекулярной массы вырезали и подвергали расщеплению трипсином в геле с алкилированием с использованием 10 мМ йодацетамида в течение 30 мин при комнатной температуре, но без восстановления для уменьшения перетасовки дисульфидов во время переваривания ⁴⁰ .Кроме того, вместо 50 мМ бикарбоната аммония использовали 10 мМ Трис pH 5–6. Экстрагированные пептиды лиофилизировали досуха и затем ресуспендировали в 20 мкл 2% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты перед анализом ЖХ-МС / МС. Хроматографическое разделение выполняли на Waters NanoAcquity UPLC, оборудованном 1,7 мкм BEh230 C ₁₈ 75 мкм I.D. Обращенно-фазовая колонка × 250 мм. Подвижная фаза состояла из (A) 0,1% муравьиной кислоты в воде и (B) 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. После инъекции 4 мкл пептиды улавливали в течение 5 мин на 5 мкм Symmetry C ₁₈ 180 мкм I.Колонка D. × 20 мм при 5 мкл / мин в 99,9% A. Затем аналитическую колонку переключали на линию и выполняли линейный градиент элюирования от 5% B до 40% B в течение 90 мин при 400 нл / мин. Аналитическая колонка была соединена с эмиттером из плавленого кварца PicoTip (New Objective, Кембридж, Массачусетс) с отверстием на наконечнике 10 мкм и соединена с масс-спектрометром Thermo QExactive Plus с точным тандемным масс-спектрометром высокого разрешения через интерфейс электрораспыления. Прибор работал в режиме сбора данных, зависящем от данных, с MS-сканированием прекурсора от m / z 375–1600, и десять самых распространенных ионов-прекурсоров подвергались фрагментации MS / MS.Для всех экспериментов использовались настройки энергии CID, зависящие от заряда, и 20-секундное динамическое исключение использовалось для ранее фрагментированных ионов-предшественников.

Качественная идентификация и идентификация сшитых пептидов по необработанным данным ЖХ-МС / МС

Для идентификации сшитых видов был создан дистиллятор Mascot. Файлы MGF были отправлены в MassMatrix (v 2.4.2, февраль 2012 г.) для поиска в базе данных прямого / обратного направления, содержащей только интересующие белки ⁴¹. Допуски поиска составляли 5 ppm для ионов-предшественников и 0.02 Да для ионов продукта с использованием специфичности трипсина с двумя пропущенными расщеплениями. Карбамидометилирование (+57,0214 Да на C) было установлено как фиксированная модификация, тогда как окисление (+15,9949 Да на M) и дезамидирование (+0,984016 Да на NQ) считались изменяемыми модификациями. Была включена опция «расширенного поиска», чтобы обеспечить меж- или внутрипептидное сшивание дисульфидом (-2,015650 Да). Соответствие сшитого пептида в MassMatrix рассматривалось только в том случае, если 1) пороги оценки пептидов были выше, чем требуется для вероятности совпадения меньше, чем значение p <0.05 против обратной последовательности белка и 2) по меньшей мере два спектральных совпадения пептидов были сопоставлены с одними и теми же предсказанными сшитыми видами ⁴¹. Все предполагаемые масс-спектры сшитых пептидов проверяли на качество вручную.

Моделирование LPL с использованием Rosetta Macromolecular Suite

Для создания моделей димера LPL были предприняты два альтернативных подхода. Наша первая цель состояла в том, чтобы регенерировать исходную модель гомологии LPL, которая была основана на кристаллографическом димере, наблюдаемом для липазы поджелудочной железы лошади.В этом первом подходе кристаллическую структуру липазы поджелудочной железы лошади (HPL, PDB ID: 1hpl) использовали в качестве шаблона моделирования гомологии для димера LPL. Несмотря на то, что HPL является функциональным мономером, он кристаллизуется как димер с обширными контактами между мономерами ¹². Вторая кристаллическая структура PL, это комплекс липаза / колипаза поджелудочной железы свиньи (PDB ID: 1eth), имеет две комплексные молекулы в асимметричной единице ⁴². Однако 1hpl является единственным кристаллографическим димером PL, захваченным в конформации голова-хвост.Пакет сравнительного моделирования в Rosetta, RosettaCM, был использован для переноса последовательности LPL на «димер» HPL и затем уточнения внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий ⁴³. 10 структур с наименьшей оценкой из 10 000 независимых траекторий моделей гомологии каждая служила стартовой структурой для 5000 независимых траекторий стыковки и уточнения полного атома, в результате чего было создано 50 000 моделей. Наконец, была выбрана единственная модель, основанная на полной энергии Розетты. Входные файлы и параметры командной строки для этого и других имитаций Rosetta включены в дополнительные материалы.

Наш второй подход к созданию моделей димера LPL был направлен на создание более разнообразного набора моделей и состоял из следующих этапов: (1) моделирование гомологии для прогнозирования структуры мономера LPL, (2) глобальное моделирование с низким разрешением. стыковка со свободными ограничениями расстояния на основе данных FRET и предыдущих исследований структуры / активности, (3) фильтрация на основе биологических факторов, (4) кластеризация для определения уникальных решений стыковки, (5) локальное уточнение для минимизации энергии контактов на границе димера, (6) и фильтрация на основе рассчитанных энергий связи.Чтобы идентифицировать шаблоны для моделирования гомологии мономера LPL, базу данных PDB запросили с помощью бласт-анализа с последовательностью липопротеин липазы (остатки 28–475). Структуры липаз поджелудочной железы крысы (PDB ID: 1bu8), собаки (1rp1) и человека (2ppl) были выбраны в качестве матриц для мономерного LPL в конформации закрытого века. Соответственно, две структуры липаз поджелудочной железы человека (PDB ID: 1lpa и 1lpb) и свиньи (1eth) были выбраны в качестве матриц для мономерных LPL в конформации открытого века. 10 000 моделей гомологии были созданы с использованием RosettaCM, и 20 моделей с наименьшей оценкой были выбраны в качестве отправных точек для моделирования стыковки.Во время моделирования гомологии дисульфидные связи фиксировали в парах, наблюдаемых в данных ЖХ-МС / МС. Дисульфидные связи нанесены на карту, где они пронумерованы для LPL крупного рогатого скота (Bovine — 2 = human). Моделирование стыковки проводилось только для моделей гомологии с закрытой крышкой.

Схема дисульфидных связей LPL

A и B. Два возможных расположения дисульфидных связей в LPL являются последовательными и непоследовательными, соответственно. Нумерация ведется на бычий LPL (который смещен на 2 остатка по сравнению с человеческим LPL, используемым в моделях), начиная с отщепления сигнального пептида. C. Вверху: Трипептид LPL, который может быть результатом только последовательного расположения дисульфидных связей. Отмечены возможные позиции фрагментации каждой пептидной цепи (A — нижняя цепь, B — средняя, C — верхняя). Положение дисульфидных связей показано серыми столбиками. Внизу: Пример МС / МС спектров этого трипептида. Положение родительского пептида и фрагмент цепи B, разделенный между двумя его цистеинами, заключен в рамку. D. Тепловая карта всех потенциальных дисульфидных связей из MassMatrix показывает, что 4 из 5 дисульфидов в LPL были идентифицированы с высокой достоверностью ⁶².SP указывает на цистеин в сигнальном пептиде, которого не было, потому что он был отщеплен. Уверенность в идентификации каждой дисульфидной связи обозначена цветовым кодом, показанным под тепловой картой.

Глобальная стыковка (т.е. партнеры начинают моделирование со случайными ориентациями относительно друг друга) была выполнена в режиме центроида, который представляет каждую боковую цепь аминокислоты с одной точкой ⁴⁴. Симметрия C2 соблюдалась на всех траекториях стыковки. Были выполнены два отдельных набора глобального моделирования стыковки с альтернативными наборами ограничений.Первый набор ограничений (только FRET) был основан на расстояниях FRET, измеренных между двумя флуорофорами по остатку 224 и между двумя флуорофорами по остатку 384. Поскольку боковые цепи не присутствовали на этом этапе моделирования, ограничения были применены к атомам Cα. каждого остатка. Чтобы учесть переменные положения, которые красители могут принимать относительно атомов Cα, для моделирования ограничений была использована гармоническая функция с большим стандартным отклонением, 20 Å. Второй набор ограничений (FRET plus) добавил одно дополнительное ограничение расстояния, основанное на предыдущих исследованиях структуры / деятельности с LPL.Ранее было показано, что октасахарид гепарина был наименьшей длиной гепарина, который мог связываться с димером LPL, предполагая, что сайты связывания гепарина на двух цепях LPL разделены ~ 38 Å ^{45, 46}. Остатки, идентифицированные как важные для связывания гепарина (279, 280, 282, 296, 297, 403, 407, 413 и 414), были ограничены таким образом, чтобы по крайней мере три из этих остатков находились в пределах 38 Å от одного и того же остатка на противоположной цепи ^{47 , 48}. Для каждого набора ограничений было выполнено 10 000 глобальных траекторий стыковки для каждой из 20 выбранных моделей гомологии в качестве входных структур, что дало в общей сложности 200 000 стыкованных решений.Полученные приманки были отфильтрованы для удаления моделей, в которых оценка ограничения («atom_pair_constraints») из ограничений FRET и гепарина была больше 1 (ограничение гепарина использовалось только в качестве фильтра для моделей, созданных с ограничением гепарина), с последующей фильтрацией с оценкой планарности. Оценка планарности была построена так, чтобы отдавать предпочтение моделям, которые размещают крышки и кластеры триптофана в одной плоскости, так что они хорошо позиционируются для взаимодействия с липопротеидным субстратом. Используя репрезентативные остатки от каждого из четырех структурных элементов (остаток 225 в обеих цепях для крышек и остаток 393 в обеих цепях для кластеров триптофана), функция оценки планарности оценивает, насколько далеко каждый остаток (атомы Cα) находится от плоскости, построенной с помощью остальные три остатка и берет минимум из четырех измеренных расстояний.Полученные ловушки были сгруппированы и отфильтрованы по интерфейсным взаимодействиям («interchain_contact» <= -10). Вышеупомянутое дало 128 уникальных начальных ориентаций стыковки для моделирования ограничений только FRET и 53 для моделирования FRET plus, что дало в общей сложности 181 начальную модель для полного уточнения атома.

Локальное уточнение происходило с использованием полной стыковки атомов с возмущениями твердого тела и переупаковкой боковой цепи с последующими двумя раундами протокола релаксации Rosetta. Протокол Relax циклически переключает между минимизацией на основе градиента углов скручивания основной и боковой цепи и отбором образцов боковой цепи на основе ротамера.Были использованы более жесткие ограничения для двух расстояний FRET, ограничивающие соответствующие атомы Cα с использованием гармонической функции со стандартным отклонением 10 Å. Каждая из начальных 181 модели использовалась в качестве начальной позы для 500 независимых траекторий уточнения, в результате чего было получено 64 000 моделей полного атома для ограничений FRET only и 26 500 для FRET plus соответственно. Энергии связи были рассчитаны для моделей полного атома путем вычитания энергии комплекса из энергии отделенного димера.Наконец, 1000 лучших моделей по энергии связи были отфильтрованы и отсортированы по общему баллу Rosetta (функция оценки Rosetta по умолчанию REF ^15, используется на протяжении всего процесса моделирования) ^{49, 50}. График, показывающий общую энергию в зависимости от среднеквадратичного значения для верхних моделей, показан на дополнительном рисунке 1. Модель с наименьшим энергопотреблением была выбрана в качестве окончательной модели для каждого набора симуляций ограничений. Блок-схема, описывающая моделирование, представлена на дополнительном рисунке 2.

Для проверки совместимости окончательных моделей гомодимеров с открытием крышки мы использовали нашу модель гомологии с наименьшей энергией в конформации открытой крышки и наложили ее на каждый из мономеров при окончательном закрытии. крышки модели, таким образом создавая стартовую структуру предполагаемого димера в открытой конформации.Наконец, структура была уточнена с помощью протокола Rosetta Relax с ограничениями, предназначенными для удержания модели около ее начального состояния («координатные ограничения»).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение исходной модели димера LPL

Поскольку координаты атомов не были доступны для структуры димера LPL на основе кристаллографического димера PL, мы сначала регенерировали эту модель как исходную модель для сравнения с последующими моделями. Используя пакет сравнительного моделирования в Rosetta, мы нарезали последовательность LPL на кристаллографический димер PL и использовали упаковку боковой цепи на основе ротамера в сочетании с минимизацией основной цепи для оптимизации энергии структуры.Большинство, но не все функции исходной модели согласуются с нашим текущим пониманием функции LPL. Как показано на фиг.2, крышки обоих димерных партнеров ориентированы в одной и той же плоскости (представляющей большой липопротеиновый субстрат, такой как хиломикрон), поскольку мутационный анализ предполагает, что оба димерных партнера, вероятно, будут активны на субстрате в одно и то же время ¹¹. Далее, C-концевой триптофановый кластер одного мономера участвует в функции N-концевого каталитического домена своего димерного партнера ¹¹.В исходной модели триптофановый кластер (синий) одного мономера проксимален и в аналогичной плоскости крышке его димерного партнера. Более того, в LPL есть мотив распознавания С-конца для его якоря, GPHIBPI ^{51, 52}. Исходная модель имеет мотив взаимодействия GPIHBP1 (черный) на противоположной стороне димера LPL, чем крышка, так что LPL зажат между его якорем и субстратом, как и ожидалось.

Исходная модель димера LPL

Вид сверху, сбоку и снизу димера LPL, смоделированного на кристаллографическом димере из структуры PL (PDB ID 1HPL).Эта модель позволяет крышке (синяя) контактировать с субстратом, а GPIHBP1 (черный) — прикреплять LPL к эндотелию капилляров, помещая LPL между этими поверхностями. Однако большая часть опубликованного сайта связывания APOCII (красный) оказывается закрытой димерным интерфейсом. Более того, две мутации (R75A и G188E, пурпурный), которые секретируются, но не димеризуются, по-видимому, не вступают в димеризационные контакты. На нижнем изображении показаны остатки, которые, как известно, играют роль в связывании гепарина (желтый), и указаны расстояния между некоторыми из этих остатков.

И наоборот, некоторые особенности исходной модели трудно согласовать с современными знаниями биологии LPL. Например, сайт связывания активатора LPL, APOCII, (показан красным) обращен к границе раздела димера и не экспонируется на поверхности LPL ⁶. Кроме того, два предполагаемых мутанта димеризации, R75S и G188E (показаны фиолетовым), не локализованы на границе димеризации в исходной модели ^{53, 54}. Сообщается, что эти мутации LPL приводят к секретируемым LPL (что указывает на то, что он достаточно свернут, чтобы пройти контроль качества ER), который элюируется в виде мономера, а не димера, из колонки с гепарином ^{53, 54}.Как отмечено в исходной модели LPL, крышки димерных партнеров LPL конфликтуют, когда они моделируются на основе конформации открытых век панкреатической липазой (показанной на Supplemental Figure 3) ^{5, 10}.

Другая проблемная особенность оригинальной модели проистекает из исследований поверхностного плазмонного резонанса взаимодействия LPL-гепарин, которые показали, что окта- и декасахариды гепарина могут связываться с димерами LPL ⁴⁶. Поскольку гепарин связывал мономеры LPL гораздо менее прочно, а соотношение декасахаридов гепарина: димеры LPL 1: 1 было достаточным для максимальной стабилизации LPL, авторы пришли к выводу, что один окта- или декасахарид гепарина может связываться с обоими димерами-партнерами LPL одновременно ⁴⁶.Длина декасахарида гепарина составляет приблизительно 41,5 Å, но в исходной модели димера расстояние между C-концевыми сайтами связывания гепарина в двух димерных партнерах LPL (измеренное в различных точках между K403 – K414) составляло 50–75 Å. ^{45, 47, 48}. Таким образом, мы решили проверить и улучшить исходную модель, используя экспериментально полученные ограничения.

Создание ограничений расстояния smFRET между партнерами-димерами LPL

Для выполнения измерений smFRET на LPL мы сначала разработали методы прикрепления активного LPL к поверхности слайдов для визуализации TIRF.Способы прикрепления макромолекул к предметным стеклам включают специфичные для белков связывающие реагенты, антитела, липосомы и биотиновые связи. Каждый из этих методов может быть применен к исследованиям LPL, за исключением липосом. Липосомы позволяют избежать необходимости использовать белковые связи для прикрепления белков к предметным стеклам, но не могут быть стратегическими для использования с активной липазой. Мы разработали два подхода для прикрепления LPL к предметным стеклам, оба с использованием биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (BSA), связанного со стрептавидином. БСА блокирует неспецифическое связывание белков-мишеней, а биотин-стрепавидин обеспечивает средство ориентирования биотинилированных белков или конъюгатов на поверхности предметных стекол.В одном подходе мы воспользовались сильным сродством LPL к гепарину и использовали конъюгированный с биотином гепарин для связывания LPL с функционализированными слайдами (правая панель). Гепарин связывается с C-концом LPL и, как было показано, стабилизирует LPL от инактивации ⁵⁵. Во втором подходе мы используем LPL, который непосредственно биотинилируется и позволяет белку связывать слайд, функционализированный BSA-биотин-стрепавидином (левая панель). Биотинилирование LPL оставляет его сайт связывания с гепарином свободным и, таким образом, может быть особенно полезным для мониторинга взаимодействий LPL, которые используют сайт связывания LPL с гепарином.

Присоединение активного LPL к слайду двумя способами

A) Кварцевые слайды были функционализированы для прикрепления LPL с помощью BSA-биотина и стрептавидина. LPL добавляли либо после конъюгирования с биотином (слева), либо после добавления на предметное стекло биотинилированного гепарина ⁶⁷. LPL активно связывается с гепарином. B) LPL остается активным на функционализированной поверхности. LPL связывали с 96-луночным планшетом, покрытым BSA-биотином-стрептавидином. Активность LPL, остающегося в лунках после промывки, считывали после добавления смеси субстратов, содержащей DGGR.И биотинилированный LPL, и LPL, связанный с поверхностью, функционализированной гепарин-биотином, были активными.

Как биотинилированный LPL, так и конъюгат гепарин-биотин являются подходящими методами для прикрепления активного LPL к предметным стеклам, поскольку LPL сохраняет активность в обоих условиях (). Однако сложный эфир биотина может ковалентно реагировать с любым доступным амином. Таким образом, чрезмерное биотинилирование LPL снижает его активность, и поэтому очень небольшой молярный избыток биотина по отношению к LPL, наряду с коротким периодом инкубации, необходим для поддержания активности LPL, как показано ().Конъюгация гепарин-биотин не имеет этого нежелательного эффекта. Фактически, гепарин стабилизирует LPL и представляет собой более физиологический способ прикрепления ⁵⁵. Соответственно, мы используем метод гепарина для мониторинга взаимодействий LPL-LPL и подход биотина при мониторинге взаимодействий связывания, для которых может потребоваться сайт связывания LPL с гепарином. Примечательно, что оба метода можно использовать с LPL, очищенным из молока, плазмы или культуры ткани.

Специфическая маркировка LPL флуорофорами

Установив, что активный LPL может быть прикреплен к слайдам, мы определили методы добавления флуорофоров в различные места на LPL.Мы специально пометили LPL, используя малеимидные флуорофоры, которые реагируют со свободными цистеинами. Мы воспользовались тем фактом, что, хотя LPL содержит десять остатков цистеина, они включены в пять критических дисульфидных связей, не оставляя нативных цистеинов, доступных для мечения. Следовательно, мы разработали специальные сайты маркировки, введя дополнительные цистеины. Мы добавили дополнительный остаток цистеина либо на крышку, которая закрывает активный сайт, либо в другое место на LPL (верхний рисунок). Чтобы добавить остатки цистеина, не связанные с крышкой, мы нацелены на остатки серина, чтобы минимизировать возможные структурные и функциональные изменения.Мы картировали 40 сериновых остатков LPL на компьютерной модели мономера LPL, чтобы идентифицировать остатки серина в различных областях (около крышки, С-конца и N-конца, как показано на рисунке). Всего было выбрано двенадцать позиций для мутации цистеина. Все мутанты из серина в цистеин, за исключением LPL ^S251C, секретировались, как показано в Вестерн-блоттинге на панели среды в. Сравнение липазной активности мутантов дикого типа и мутантов C → S из кондиционированных сред показало, что многие из мутантов проявляют активность, аналогичную LPL дикого типа ().Как и ожидалось, LPL с введенным цистеином легко метятся малеимидным красителем Alexa Fluor®647, тогда как LPL дикого типа не метятся в тех же условиях (верхняя панель). Кроме того, мы показываем, что мечение малеимидом не препятствует активности репрезентативного очищенного мутанта LPL ^S384C ().

Стратегии флуоресцентной маркировки LPL

A) Все остатки серина на LPL окрашены в голубой цвет, а три остатка, используемые для измерений FRET в этой работе (36, 224 и 384), окрашены в красный цвет. B) Мутанты LPL серина к цистеину с меткой V5 временно экспрессировали в клетках HEK293, и среду (секретируемую фракцию) тестировали на активность (верхняя панель). Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение для трех измерений. Вестерн-блот показывает экспрессию белка в среде и фракциях лизата. GAPDH был контролем загрузки лизата. C) LPL дикого типа и LPL ^S97C метили с помощью Alexa Fluor®647, разрешали с помощью SDS-PAGE и визуализировали флуоресценцию.Вестерн-блоттинг против LPL (вторая панель, α – 4-1a) показывает общий белок. D) Очищенный LPL ^S384C сохраняет активность при метке малеимидным красителем Alexa Fluor®647 (пунктирная линия против сплошной линии).

Использование межмолекулярного FRET для измерения расстояний между субъединицами димера

Имея несколько активных вариантов LPL, помеченных в уникальных положениях, мы решили использовать smFRET для оценки межмолекулярных расстояний между этими положениями. LPL представляет собой гомодимер, в котором субъединицы претерпевают быстрый обмен ⁵⁶.Такой быстрый обмен гарантирует, что при смешивании димеров LPL, меченных разными флуорофорами, они образуют димеры LPL, содержащие оба флуорофора. Эффективность FRET между по-разному меченными мономерами в димере LPL может затем использоваться для оценки расстояний между красителями ^{57, 58,}. Расстояние Ферстера (R ₀, или расстояние, на котором передается половина энергии) составляет примерно 51 ангстрем для используемых здесь флуорофоров (Alexa Fluor®647 и Alexa Fluor®555) ⁵⁹.Мы протестировали несколько различных попарных комбинаций флуоресцентно меченых димеров LPL, но не все комбинации дали пригодные для использования данные. Однако распределения smFRET были успешно определены для пар от V224C до V224C, от S384C до S384C и от S36C до S384C, и эти значения FRET использовались для оценки расстояний между парами.

Для контроля FRET использовалась автоматическая система чередования лазеров для переключения лазеров (см. Методы). Следы времени для отдельных молекул были извлечены и проанализированы.Затем следы были отсортированы вручную, и были проанализированы только события FRET, в которых участвовал один акцептор и один донор, о чем свидетельствуют пошаговые изменения интенсивности до нуля в результате мерцания или обесцвечивания. Примечательно, что если бы эти измерения проводились в большом количестве, значения FRET были бы искусственно заниженными, потому что популяции без акцептора испускали бы высокую флуоресценцию донора и, таким образом, уменьшали бы видимый FRET. Чтобы определить расстояние между каждой парой, были собраны сотни отдельных измерений FRET и нанесены на гистограмму в виде совокупности.На основе гауссовой подгонки определяли среднее значение FRET для каждой мутантной пары, а затем рассчитывали расстояние на основе значения R ₀, равного 51 Å. Подробное обсуждение методов анализа можно найти в предыдущей литературе ^{29, 60}.

показывает схемы положений каждой из трех пар FRET, тестируемых на исходной модели димера LPL. Ниже моделей, в примерных данных, показана интенсивность флуоресценции и кривые FRET для каждой пары FRET. Эти данные показывают динамику белка, который smFRET может захватывать.Например, первая панель показывает взаимодействие между двумя крышками (LPL ^V224C с одним мономером, меченным акцептором (Alexa Fluor®647), и одним мономером, меченным донором (Alexa Fluor®555)). Осмотр следов показывает, что примерно через 4 секунды наблюдается небольшое уменьшение FRET, что свидетельствует о некоторой динамике век (первая панель). Более сильные изменения FRET, указывающие на большее изменение конформации белка, показаны на третьей панели. На этой панели акцептор, обозначенный LPL ^S384C, объединен с донором, обозначенным LPL ^S36C.Эта кривая показывает начальное значение FRET около 1,0, когда лазер включается в начале кривой, затем происходит изменение конформации примерно через 3 секунды, в результате чего FRET падает чуть ниже 0,4, затем другое изменение происходит примерно через 6 секунд и FRET увеличивается до чуть выше 0,4. Помимо конформационных изменений, все показанные следы также демонстрируют потерю FRET при обесцвечивании донорных флуорофоров.

LPL-LPL Межмолекулярный FRET для измерения расстояний

A) Исходная модель димера используется для отображения положения флуорофора на LPL. B) Пример кривых времени интенсивности флуоресценции для димеров LPL с двойной меткой, связанных с поверхностью. Следы показывают как динамику белка, так и события обесцвечивания доноров и акцепторов. C) значения FRET, соответствующие временным графикам в B. D) Гистограммы, показывающие распределение значений FRET.

Гистограмма значений FRET для LPL ^V224C — LPL ^V224C (первая панель) показывает один пик, указывающий на одно основное конформационное состояние со средней эффективностью FRET, равной 0.62. Это значение было использовано для расчета расстояния между двумя флуорофорами (47 Å), которое используется в нашей вычислительной модели димера. Напротив, гистограммы эффективности FRET между LPL ^S384C и LPL ^S384C, а также между LPL ^S384C и LPL ^S36C показывают один главный и один второстепенный пик, что указывает на то, что по крайней мере одна позиция принимает два конформационных состояния. . Для моделирования мы использовали расстояния, полученные от наиболее населенного основного пика (средняя эффективность FRET равна 0.43 для 384-384 и 0,50 для 384-36). Кроме того, мы определили эффективность FRET при половине максимальной амплитуды и рассчитали связанные с ними расстояния, чтобы обеспечить диапазон расстояний, который можно использовать для анализа молекулярных моделей димеров LPL (диапазоны указаны в).

Таблица 1

4 9034 903 гепарин 903 гепарин / 903 гепарин Å Связывание с остатками на поверхности –433

Характеристика	Описание	Ссылка	Оригинальная модель	Только FRET	FRET plus
ApoCII Binding								Остатки на поверхности	Не на поверхности	На поверхности
Гепарин-связывающие остатки	R279, K280, R282, K296, R297, K403, R405, K407, K413, K414	9004 47, 48385	^{47, 48385}
Расстояние связывания гепарина	Один октамер / додекамер гепарина может связывать один димер LPL	⁴⁶

⁴⁵
Кратчайшее расстояние гепарина, Å	9 0385	Текущая работа	53.2	56,5	29,5
Триптофановый кластер	W390, W393, W394	^{11, 69}	На поверхности	На поверхности	На поверхности
⁵¹	На поверхности	На поверхности	На поверхности
Расположение головы к хвосту	Мономеры LPL, соединенные C и N линкером, являются активными.Смешанные мономеры (мутант каталитического сайта и мутант кластера триптофана) активны.	^{11, 17}	Удовлетворен	Удовлетворен	Удовлетворен
Димерные мутации	G188E и R75S секретируются, но проходят в виде мономеров на хроматографии на гепарине.	^{19, 53}	Ни на интерфейсе	Ни на интерфейсе	G188E, ни на R75S, на интерфейсе
Нативные дисульфидные связи	Остатки 27-40, 216-239, 264-275, 27 ⇔283, ⇔ 418⇔438 ⇔ Вся нумерация предназначена для LPL человека, +2 — для крупного рогатого скота.	Текущая работа, ⁶¹	Во всех моделях используется этот рисунок дисульфидного склеивания.	Этот рисунок дисульфидного склеивания используется во всех моделях.	Этот рисунок дисульфидного склеивания используется во всех моделях.
Полная энергия	Полная энергия Розетты	Текущая работа	−2496,04	−2646,15	−2635,13
Энергия связи	Разница между энергией несвязанного комплекса и энергии несвязанного.	Текущая работа	−65,465	−67,845	−43,206
Среднее значение 224-224 Cα Расстояние и диапазон при половине максимальной амплитуды, Å	47,1, 42–52	Текущая работа			46,4	49,6
Среднее 384-384 Cα Расстояние и диапазон на половине максимальной амплитуды, Å	53,6, 48–61	Текущая работа,	56,3	49,8		54,0	Среднее значение 36–384 Cα Расстояние и диапазон на половине максимальной амплитуды, Å	51, 43–59	Текущая работа	25.0	34,7	49,5
Модель RMSD по сравнению с FRET Расстояния, Å		Текущая работа	15,9	9,7	1,7

Дисульфид 9PLS Дисульфид 9PL остатки, спаренные в 5 дисульфидных связей. Исходя из структуры PL, в которой дисульфидные связи образуются последовательно, ожидается, что первый цистеин в LPL будет связываться со вторым и т.д., как показано в

¹³.Однако опубликованные данные о дисульфидном связывании бычьего LPL, полученного в результате секвенирования его триптических пептидов, предполагают непоследовательный характер дисульфидного связывания, в котором пятый цистеин (остаток 266 в бычьем LPL) образует дисульфид с восьмым (остаток 285), и шестой с седьмым (277 и 280 соответственно), как показано в ⁶¹. Чтобы определить правильное расположение дисульфидных связей для использования в нашей вычислительной модели LPL, мы выполнили масс-спектрометрический анализ дисульфидных связей в бычьем LPL.

Наши данные масс-спектрометрии показывают, что дисульфидные связи LPL являются последовательными (как на рисунке), сравнимыми с расположением дисульфидных связей в PL. Алгоритм поиска дисульфидов в MassMatrix был использован для идентификации интактных дисульфидных связей в пептидах, полученных в результате триптического гидролиза бычьего LPL ⁶². Было обнаружено несколько спектров трипептида с дисульфидной связью, содержащего остатки цистеина 266, 277, 280 и 285. Схема трипептида представлена на рис. Этот трипептид с дисульфидной связью не существовал бы, если бы расположение дисульфидной связи было непоследовательным.Примерный спектр в показывает пик m / z исходного трипептида (M +4, заключен в рамку). Кроме того, он показывает прямоугольный пик m / z (B _{Y2 ‘+}), являющийся результатом фрагментации B (средней) цепи между двумя ее цистеинами. Таблица фрагментации для этого спектра показана на дополнительном рисунке 4, а модель дисульфидных связей в LPL показана на дополнительном рисунке 5. Мы также идентифицировали многие другие неоспоримые дисульфидные связи в LPL. показывает тепловую карту из MassMatrix, которая указывает уверенность в идентификации каждой дисульфидной связи ⁶².

Применение экспериментально полученных данных к новым моделям димеров LPL

Решив схему дисульфидных связей в мономерах LPL и получив новые экспериментально полученные ограничения расстояния между партнерами димеров, мы решили улучшить модели димерной структуры LPL. . Чтобы создать новые модели димеров LPL, мы выполнили моделирование молекулярного докинга с ограничениями с помощью Rosetta. Два альтернативных набора моделей были созданы путем изменения ограничений, установленных во время стыковки.Первый набор ограничений (только FRET) состоял из двух производных от FRET ограничений расстояния, в частности, между двумя флуорофорами крышки в положении 224 в каждом димерном партнере и между двумя флуорофорами в позиции 384 в каждом димерном партнере (схематически показано на рис. панели 1–2). Мы исключили третье ограничение расстояния, полученное из FRET (36–384), из моделирования, чтобы использовать его позже для тестирования модели. Второй набор ограничений (FRET plus) включал два производных от FRET ограничения в сочетании с одним дополнительным ограничением: связывающие гепарин остатки в каждом мономере должны быть достаточно близкими, чтобы димер мог взаимодействовать с одной молекулой окта- или декасахарида гепарина ⁴⁶ .Глобальное моделирование стыковки было выполнено для определения уникальных ориентаций привязки, совместимых с указанными ограничениями. Блок-схема, показывающая процесс моделирования, включена в качестве дополнительного рисунка 1. Перед полным атомным уточнением модели были отфильтрованы с использованием показателя планарности. Оценка планарности (см. Методы) благоприятствовала размещению обеих крышек и кластеров триптофана на одной и той же поверхности димера, что позволяет одновременно задействовать липопротеиновый субстрат. Затем уникальные решения из предыдущего шага были дополнительно уточнены, и окончательная модель для каждого набора симуляций (только FRET и FRET плюс) была выбрана путем фильтрации 1000 лучших моделей по расчетной энергии связи и выбора модели с наименьшей полной энергией. для комплекса.

Особенности новых моделей димеров LPL

показывает виды сбоку, сверху и снизу моделей димеров, сгенерированных обоими наборами ограничений. В целом, модель с наивысшей оценкой, созданная на основе ограничений только FRET, похожа на исходную модель со среднеквадратичным отклонением 5 Å. Напротив, в модели FRET plus интерфейс димеризации не такой же, как интерфейс в исходной модели, и фактически он переключается таким образом, что внешняя поверхность в исходной модели является интерфейсом в новой модели.Энергии связи этих интерфейсов почти эквивалентны, как показано на рис. Этот переключатель интерфейса привязки имеет четыре важных последствия. Во-первых, он перемещает сайт связывания APOCII с поверхности раздела димеризации за пределы димера (показан красным). Во-вторых, он перемещает предполагаемый мутант димеризации G188E в интерфейс димеризации (см. Остатки, показанные фиолетовым цветом). В отличие от мутации G188E, предполагаемый мутант по димеру R75A не вступает в димеризационные контакты ни в одной из моделей.Затем крышки могут открываться без столкновения (см. Дополнительный рисунок 3). Наконец, связывающие гепарин остатки в модели FRET plus находятся в непосредственной близости и образуют борозду, которая кажется совместимой со связыванием молекулы октасахарида.

Новые модели димеров LPL

Виды трех новых моделей димеров LPL сверху, сбоку и снизу. Крышки и кластеры триптофана показаны синим, сайт связывания GPIHBP1 — черным, сайт связывания APOCII — красным, а две мутации (R75A и G188E), которые секретируются, но не димеризуются, — фиолетовым.На нижнем изображении желтым цветом показаны остатки 403, 405, 407 и K414, которые участвуют в связывании гепарина, и указаны расстояния между некоторыми из этих остатков.

Затем мы проанализировали новые модели в контексте экспериментальных расстояний, оцененных по средним значениям FRET. Для создания модели использовались два расстояния FRET от позиций 224-224 и 384-384. Третье расстояние, от 36 до 384, было исключено из моделирования, чтобы иметь независимое ограничение для проверки моделей.Мы измерили все три расстояния в двух новых моделях. Как для моделей FRET only, так и для моделей FRET plus, расстояния, измеренные в позициях 224-224 и 384-384, попали в диапазон экспериментальных расстояний FRET, измеренных на половине максимальной амплитуды. Что касается расстояния между положениями FRET 36 и 384, модель FRET оказалась наиболее подходящей: 49,5 Å в модели против 51 Å, измеренной экспериментально. Напротив, расстояние между позициями 36 и 384 в модели только FRET не попадает в пределы экспериментального диапазона половины максимального (см.).В целом, RMSD между экспериментальным и модельным расстояниями составляло 9,7 Å для модели только FRET и 1,7 Å для модели FRET plus.

ОБСУЖДЕНИЕ

В конечном итоге точное молекулярное описание LPL будет получено только после того, как структура будет решена с помощью ЯМР, кристаллографии или криоэлектронной микроскопии. Однако LPL сложно охарактеризовать, потому что это нестабильный белок, который трудно продуцировать в высоких концентрациях, и поэтому такая структура может появиться не скоро.Следовательно, мы создали модели структуры димера LPL, используя программу молекулярного моделирования Rosetta, ограниченную биологическими данными, экспериментально полученными расстояниями и экспериментально подтвержденной дисульфидной связностью. Наша цель состояла в том, чтобы предоставить исследователям атомные координаты этих моделей, чтобы облегчить дальнейшее изучение взаимосвязей между структурой LPL. Хотя о моделях димера LPL сообщалось ранее, координаты атомов для этих моделей не были опубликованы. Одно из соображений состоит в том, что детали моделей могут оказаться неверными, если будет получена экспериментальная структура LPL.Однако мы понимаем, что не все группы имеют доступ к программному обеспечению для моделирования, опыту и вычислительным мощностям, необходимым для создания этих моделей, и поэтому, с оговоркой, что они являются всего лишь моделями, они предоставляются в виде дополнительных файлов.

Исходная модель и модель только с FRET похожи, и обе имеют основное отличие от модели FRET plus в том, что интерфейсы димеризации переключаются. Это неожиданно, особенно для тех, кто привык рассматривать ЛПЛ в том виде, в котором она представлена в исходной модели, которая была создана из кристаллографического димера, наблюдаемого в некоторых структурах ФЛ.Однако важно отметить, что PL является мономерным белком, и контакты упаковки кристаллов, наблюдаемые в его структуре, могут не представлять законного интерфейса димеризации. Фактически, сравнение контактов белок-белок, происходящих из упаковки кристаллов, с контактами, встречающимися в природе в мультимерных белках, предполагает, что контакты упаковки кристаллов происходят случайно и, вероятно, имеют мало общего с интерфейсами физиологической олигомеризации ⁶³. Кроме того, другая кристаллическая структура ФЛ с двумя молекулами ФЛ в асимметричном блоке показывает совершенно другой интерфейс ⁴².На основе энергий связи возможны как исходная, так и новая модели. Все модели соответствуют известной биологии LPL в том, что они помещают LPL между его субстратом и его мембранным якорем. Модель FRET plus имеет дополнительные преимущества в том, что крышка, по-видимому, может открываться беспрепятственно, а сайт связывания APOCII находится на внешней поверхности димерной структуры, где он, вероятно, более доступен. Кроме того, в модели FRET plus мутация G188E, предполагаемый мутант димеризации и одна из наиболее распространенных инактивирующих мутаций LPL, расположена на границе раздела димеров ⁶⁴.

Один вопрос, возникающий из-за наличия двух потенциальных границ раздела димеризации, заключается в том, подвергаются ли димеры LPL биологически значимой олигомеризации; так что одна граница раздела опосредует образование димеров, а другая облегчает сборку димеров в молекулярные структуры более высокого порядка. Все модели димеров LPL занимали площадь примерно 100 на 60 Å. Частицы ЛПОНП имеют диаметр 300–800 Å, а размер хиломикронов находится в диапазоне 750–6000 Å в диаметре ⁶⁵. Таким образом, многие димеры LPL теоретически могут уместиться на одной частице липопротеина.Фактически, предыдущее исследование показало, что LPL наиболее эффективно гидролизует хиломикроны, когда на молекулу хиломикрона ⁶⁶ присутствует 43 молекулы LPL. Взятые вместе, эти данные поднимают вопрос о том, могут ли димеры LPL функционировать в массивах in vivo .

Интересной особенностью всех моделей является то, что они имеют отверстие в центре, напоминающее пончик. Энергетически полость между димерами-партнерами не идеальна, и поэтому возникает вопрос, имеет ли эта полость важную биологическую функцию.Могут ли свободные жирные кислоты проходить через эту полость, так что они напрямую направляются к эндотелиальной поверхности? Измерение самой узкой полости в модели FRET plus показало, что размер полости составляет примерно 6 Å в каждом направлении. В конечном итоге, чтобы ответить на этот и другие важные вопросы, поднятые этими новыми моделями LPL, потребуются экспериментальные данные. Мы надеемся, что они окажутся полезными при создании и ответе на вопросы, которые продвигают наше понимание взаимосвязи структура-функция LPL в липидном метаболизме.

Вы играли на 12-ладовой гитаре Тейлора?

Вы играли на 12 ладах Тейлора?

Все больше и больше музыкантов в восторге от вдохновляющего ощущения и звука 12-ладовых гитар Grand Concert Тейлора. Как только вы сыграете в нее, вы поймете, почему. Дизайн с 12 ладами отличается другим соотношением шеи к корпусу, что приводит к дополнительному обтекаемому ощущению рук и удивительно теплому и мощному голосу для гитары с маленьким корпусом. Выбирайте из более чем дюжины вариантов моделей Taylor с 12 ладами, отличающихся богатым сочетанием различных вкусов тонкого дерева.

Видео: Энди Пауэрс из Taylor объясняет привлекательность игры на 12 ладов

Основы на 12 ладах

Что такое 12 ладов?

Это положение, в котором гриф встречается с корпусом гитары. На других моделях Taylor со стальными струнами гриф встречается с корпусом на 14-м ладу. Гриф из 12 ладов также немного короче, чем гриф из 14 ладов, при этом общее количество ладов на два лада меньше (18 против 20). Различное расположение грифа по отношению к корпусу смещает перемычку от звукового отверстия ближе к центру нижней части выступа.Это придает гитаре отличительную музыкальную индивидуальность.

Что лежит в основе дизайна 12 ладов?

Его корни уходят в ранний период гитары со стальными струнами. Начиная с 1930-х годов, дизайн был постепенно заменен грифом с 14 ладами, как часть эволюции в сторону более длинных грифов, на которую повлияли дизайны мандолины и банджо. В результате 12-ладовый инструмент стал известен как старомодный дизайн, но в последние годы музыканты заново открыли для себя его уникальные музыкальные достоинства.Наши 12-ладовые гитары включают в себя современные элементы, такие как вырезанный корпус, обеспечивающий доступ к верхнему регистру.

Как дизайн 12 ладов меняет ощущение и звук гитары?

Между немного более короткой шкалой Grand Concert 24-7 / 8-дюймовой длины и перемещением бриджа в более гибкое место на деке, ощущение руки немного мягче и изящнее, что облегчает формирование аккордов и сгибание струн. . Различное положение бриджа также меняет способ движения деки, производя удивительное количество мощности, тепла и сустейна для меньшего стиля корпуса.

Кому понравится 12-ладная гитара?

Широкий спектр плееров. Мастерам маникюра понравятся изящные ручки и отзывчивость. Каждый, от новичка до продвинутого игрока, обнаружит, что уменьшенное натяжение струн и сжатый интервал между ладонами облегчают формирование аккордов. Любой, кто хочет уменьшить нагрузку на свою раздражающую руку, обязательно получит удовольствие от игры. Мы призываем всех опробовать 12 ладов Тейлора — уникальное ощущение и звук обещают вдохнуть новую жизнь в вашу игру.

Sadowsky объявляет о выпуске Masterbuilt 24-ладной модели

Садовски анонсирует созданные мастерами 24-ладовые модели сингловой огранки

Sadowsky анонсировала 3 новых релиза из своей линейки Masterbuilt. Эти три мощных и элегантных 5-струнных одинарных струны олицетворяют то, что можно ожидать от моделей Sadowsky Masterbuilt: лучшая древесина, лучшее оборудование и преданность мастеров до мельчайших деталей. С 24 ладами и активной электроникой бас-гитары предлагают максимальные тональные и технические возможности.

Они изготавливаются вручную только на заказ в Германии и имеют срок доставки 5-6 месяцев.

Sadowsky Masterbuilt 24-ладный одинарный бас-гитару, 5-струнный — Solid Olympic White High Polish

Модель с одинарной огранкой на 24 лада
5-струнный
Жареная кленовая шейка Birdseye
Гриф из жареного клена Birdseye
Вставки в черные точки
Кузов из болотного ясеня (камерный)
Белый олимпийский белый, глянцевый лак
Звукосниматели Sadowsky
Схема усиления высоких / низких частот Садовского с усилением средних частот и переключателем активный / пассивный
Система ремешков заподлицо Dunlop
Черная фурнитура
Для получения информации о ценах на международном рынке обратитесь к местному дистрибьютору или дилеру.

Sadowsky Masterbuilt 24-ладовый одинарный бас, безладовый, 5-струнный — Natural Transparent High Polish

Модель с одинарной огранкой на 24 лада
5-струнный
Безладовый с белыми линиями QuarterLines
Жареный кленовый вырез
Гриф из черного дерева
Топ из бразильского палисандра с черными акцентами / задняя часть из окоуме с камерами
Натуральная прозрачная глянцевая полировка
Звукосниматели Sadowsky
Схема усиления высоких / низких частот Садовского с усилением средних частот и переключателем активный / пассивный
Система ремешков заподлицо Dunlop
Черная фурнитура
Masterreserve-Wood-Selection
Для получения информации о ценах на международном рынке обратитесь к местному дистрибьютору или дилеру.

Sadowsky Masterbuilt 24-ладовый одинарный бас, безладовый, 5-струнный — Natural Transparent High Polish

Модель с одинарной огранкой на 24 лада
5-струнный
Кленовый воротник
Накладка грифа из клена
Вставки в черные точки
Топ MasterGrade из шпатированного клена с черными акцентными линиями / боди из каменного ясеня из болотного ясеня
Натуральная прозрачная глянцевая полировка
Звукосниматели Sadowsky
Схема усиления высоких / низких частот Садовского с усилением средних частот и переключателем активный / пассивный
Система ремешков заподлицо Dunlop
Черная фурнитура
Для получения информации о ценах на международном рынке обратитесь к местному дистрибьютору или дилеру.

Срок поставки 5-6 месяцев

Для получения дополнительной информации нажмите здесь:

Объявление

Предыдущая статья Гибридные матричные процессоры DSP компании LD Systems ZONE X уже доступныСледующая статьяEpiphone выпускает Brendon Small GhostHorse Explorer

Реальная история моделей

с 14-ладовой оркестром Мартина

Гитары Martin Orchestra Model (OM), изготовленные до Второй мировой войны, являются одними из лучших, когда-либо сделанных для пальпации.Это довольно иронично, учитывая, что они были созданы специально для сборщиков квартир. • Об OM-28 написано много, но некоторая информация, в том числе о том, как он был разработан для Perry Bechtel, немного вводит в заблуждение. Реальная история более сложная.

Гитары

с грифом на 14 ладов вряд ли были новой концепцией, когда в конце 1929 года был представлен OM-28. Слишком часто дебют грифеля OM-14 с грифом на 14 ладов изображался Мартином как чудесное нововведение. Фактически, у Gibson L-5 он был с момента его создания в 1923 году; Еще более ранний Gibson Style O имел гриф с 15 ладами.

Бехтель (1902-82) был феноменальным плектром-банджоистом и джаз-гитаристом, который выступал со стилем O до 29-го, так что идея Мартина сделать гитару с более длинным грифом не вызывает особого доверия просто потому, что он привык к ней. играет на плектральном банджо. И поскольку он был опытным гитаристом, нет смысла думать, что он хотел, чтобы длинная гриф была больше похожа на банджо, особенно когда у него уже был Style O. К 29 году он наверняка был бы знаком с L-5. .

Архивы Мартина показывают, что еще одним важным фактором была разработка тенор-гитары «Карл Фишер» (с 14 ладами, свободными от корпуса), которая предшествовала OM на несколько месяцев и была разработана по настоянию Эла Эспозито, сотрудника Нью-Йорка. розничного продавца Carl Fisher, специально для того, чтобы удержать клиентов Фрэнка Виктора и Фрэнка Петруччи от покупки Gibsons.Конструкция в конечном итоге превратилась в Martin O-18T, самую популярную тенор-гитару компании.

Многочисленные документы в архивах Мартина доказывают решающую роль Bechtel в развитии OM. Но его особая гитара была создана после модели Карла Фишера. В переписке есть ссылка на модель Гибсона O Перри, первоначально запрашивающую 15 ладов вне тела и дублирующий профиль грифа (ни один запрос не был удовлетворен).

Когда Мартин проектировал OM-28, он в основном основывал его на модели 000-28, но укорачивал корпус, а не перемещал бридж, чтобы приспособить его к грифу с 14 ладами.12-ладовый 000 имел шкалу 25,4 дюйма, которая была продолжена в OM-28. В ’34 году обозначение OM было снято с производства вместе с 12-ладам 000. Технические характеристики ’33 OM-28 идентичны раннему ’34 000-28. К сентябрю 1934 года шкала 000 была уменьшена до 24,9 дюйма, что совпало с появлением современных ладов с изогнутым верхом и узким выступом, доходящим до грифа, а также усилением грифа Т-образной дуги.

Самые ранние модели OM имеют прямоугольные перемычки на концах пирамиды, и эта функция была прекращена вскоре после того, как модель была представлена.Более стандартные ранние OM имели колышки для банджо, небольшую накладку и вставки на пятой, седьмой и девятой позициях; большая накладка появилась в марте 31-го, а первая партия гитар OM с угловыми настройками Grover была произведена в июне. К концу 1931 года инкрустация началась с пятого лада и продолжилась до 15-го.

Пример, показанный здесь, был частью партии, произведенной 24 июня 1931 года, и соответствует спецификациям того периода, с верхом из ели адирондак, спинкой из бразильского палисандра, боковыми сторонами и накладкой на колышки, зигзагообразной центральной полосой на спине. маркетри, целлулоидная накладка под черепаховый узор (одна из первых современных размеров), многослойная бело-черная (5/9/5) розетка для звуковых отверстий, мост «низ живота» из черного дерева с длинным седлом, белые штифты мостовидного протеза с черные центральные точки, гриф из красного дерева с колпачком из слоновой кости, штампованный логотип на задней части головы, никелированные тюнеры Grover с открытой спиной и металлическими кнопками (первая партия с ними вместо тюнеров для банджо), 20-ладная накладка из черного дерева (14 прозрачных) корпуса) с алмазными вставками с прорезями, однослойным переплетом цвета слоновой кости и отделкой в елочку на верхнем крае тела, многослойным переплетом с внешним слоем цвета слоновой кости на заднем крае.

Эта статья впервые появилась в выпуске VG за март 2018 г. Все авторские права принадлежат автору и журналу Vintage Guitar . Несанкционированное копирование или использование строго запрещено.

гибкий инструмент для понимания FRET в сложных геометрических формах

1. Введение

Флуоресцентная спектроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — важный инструмент для исследования структуры и функций биологических систем.FRET основан на спонтанной безызлучательной передаче энергии от возбужденного донора к подходящему акцептору. Вероятность этой передачи энергии, известная как эффективность FRET, показывает зависимость в 6-й степени от разделения донора и акцептора. ¹ FRET полезен для определения близости молекул и измерения межмолекулярных и внутримолекулярных расстояний в диапазоне от 10 до 100 Å. Среди многих других приложений FRET использовался для исследования структуры и динамики биомолекул, ² ^— ⁴ изучали агрегационное поведение белков и липидов в мембранной среде, ⁵ ^— ⁸ и характеризуют полимерные материалы.⁹ ^, ¹⁰

Количественные измерения FRET часто стремятся связать эффективность FRET и разделение донор-акцептор. Это соотношение хорошо определено для одной пары донор-акцептор. Однако многие текущие приложения FRET включают в себя несколько доноров и акцепторов, и в результате нельзя использовать исходное выражение единственного расстояния. Один из способов решения этой проблемы — разработать аналитическое выражение, описывающее FRET для конкретного расположения доноров и акцепторов, уникальных для интересующей системы.Целью этого подхода является получение функции, которая связывает эффективность FRET с интересующей величиной, такой как радиус тетрамерного массива флуорофоров или плотность флуорофоров внутри мембраны. Аналитические методы были использованы для обнаружения и характеристики микродоменов в мембранах, ¹¹ ^— ¹³ мониторинга липидных и белковых взаимодействий, ¹⁴ ^, ¹⁵ и для исследования белков, которые образуют олигомерные комплексы. ¹⁶ ^— ¹⁹ Одно из преимуществ аналитических выражений состоит в том, что они однозначно описывают эффективность FRET для определенного распределения флуорофоров.Тем не менее, это преимущество также становится ограничением, поскольку эти модели часто плохо переносятся на другие системы. Кроме того, аналитические выражения часто бывают сложными даже для относительно простых систем, и может потребоваться подгонка необходимых параметров, чтобы сделать их пригодными для анализа. Другой недостаток заключается в том, что большинство аналитических методов не подходят для моделирования неравномерного распределения флуорофоров.

Численные методы, такие как моделирование методом Монте-Карло (MCS), хорошо подходят для моделирования даже сложных конфигураций флуорофоров и, таким образом, являются альтернативой аналитическим выражениям.Серия исследований продемонстрировала, что численные методы полезны для анализа и интерпретации данных экспериментов FRET. Wolber et al. ²⁰ и Towles et al. ¹³ использовал результаты MCS для проверки аналитических выражений. Сингх и Райку ²¹ исследовали FRET в однородных и гетерогенных распределениях флуорофоров и использовали MCS для сравнения различных методов анализа данных FRET. Berney и Danuser ²² сравнили различные методы измерения и количественной оценки эффективности FRET и использовали MCS для получения независимых эталонных значений.Frederix et al. ²³ показали, что MCS может помочь в интерпретации данных микроскопических экспериментов путем моделирования FRET между флуорофорами на актиновых филаментах, включая эффект фотообесцвечивания. Численные методы оказались особенно полезными при моделировании неоднородного распределения липидов и белков в мембранном окружении. Frazier et al. ²⁴ использовали MCS для интерпретации результатов экспериментов FRET и исследования фазового разделения липидной смеси. Zimet et al.²⁵ смоделировали FRET между донорами, связанными с мембранными белками, и акцепторами, связанными с липидами, чтобы изучить влияние краудинга на квантовый выход донора. Снайдер и Фрейре ²⁶ разработали численный метод для описания тушения доноров флуорофоров в мембранах. Кишковски и Кенуорти ²⁷ использовали MCS, чтобы продемонстрировать, что FRET можно использовать для обнаружения и характеристики микродоменов в мембранах, изучая влияние кластеризации на эффективность FRET.

В отличие от аналитических выражений, численные методы не определяют FRET как функцию определенного свойства или уникального расположения флуорофоров.Скорее, они моделируют FRET, генерируя набор координат донора и акцептора, которые имитируют реальное распределение флуорофоров, обнаруженное в эксперименте. Эффективность FRET тогда просто вычисляется как функция донорно-акцепторного разделения всех возможных пар. При реализации с использованием модульного подхода численные методы являются гибкими и могут использоваться для исследования FRET в системах с различной геометрией или распределением флуорофоров без необходимости повторной разработки метода.

В предыдущей статье, ²⁸ мы представили простую и гибкую схему расчета Монте-Карло, которая была реализована с помощью программы FORTRAN под названием ExiFRET.Эта программа может использоваться для моделирования FRET для заданного распределения флуорофоров, представленных координатами, которые определяют их местоположение в пространстве. Система состоит из отдельных флуорофоров, которые случайным образом распределены в двух или трех измерениях, или флуорофоров, которые расположены в правильной геометрии, например, когда они связаны в пары или пентамеры. В этой статье мы представляем удобную веб-версию этой программы, которая включает множество расширений из предыдущей программы. Целью этих расширений было повышение гибкости программы, что позволило ей генерировать координаты флуорофора для имитации большого диапазона экспериментов.Кроме того, это также позволяет нам предлагать эксперименты, которые могут быть полезны для получения структурной информации из сложных систем.

В дополнение к существующей функциональности, расширения программы включают следующие возможности:

• генерировать координаты флуорофора, которые могут моделировать хосты, содержащие только доноры или акцепторы. Это полезно для моделирования экспериментов, в которых флуорофоры прикреплены к отдельным молекулам. Например, для мониторинга самоассоциации белков и липидов или сообщения о близости лиганда и его целевого белка.
• обеспечить фиксированную стехиометрию доноров и акцепторов в каждом хозяине. Это полезно для моделирования гетеромерных белков с известной стехиометрией субъединиц.
• смоделировать снижение эффективности этикетирования, чтобы количественно оценить его влияние на эффективность FRET.
• модель FRET для флуорофоров, которые расположены в кластеры (т. Е. Агрегированы в круглые микродомены). Это может помочь в анализе экспериментов FRET, направленных на мониторинг поведения агрегации липидов и белков в мембранной среде.
• рассчитать FRET для набора предоставленных пользователем координат флуорофора. Это позволяет использовать программу для моделирования FRET для любой конфигурации флуорофоров.
• для моделирования FRET между флуорофорами с ограниченными ориентациями с учетом положения флуорофора в пространстве, ориентации и подвижности диполей перехода.

ExiFRET доступен в виде веб-версии, которая позволяет выполнять программу в режиме онлайн.Результат можно получить с веб-сайта в виде простых текстовых файлов. Веб-сайт (www.exifret.com) также содержит документацию по всем входным параметрам и примеры входных файлов для данных, представленных в этом документе.

Остальная часть статьи организована следующим образом: Раздел «Методы» содержит краткое изложение схемы моделирования Монте-Карло и описывает, как новые параметры были реализованы в существующей программе. В разделе «Результаты» приведены некоторые примеры того, как эти новые входные параметры могут использоваться для исследования ряда различных экспериментов FRET.

2. Методы

Схема моделирования Монте-Карло, представленная в этой статье, является расширением ранее описанной ExiFRET. ²⁸ В следующем разделе представлен только краткий обзор шагов, необходимых для получения координат флуорофоров и расчета эффективности FRET, а также перечислены основные теоретические допущения. Для более подробного описания отдельных шагов и теоретических оснований читатель отсылается к предыдущей публикации.²⁸

2.1.

Схема моделирования Монте-Карло

Целью схемы моделирования является расчет эффективности FRET для различных расположений флуорофоров в двух или трех измерениях. Система моделирования определяется набором параметров, которые предоставляются пользователем как входной файл. В таблице 1 дано краткое описание основных входных параметров. Процесс FRET моделируется путем моделирования входящего излучения как серии дискретных фотонов, которые «проигрываются» в соответствии с заранее определенным графиком.Поступающие фотоны, которые поглощаются, вызывают возбуждение доступного донора. Релаксация донора может происходить за счет флуоресценции или передачи энергии доступному акцептору. Время релаксации выбирается исходя из константы скорости этих процессов. Общая эффективность FRET рассчитывается путем подсчета количества событий флуоресценции и передачи энергии.

Таблица 1

Значения и значения входных параметров для программы ExiFRET. Примеры входных файлов можно найти на сайте ExiFRET (www.exifret.com).

Параметр	Допустимые значения	Значение
Координаты пользователя	Верно или неверно	Верно: координаты флуорофора предоставляются пользователем как входной файл. Неверно: координаты флуорофора генерируются программой.
Размер системы	2 или 3	Флуорофоры расположены в 2-D или 3-D
Гексагональных олигомерах	Истинный или ложный	Используется для моделирования системы с одиночными гексагонально упакованными n-мерами .Верно: образует гексагонально упакованные олигомеры. Ложь: создает n-мерки, в которых флуорофоры распределены по кругу (2-D) или сфере (3-D).
Размер n-мер	≥1	При n = 1 отдельные флуорофоры распределяются случайным образом. При n = 2 флуорофоры связаны попарно с определенным разделением. При n≥3 флуорофоры распределяются по радиусу круга (2-D или 3-D системы) или сферы (только 3-D системы).
Радиус	≥0	Определяет размер числа.Радиус можно рассматривать как радиус белка-хозяина, к которому прикреплены зонды.
Плотность	> 0	Плотность, при которой n-меры распределяются по системе, в н-мерах на Å2 (2-D) или n-мерах на Å3 (3-D).
da стехиометрия	Верно или неверно	Верно: фиксированная стехиометрия доноров и акцепторов в каждом н-мере принудительно, в зависимости от количества акцепторов на н-мер и доноров на н-мер. мер.Неверно: дает n-мерные смешанные стехиометрии.
da отдельный	Верно или неверно	Верно: каждый n-мер содержит только доноров или только акцепторов. Неверно: флуорофоры случайным образом назначаются в качестве доноров или акцепторов и, следовательно, образуют n-меры, содержащие как доноры, так и акцепторы
Второй радиус	Верно или неверно	Верно: используются два разных радиуса, чтобы избежать перекрытия хозяев и для определения разделения флуорофоров для расчета эффективности FRET.
Избегайте перекрытия	Верно или неверно	Верно: флуорофоры расположены так, что н-меры не перекрываются за счет использования исключенного объема вокруг каждого н-мера. Неверно: исключенный объем не используется, и n-мерные числа могут перекрываться.
Плоские числа	Верно или неверно	Активно, только если размерность системы равна 3. Верно: n-мерки распределены в плоскости (т. Е. В кольце). Ложь: распределено в сфере.
Кластеры	Верно или неверно	Верно: n-меры расположены в кластеры.Система определяется размером кластера и количеством кластеров. Неверно: n-меры расположены в случайном и однородном распределении.
R0	≥1	Характерное расстояние донорно-акцепторной пары, в Å
Конфигурации	≥1	Количество конфигураций, используемых для расчета средней эффективности FRET данной системы.
Вероятность донора (Pdonor)	0	Вероятность того, что какой-либо флуорофор является донором (в зависимости от отношения d∶a).
Эффективность маркировки (l)	0	Определяет долю сайтов, которые помечены как донор или акцептор.
Частицы	≥1	Число n-мер.
Фотоны	≥1	Количество поглощенных фотонов, используемых для каждой конфигурации.
Энергия излучения	> 0	Энергия освещающего лазера, Вт / мкм2.
Длина волны	> 0	Длина волны освещающего лазера, в нм.
Коэффициент экстинкции	> 0	Коэффициент экстинкции донора, см-1M-1.
Время жизни донора	> 0	Время жизни флуоресценции донора в отсутствие акцептора, нс.
Время жизни акцептора	> 0	Время жизни флуоресценции акцептора в нс.

На рисунке 1 схематично показаны этапы расчета эффективности FRET.На шаге 1 создается набор координат флуорофора в двух или трех измерениях на основе входных параметров. Координаты генерируются процедурой отжига, которая предотвращает перекрытие флуорофоров. Моделирование позволяет получить частицы регулярной геометрии путем отнесения флуорофоров к так называемым n-мерам, которые состоят из n флуорофоров, связанных в фиксированной относительной ориентации. Для n = 1 отдельные флуорофоры распределяются случайным образом; в то время как для n = 2 флуорофоры связаны парами.Для n ≥ 3 флуорофоры равномерно распределены либо по кругу, либо по сфере (только 3-D) с заданным радиусом, либо гексагонально упакованы в плотные олигомеры (2-D). На этапе 2 флуорофорам случайным образом назначается тип (донор или акцептор), при этом обеспечивается соотношение донор-акцептор (Pdonor) и стехиометрия (дастохиометрия, дасепарат), как определено во входном файле. Вероятность переноса каждой возможной пары донор-акцептор на основе разделения флуорофоров и предоставленного значения R0 рассчитывается на этапе 3.График возбуждения подготовлен для моделирования потока фотонов, генерируемых лазером (шаг 4). Скорость, с которой фотоны попадают в систему, зависит от интенсивности света, которая моделируется путем расчета потока фотонов на основе освещенности и длины волны лазера. Количество фотонов, поглощаемых флуорофором, зависит от количества доноров в системе и коэффициента экстинкции. Хотя предыдущие расчеты ²⁸ показывают, что типичные значения лазерной освещенности не оказывают значительного влияния на эффективность FRET, следует соблюдать осторожность при использовании ярких лазеров или акцепторов с длительным сроком службы.На шаге 5 передача энергии моделируется воспроизведением фотонов по заранее заданному расписанию. Для каждого фотона алгоритм случайным образом выбирает донора из ранее сгенерированного списка. В этот список не входят доноры, которые ранее были взволнованы и не расслабились. Донор выделяет свою энергию посредством флуоресценции или передачи энергии акцептору в зависимости от относительной вероятности каждого процесса. Процесс проигрывания фотонов повторяется для всего графика возбуждения. Общий подсчет флуоресценции и событий FRET сохраняется и впоследствии используется для расчета эффективности FRET для этой конкретной конфигурации флуорофоров (этап 6).Вся процедура, шаги с 1 по 6, повторяется для большого количества конфигураций (мы обычно используем> 1000), чтобы вычислить среднюю эффективность FRET для заданного набора входных параметров.

Рис. 1

Схематическое изображение шагов, задействованных в схеме моделирования Монте-Карло для расчета эффективности FRET для любого расположения флуорофоров.

Все расширения, описанные в разд. 2.3, помимо случая ограниченной ориентации, касается расположения флуорофоров.Следовательно, описанные расширения включали изменения только в модули, которые генерируют координаты флуорофора и назначают типы флуорофора (этапы 1 и 2). Общая схема моделирования входящих фотонов и расчета эффективности FRET для данной конфигурации остается неизменной. Примеры входных файлов можно найти на сайте ExiFRET (www.exifret.com).

2.2.

Допущения

Расчеты в ExiFRET основаны на серии предположений, которые могут повлиять на достоверность и применимость прогнозируемой эффективности FRET:

• Алгоритм не моделирует передачу между 2 донорами или 2 акцепторами (гомо-FRET ) или множественные события передачи для одиночных пакетов энергии.
• Каждый фотон, поглощенный донором, имеет одну из двух судьб: он высвобождается посредством флуоресценции или передает энергию доступному акцептору. Хотя в действительности возбужденное состояние донора может распадаться другими механизмами, они не моделируются в ExiFRET. Это предположение не влияет на результаты наших расчетов, потому что эффективность FRET рассчитывается из отношения количества фотонов, высвобождаемых в результате флуоресценции, и количества фотонов, которые претерпевают передачу энергии, и это останется неизменным, если некоторые фотоны потеряны из донора. другими механизмами распада.Точно так же механизм снятия возбуждения акцептора не влияет на режим релаксации донора и, следовательно, не меняет соотношение событий FRET и флуоресценции.
• В расчетах предполагается, что при наличии нескольких акцепторов FRET квант энергии либо высвобождается от донора, либо передается в toto только одному из присутствующих акцепторов. Более того, путь переноса каждого донора независим, и, таким образом, общая скорость переноса для данного донора является суммой индивидуальных путей переноса (называемая «кинетической моделью» ²⁹).Общая эффективность FRET суммируется по всем донорам. Эти предположения были хорошо подтверждены для случаев нескольких флуорофоров, в частности, путем измерения FRET в растворе, ²⁸ ^, ³⁰ или случаев с одним донором и несколькими акцепторами, ³¹, хотя недавнее исследование ставит под сомнение их достоверность. в конкретных ситуациях. ²⁹
• Величина R0 зависит, помимо прочего, от относительной ориентации диполей донорного и акцепторного переходов, определяемой коэффициентом ориентации κ2.Алгоритм ExiFRET не предполагает какого-либо конкретного значения для κ2, а вместо этого оставляет его на усмотрение пользователя через значение R0 во входном файле.
• Процедура отжига, которая назначает координаты флуорофора, гарантирует, что никакие n-меры не перекрываются за счет использования исключенного объема вокруг каждого n-мера, где не может находиться другой флуорофор. При желании эту опцию можно отключить.
• После возбуждения донора в момент времени Te он остается возбужденным в течение периода Td.Донор недоступен до времени Te + Td. Td зависит от скорости высвобождения энергии от донора, которая определяется временем жизни незатушенного донора, количеством доступных акцепторов и вероятностями передачи всех донорно-акцепторных пар.
• Аналогично, если акцептор становится возбужденным, он остается возбужденным в течение периода Ta, который зависит от времени жизни акцептора. Хотя на самом деле акцептор будет возбужден только через промежуток времени после снятия возбуждения донора; здесь мы предполагаем, что акцептор недоступен в интервале времени Te + Ta.

2.3.

Новые входные параметры

2.3.1.

Кластеризация флуорофоров

Мы расширили процедуру отжига, чтобы обеспечить генерацию координат для флуорофоров, расположенных в круглые кластеры (только для 2-D). Рисунок 2 иллюстрирует разницу между случайным расположением и флуорофорами, которые собраны в кластеры. Эти микродомены моделируются как ряд независимых кольцевых областей с высокой концентрацией флуорофора, что определяется количеством кластеров и их размером (определяемым их радиусом).Процедура отжига случайным образом распределяет кластеры в системе, избегая перекрывающихся областей. Каждый флуорофор случайным образом назначается кластеру, который создает области с разной локальной плотностью, в то же время обеспечивая общесистемную плотность флуорофора, определенную во входном файле. Та же процедура отжига используется повторно для случайного распределения флуорофоров внутри каждого кластера, тем самым создавая окончательный набор координат флуорофоров, которые используются для расчета эффективности FRET.

Фиг.2

ExiFRET можно использовать для моделирования FRET для флуорофоров с однородным распределением (b) или сгруппированными в кластеры (a).

2.3.2.

Присвоение типа флуорофора

В исходной схеме моделирования флуорофоры случайным образом назначаются как доноры или акцепторы, так что общесистемное соотношение донор-акцептор соответствует входному параметру Pdonor. Новый ввод, daseparate, позволяет пользователю генерировать n-меры, содержащие только доноры или акцепторы (см. Раздел 3.1 и рис.4). Новый параметр, дастохиометрия, позволяет пользователю контролировать стехиометрию доноров и акцепторов в каждом n-мере. Хотя эта процедура обеспечивает фиксированное соотношение доноров и акцепторов, их точное положение в каждом n-мере по-прежнему выбирается случайным образом.

2.3.3.

Размер n-мер

Флуорофоры, которые расположены в правильной геометрии, очень полезны для моделирования FRET в мультимерных белках, где флуорофоры прикреплены к индивидуальным субъединицам.В расчетной схеме размер n-мер определяется радиусом круга или сферы, на которой флуорофоры распределены в фиксированной относительной ориентации. Этот радиус используется в двух шагах алгоритма. Во-первых, он используется в процедуре отжига, чтобы избежать перекрытия молекул-хозяев. Во-вторых, радиус используется для размещения самих флуорофоров вокруг хозяина. Фактически, теперь для этих двух задач можно определить два разных радиуса: 1. Радиус, описывающий размер молекулы-хозяина, чтобы избежать перекрытия n-мер; 2.радиус, который определяет n-мер, образованный флуорофорами, который определяет положения флуорофоров (см. рис. 8, вставка). Чтобы использовать два разных радиуса, логический входной параметр (второй радиус) устанавливается в значение true; в противном случае используется только больший радиус.

2.3.4.

Эффективность маркировки

Снижение эффективности маркировки может значительно снизить наблюдаемую эффективность FRET. Новый входной параметр позволяет пользователю указать эффективность маркировки для моделирования влияния немаркированных сайтов на конечную эффективность FRET.Вместо простого масштабирования конечного результата расчета по эффективности маркировки входной параметр используется при назначении типов флуорофора. В дополнение к донорам и акцепторам был создан новый тип частиц, известный как «пустые». Назначение этих пустых сайтов является случайным, так что каждый флуорофор в системе с равной вероятностью является немеченым сайтом. Эффективность маркировки (le) эффективно снижает общее количество флуорофоров, так что nempty = ntotal- (1 * le), nacceptor = ntotal * le * (1-Pdonor) и ndonor = ntotal * le * Pdonor

2.3.5.

Координаты, предоставляемые пользователем

Расширенная версия ExiFRET позволяет пользователю предоставить текстовый файл с положениями и типами набора координат флуорофора для описания любой желаемой системы. В этом случае шаги 1 и 2 в алгоритме (рис. 1) пропускаются, а координаты x, y и z, а также тип флуорофора считываются из текстового файла. Другие параметры расчета, такие как донорно-акцепторное соотношение и плотность флуорофора, рассчитываются на основе входных данных.Затем схема расчета переходит к этапам с 3 по 5. Единственное отличие состоит в том, что в этом случае эффективность FRET рассчитывается для одной конфигурации, предоставляемой пользователем, и, следовательно, окончательный результат не усредняется по многим конфигурациям.

3. Результаты

3.1.

Фоновая концентрация

Одним из способов использования FRET является определение расстояния между двумя конкретными сайтами в молекуле на основе измерения эффективности FRET между донором и акцептором, которые прикреплены к одному и тому же хозяину (внутримолекулярный FRET).Любое возникновение FRET между молекулами-хозяевами (межмолекулярный FRET) может мешать этим внутримолекулярным событиям. Вероятность межмолекулярного FRET увеличивается с увеличением плотности хозяина, например, в образцах с высокой концентрацией молекул хозяина, или из-за увеличения локальной концентрации, вызванной скоплением молекул хозяина. Это увеличение межмолекулярного FRET вызовет систематическую ошибку и нарушит любые попытки использовать эффективность FRET донорно-акцепторной пары одного и того же хозяина.Обычно невозможно экспериментально определить относительные вклады межмолекулярного и внутримолекулярного FRET в общую наблюдаемую эффективность FRET, поэтому наличие межмолекулярного FRET вносит неопределенность. ExiFRET можно использовать для построения графика зависимости эффективности FRET от разделения флуорофоров (для данной плотности флуорофоров), который включает FRET как из меж-, так и внутримолекулярного FRET и позволяет правильно определять внутримолекулярные расстояния. На рисунке 3 (а) показана взаимосвязь между эффективностью FRET и донорно-акцепторным разделением одного хозяина для различных средних плотностей молекул хозяина, распределенных в 2-D.Эффективность FRET сильно различается при разных концентрациях хозяина, даже при фиксированном разделении донор-акцептор для каждого хозяина.

Рис. 3

(a) Эффективность FRET в сравнении с разделением флуорофора для хозяев, распределенных в двумерной среде, содержащей одну пару донор-акцептор для серии различных поверхностных плотностей n-мер (отмеченных рядом с каждой кривой в единицах × 10-3 Å2). (b) ExiFRET можно использовать для количественной оценки вклада меж- и внутримолекулярного FRET в общую эффективность FRET, как показано для белков-хозяев (n-меров), распределенных в среде, содержащей одну донорно-акцепторную пару.Общая эффективность FRET увеличивается с увеличением поверхностной плотности из-за увеличения вероятности межмолекулярного FRET. Значения основных параметров показаны на рисунке. Полный и репрезентативный входной файл для этого и последующих цифр представлен на веб-сайте (www.exifret.com).

Также можно использовать ExiFRET для количественной оценки вкладов меж- и внутримолекулярного FRET в общую наблюдаемую эффективность FRET как функцию поверхностной плотности. На рис. 3 (б) это показано для хозяев, содержащих одну донорно-акцепторную пару.

В качестве альтернативы, оценка меж- и внутримолекулярного FRET также может быть получена путем сравнения графиков эффективности FRET в зависимости от поверхностной плотности систем с различными комбинациями смешанных и отдельных донорно-акцепторных хозяев [Рис. 4 (а)]. Новые входные параметры, daseparate и dastoichiometry, были использованы для определения трех случаев одинаково расположенных флуорофоров, которые показывают различные комбинации меж- и внутримолекулярного FRET. В случае 1 стехиометрия доноров и акцепторов в каждом n-мере не фиксирована, и присутствуют как смешанные, так и отдельные хозяева (dastoichiometry = false, daseparate = false).Следовательно, возможны как межмолекулярные, так и внутримолекулярные FRET. В случае 2 каждый n-мер состоит из пары донор-акцептор, обеспечивая фиксированную стехиометрию (dastoichiometry = true, daseparate = false). Это увеличивает вероятность внутримолекулярного FRET, что приводит к увеличению общей эффективности FRET. Случай 3 описывает n-меры, которые содержат либо только доноры, либо только акцепторы, и, следовательно, исключает возможность внутримолекулярного FRET (dastoichiometry = false, daseparate = true). Это снижает общую эффективность FRET.При условии, что уровень межмолекулярного FRET одинаков во всех случаях, вклад внутримолекулярного FRET в случаях 1 и 2 может быть определен путем вычитания эффективности FRET для случая 1 из эффективности FRET для случая 2 или 3. Мы подтвердили это, вычислив относительную вклады меж- и внутримолекулярной FRET для каждого случая [Рис. 4 (b)] и обнаружил, что все три случая показывают очень похожие уровни межмолекулярной эффективности FRET. Следовательно, этот подход может быть полезен для оценки относительного вклада меж- и внутримолекулярного FRET в диапазоне концентраций флуорофора.Другой интересный результат моделирования этих трех случаев заключается в том, что внутримолекулярный FRET уменьшается с увеличением поверхностной плотности. Это означает, что вклад внутримолекулярного FRET в общую эффективность FRET уменьшается, поскольку межмолекулярный FRET начинает конкурировать с внутримолекулярным FRET.

Рис. 4

Эффективность FRET в зависимости от плотности флуорофора для трех различных протоколов мечения хозяев с двумя флуорофорами, распределенными в 2-D. Сравнение эффективности FRET в трех случаях может быть использовано для количественной оценки вклада меж- и внутримолекулярного FRET.(а) Общая эффективность FRET для каждого случая. (б) Меж- и внутримолекулярный FRET для каждого случая. Обратите внимание, что внутримолекулярный FRET всегда равен 0 для случая 3. Случай 1: каждый сайт имеет равную вероятность быть донором или акцептором (сплошные линии). Случай 1 моделируется с использованием dastoichiometry = false, daseparate = false. Случай 2: у каждого хозяина есть один донор и один акцептор (пунктирные линии). Случай 2 моделируется с использованием dastoichiometry = true, daseparate = false. Случай 3: у каждого хоста есть два донора или два акцептора (пунктирные линии).Случай 2 моделируется с использованием dastoichiometry = false, daseparate = true.

3.2.

Мультимерные белки и олигомеры

Еще одно возможное использование FRET — изучение физических размеров олигомерных белков. В предыдущих исследованиях использовались аналитические выражения или численные методы для определения взаимосвязи между эффективностью FRET и радиусом олигомера ²⁸ ^, ³² ^, ³³ или количеством задействованных субъединиц.Adair и Engelman ³⁴ показали, что FRET можно использовать для различения димеров и более крупных олигомеров. Более поздние исследования показали, что можно количественно определить количество субъединиц в более крупных олигомерных белках и оценить долю белков, которые остаются в виде мономеров. ¹⁶ ^— ¹⁹ ^, ³⁵ Преимущество использования численных методов, как описано здесь, состоит в том, что они могут учитывать межмолекулярный FRET (см.3.1) и может моделировать кластеры олигомеров (см. Раздел 3.3).

На рис. 5 мы показываем, как эффективность FRET зависит от физического размера олигомеров для олигомеров, содержащих от двух до восьми субъединиц с флуорофором на каждом мономере, который случайным образом назначается донором или акцептором. Этот график подчеркивает тот факт, что ни одна из этих линий не соответствует соотношению 1 / R6, которое можно было бы ожидать для пар донор-акцептор. Наличие такого графика имеет решающее значение при использовании FRET для количественного исследования структурных изменений, которые происходят в мультимерных белках, таких как ионные каналы.³² ^, ³³

Рис.5

FRET в мультимерных белках. Эффективность FRET показана в зависимости от радиуса мультимера в 2-D для ситуации, в которой каждая субъединица имеет равную вероятность удержания донора или акцептора. Цифры рядом с каждой кривой относятся к количеству субъединиц в мультимере (размер n-мер). Справа показаны различные мультимеры.

ExiFRET также показывает, как количество субъединиц в олигомере может быть определено из соответствующих экспериментов FRET.На рисунке 6 показаны графики зависимости эффективности FRET от вероятности донора (т. Е. Отношения донора к акцептору) для ряда кольцевых олигомеров с увеличивающимся числом субъединиц. Хотя все графики имеют схожую форму, максимальная эффективность FRET показывает систематический сдвиг влево с увеличением количества субъединиц.

Рис. 6

Эффективность FRET представлена в зависимости от вероятности донора для серии олигомеров увеличивающегося размера n-мер (указаны рядом с каждой кривой), распределенных в 2-D.Радиус мультимера в каждом случае выбирается таким, чтобы эффективность FRET составляла 0,5 при вероятности донора = 0,5.

Графики зависимости эффективности FRET от радиуса мультимера также могут быть использованы для исследования влияния фиксированной стехиометрии различных субъединиц в гетеромерных белках на эффективность FRET. На рис. 7 показаны графики зависимости эффективности FRET от мультимерного радиуса для серии пентамеров с различной стехиометрией доноров и акцепторов по сравнению с пентамерами со случайной стехиометрией.Прогнозирование влияния стехиометрии субъединиц на эффективность FRET может быть полезно для исследования мультимерных белков неизвестной стехиометрии.

Рис. 7

Эффективность FRET в зависимости от радиуса мультимера для набора пентамерных белков с различной стехиометрией доноров и акцепторов.

При использовании FRET для определения радиуса мультимерного белка может потребоваться учитывать размер флуоресцентного зонда относительно размера молекулы хозяина.Наблюдаемая эффективность FRET основана на положениях флуорофора, которые не обязательно равны положениям субъединиц хозяина, к которым прикреплены зонды. Если размер флуоресцентного зонда мал по сравнению с размером хозяина, эта разница в положениях может не иметь значения. Однако при использовании больших флуоресцентных зондов или длинных линкеров могут возникнуть значительные различия (см. Рис. 8, вставка). На рисунке 8 показан график зависимости эффективности FRET от плотности флуорофора, который был рассчитан с учетом и без учета размера флуоресцентного зонда для пентамеров размером 50 Å с зондами с длиной линкера 12 Å.Результаты показывают, что отклонения в эффективности FRET могут достигать 10%.

Рис. 8

График зависимости эффективности FRET от вероятности донора для флуорофоров, расположенных в пентамеры, которые равномерно распределены в 2-D. Сплошная линия: радиус r1 (38 Å) использовался, чтобы избежать перекрытия пентамеров, а r2 (50 Å) был использован для генерации координат флуорофора и расчета эффективности FRET с учетом размера флуорофоров. Пунктирная линия: единственный радиус (r2) используется для определения положений пентамеров, координат флуорофора и расчета эффективности FRET.

3.3.

Эффективность маркировки

Невозможность маркировать каждый целевой сайт на белке-хозяине снижает наблюдаемую эффективность FRET, что приводит к неопределенности в отношении использования данных для количественного анализа. ExiFRET можно использовать для количественной оценки влияния снижения эффективности маркировки на эффективность FRET. На рис. 9 мы изображаем зависимость эффективности FRET от разделения флуорофора в тетрамерных структурах флуорофоров для ряда эффективностей мечения. Как и ожидалось, уменьшение процента помеченных сайтов снижает итоговую эффективность FRET.Если оценки вероятной эффективности маркировки можно определить экспериментально, такие графики можно использовать для учета неэффективной маркировки или для получения оценок неопределенности, которая вносится в эффективность FRET.

Рис. 9

Графики зависимости эффективности FRET от разделения флуорофоров для серии тетрамеров, распределенных в 2-D с различной эффективностью мечения, как показано рядом с каждой кривой.

3.4.

Присутствие кластеров или микродоменов

Формирование микродоменов в мембранной среде было связано с рядом физиологических процессов; следовательно, важно понимать распределение и агрегацию липидов и белков в мембранной среде.Использование анизотропии флуоресценции и экспериментов FRET для изучения пространственной организации и совместной локализации белков в мембранах было впервые продемонстрировано Вармой и Мэром ³⁶ и Кенуорти. ³⁷ Ряд последующих исследований ⁷ ^, ⁸ ^, ³⁸ подтвердили использование FRET для индикации агрегации и обнаружения микродоменов (обзоры см. В ссылках 5 и 6). Этот метод использует тот факт, что агрегация доноров и акцепторов в микродоменах вызывает локальное увеличение концентрации флуорофора, что приводит к увеличению эффективности FRET по сравнению с системами со случайным и однородным распределением флуорофоров.⁷ ^, ²⁵ ^, ³⁹ Однако, как отметили Кишковски и Кенуорти, ²⁷ наличие увеличенного FRET не является достаточным доказательством, чтобы продемонстрировать существование кластеров; но зависимость FRET от свойств, таких как плотность флуорофора, должна использоваться для различения микродоменов и однородных случайных распределений частиц. Для кластерного распределения можно ожидать, что эффективность FRET будет меньше зависеть от общей концентрации флуорофора (т.е.е., поверхностная плотность) в отличие от линейной зависимости при случайном и однородном распределении. ⁷ ^, ³⁹ Zacharias et al. ⁴⁰ использовали тот же аргумент в экспериментах FRET для исследования кластеризации модифицированных липидами зеленых флуоресцентных белков. Чтобы продемонстрировать это, мы использовали ExiFRET для подготовки графиков зависимости эффективности FRET от поверхностной плотности флуорофора для случайных и кластерных распределений. Результаты на рис. 10 (а) подтверждают, что отсутствие изменения FRET с увеличением поверхностной плотности сигнализирует о наличии кластеров.

Рис. 10

(a) Графики зависимости эффективности FRET от поверхностной плотности флуорофора для произвольно расположенных флуорофоров (некластеризованных) и флуорофоров, расположенных в кластеры с низкой и высокой плотностью. Отсутствие изменений в эффективности FRET может использоваться для обнаружения кластеров, в то время как величина эффективности FRET определяет локальную концентрацию в кластере. (b) Эффективность FRET показана в зависимости от поверхностной плотности флуорофора, когда либо размер кластера такой же, но внутренняя плотность варьируется (нижняя линия), либо внутренняя плотность фиксирована, но размер кластера изменяется (верхняя линия).

Помимо простого обнаружения наличия кластеров, FRET также может быть полезен для извлечения информации о внутридоменной плотности флуорофоров и размере кластера. Рисунок 10 (b) показывает, что эффективность FRET зависит от поверхностной плотности флуорофора внутри домена, а также от физического размера домена. Аналогичные результаты были получены в исследовании FRET методом Монте-Карло для дискообразных доменов. ²⁷ Они показали, что внутридоменный FRET полностью описывается локальной акцепторной плотностью.Однако вывести размер кластеров из эффективности FRET — гораздо более сложная задача, поскольку часто не существует единственного решения. Различные комбинации размера кластера и плотности внутри домена могут привести к одинаковой эффективности FRET. Кишковски и Кенуорти ²⁷ обнаружили, что моделирование, в котором доноры и акцепторы совместно локализованы внутри микродоменов, не может быть использовано для определения размера кластера. Наше собственное моделирование совместно локализованных донорно-акцепторных кластеров подтвердило это, поскольку мы обнаружили, что эффективность FRET показывает очень небольшие изменения в большом диапазоне размеров кластеров (для постоянной плотности внутри доменов).Тем не менее, Кишковски и Кенуорти показали, что можно определить радиус домена независимо от плотности внутри домена, выполнив моделирование, в котором доноры и акцепторы не колокализованы, а где доноры агрегированы в домены, окруженные равномерно распределенными акцепторами. ²⁷ Аналогичным образом Towles et al. ¹³ представил метод, который использует аналитическую модель в сочетании с симуляциями Монте-Карло для извлечения размера домена наноразмерных липидных рафтов из данных FRET с временным разрешением, хотя этот метод требует априорных знания фазовой диаграммы мембранной системы. ведется расследование.Sharma et al. ³⁸ использовали гомо-FRET и теоретический анализ, основанный на аналитических выражениях, для изучения размера и поверхностной организации гликозилфосфатидилинозитол (GPI) -зависимых белков в мембранах живых клеток.

Результаты на Рисунке 10 и ранее опубликованные результаты ⁷ ^, ²⁷ демонстрируют, что численные методы, такие как ExiFRET, могут быть очень полезны для разработки методов использования FRET для исследования микродоменов и поведения агрегации липидов и белки.Гибкость таких методов означает, что кластеры, образованные отдельными флуорофорами или мультимерными белками и олигомерами, можно изучать без необходимости корректировки метода расчета FRET.

3.5.

Флуорофоры с ограниченной ориентацией

Все примеры, обсужденные до сих пор, не рассматривают напрямую относительную ориентацию флуорофоров. Скорее, для этих расчетов используется общесистемное значение R0. На практике значение R0 включает информацию об относительной ориентации флуорофоров через так называемый фактор ориентации κ2.Хотя использование общесистемного значения R0 не обязательно подразумевает конкретное значение κ2, оно не позволяет значению R0 зависеть от конкретного направления, в котором разделяются флуорофоры, и того, как это соотносится с ориентацией флуорофоров. переходные диполи.

Чтобы включить ориентацию флуорофора непосредственно в схему расчета Монте-Карло, мы написали вторую программу под названием thetaFRET. Это имеет меньшую функциональность для генерации координат флуорофоров, но может использоваться для расчета вероятной эффективности FRET набора флуорофоров, когда известна как информация об их положениях, так и некоторая информация об их ориентации.В этом случае положения флуорофоров выгружаются из файла координат аналогично параметру координат, создаваемому пользователем в ExiFRET. Кроме того, ориентации флуорофоров моделируются на основе случайного движения внутри конуса, которое описывается средней ориентацией диполя перехода и углом конуса в качестве дополнительных столбцов в файле координат. Эффективность FRET может быть рассчитана либо в режиме динамического ориентационного усреднения, в котором предполагается, что движение флуорофора происходит быстрее, чем время передачи энергии (таким образом, κ2 усредняется по многим возможным ориентациям флуорофора), либо в статическом режиме усреднения ориентации, в котором эффективность FRET рассчитывается для каждого мгновенного набора ориентаций флуорофора.

В качестве примера этой программы на рис. 11 (а) мы рассматриваем эффективность FRET пары флуорофоров, разделенных расстоянием, эквивалентным R0, при вычислении с учетом κ2 = 2/3. Здесь мы строим график эффективности FRET как функции свободы ориентации флуорофоров, как описано размером угла конуса, в котором они могут двигаться. При угле конуса θ = 90 градусов красители обладают полной ориентационной свободой, а в случае режима динамического усреднения κ2 = 2/3 и, таким образом, эффективность FRET равна 0.5. Однако по мере уменьшения ориентационной свободы флуорофоров эффективность FRET резко меняется. κ2 зависит от взаимной ориентации средних диполей перехода. В этом случае его значение возрастает до 4, когда диполи выровнены параллельно друг другу и направлению их разделения (E∼0,86), и до 1, когда диполи параллельны друг другу, но перпендикулярны направлению разделения (E = 0,6). Примечательно, что эффективность FRET всегда ниже в статическом режиме ориентационного усреднения, чем в эквивалентном динамическом случае.

Рис. 11

Эффективности FRET для флуорофоров с ограниченной ориентацией. (а) Эффективность FRET показана для пары флуорофоров в зависимости от их ориентационной свободы (измеряется углом конуса θ). Во всех случаях ориентации диполей перехода параллельны, но в верхних линиях они также параллельны направлению разделения флуорофоров, а в нижних линиях они перпендикулярны этому направлению. Сплошные и пунктирные линии показывают результаты, которые предполагают динамический режим ориентационного усреднения, а пунктирные линии показывают эквивалентные результаты, которые предполагают статические средние значения.(b) Эффективность FRET представлена как функция угла между средней ориентацией диполей перехода донора и акцептора (ϕ), где диполи перпендикулярны направлению их разделения. Результаты показаны в предположении, что диполь перехода может перемещаться в пределах конуса под углом 0, 30, 60 и 90 градусов. Во всех случаях угол конуса θ донора и акцептора равен.

Рис. 12

Примеры входных файлов для Рис. 3 (a). Индивидуальные графики создаются путем изменения параметров density_min и density_max.

Рис. 13

Примеры входных файлов для Рис. 3 (b). (внутримолекулярный FRET). Меж- и внутримолекулярный FRET может быть рассчитан с использованием параметров da_stoichiometry и da_separate (см. Также рис. 4). 4 Случай 3.

Рис. 17

Примеры входных файлов для Рис.Индивидуальные графики создаются путем изменения параметра nmer_size.

Рис. 18

Примеры входных файлов для Рис. 6. Отдельные графики создаются путем изменения параметров nmer_size и P_donor, radius_min и radius_max были изменены таким образом, что эффективность FRET = 0,5, когда P_donor = 0,5.

Рис. 19

Примеры входных файлов для Рис. 7. Отдельные графики создаются путем изменения параметров da_stoichiometry, d_per_nmer и a_per_nmer.

Фиг.20

Примеры входных файлов для рис. 8. Отдельные графики создаются путем изменения параметров nmer_size и P_donor.

Рис. 21

Примеры входных файлов для Рис. 9. Отдельные графики создаются путем изменения параметра labeling_efficiency.

Рис. 22

Примеры входных файлов для Рис. 10 (a). Индивидуальные графики создаются путем изменения параметров cluster, n_cluster и radius_cluster.

Рис. 23

Примеры входных файлов для Рис.10 (б). Индивидуальные графики создаются путем изменения параметров n_clusters и radius_cluster.

Чтобы дать пример того, когда эта программа может быть полезной, мы указываем на рис. 11 (b), как ее можно использовать для получения структурной информации. Здесь мы вычисляем эффективность FRET как функцию угла между диполями перехода донора и акцептора (ϕ), предполагая, что они оба лежат в плоскости, перпендикулярной направлению их разделения. Это могло бы быть полезно, например, если бы мы пытались определить скручивание или изгиб цепи ДНК с помощью флуорофоров, которые были плотно встроены в молекулу (тем самым ограничивая ориентацию молекулы), как в случае с флуорофорами, которые являются нуклеиновыми. базовые аналоги.⁴¹ Если флуорофоры не имеют свободы ориентации (т. Е. Θ = 0), то эффективность FRET изменяется от 0,6, когда флуорофоры параллельны, до 0,0, когда они перпендикулярны. По мере того как флуорофоры становятся более подвижными (с увеличением угла конуса θ), изменение FRET с углом поворота ϕ уменьшается. В случае аналогов нуклеиновой кислоты угол конуса очень мал, ⁴¹, и, таким образом, подобный график можно использовать для соотнесения измеренной эффективности FRET непосредственно с изгибом цепи ДНК.

4. Заключительные замечания

Примеры, представленные в этой статье, и упомянутые исследования демонстрируют универсальность и возможности FRET для получения структурной информации о биомолекулах и для исследования агрегации белков и липидов в мембранной среде. Однако это исследование также подчеркивает важность учета наличия более чем одной пары флуорофоров при анализе данных. Результаты показали, что взаимосвязь между эффективностью FRET и разделением флуорофоров может сильно отклоняться от обычно используемого отношения 1 / R6 для флуорофоров, расположенных в правильной геометрии, например, в мультимерных белках или олигомерах.Мы разработали схему моделирования Монте-Карло и реализовали ее в гибкой и удобной программе под названием ExiFRET, которая позволяет пользователю моделировать FRET для отдельных флуорофоров, которые случайным образом распределены в двух или трех измерениях, и флуорофоров, связанных попарно или расположенных в правильной геометрии. Мы продемонстрировали, как ExiFRET можно использовать для оценки неопределенности эффективности FRET, вызванной снижением эффективности мечения, моделировать FRET в мультимерных белках и олигомерах и исследовать флуорофоры, расположенные в микродоменах.Влияние ограниченной ориентации флуорофоров на эффективность FRET было продемонстрировано с помощью второго инструмента, называемого thetaFRET. В более общем плане, это исследование демонстрирует, как численные методы очень хорошо подходят для помощи в разработке и анализе данных экспериментов FRET.

Благодарности

Эта работа финансировалась Австралийским исследовательским советом. Э. Деплазес благодарит Университет Западной Австралии за стипендию Джин Роджерсон для аспирантов.

Список литературы

L. Loura et al., «FRET-анализ формирования и свойств доменов в сложных мембранных системах», Биохим. Биофиз. Acta — Biomembr., 1788 г. (1, Сп. Вып. SI), 209 –224 (2009). 0005-2736 Google Scholar

H. Wallrabeet al., «Конфокальная микроскопия FRET для измерения кластеризации комплексов лиганд-рецептор в мембранах эндоцитов», Биофиз. J., 85 (1), 559 –571 BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

J. FarinhaJ. Мартиньо, «Резонансный перенос энергии в полимерных нанодоменах», J. Phys. Chem. С, 112 (29), 10591 –10601 (2008). JPCCCK 1932-7447 Google Scholar

10.

J. Yanget al., «Исследование переноса энергии симметричных диблок-сополимеров полиизопрен-поли (метилметакрилат), содержащих красители на стыках: ориентация красителя», Макромолекулы, 38 (4), 1256 –1263 (2005). MAMOBX 0024-9297 Google Scholar

14.

Г. Горбенко и др., «Исследование резонансного переноса энергии лизоцим-липидных взаимодействий», Биохим. Биофиз. Acta-Biomembr., 1778 г. (5), 1213 –1221 (2008). 0005-2736 Google Scholar

16.

L. Pisterziet al., «Олигомерный размер мускаринового рецептора M-2 в живых клетках, определяемый количественным переносом энергии резонанса флуоресценции», J. Biol. Chem., 285 (22), 16723 –16738 (2010). http://dx.doi.org/10.1074 / jbc.M109.069443 JBCHA3 0021-9258 Google Scholar

17.

В. Райку и др., «Взаимодействие с белками количественно оценивается in vivo с помощью спектрально разрешенного резонансного переноса энергии флуоресценции», Biochem. J., 385 (1), 265 –277 (2005). BIJOAK 0264-6021 Google Scholar

19.

M. Liet al., «Метод переноса энергии флуоресценции для анализа олигомерной структуры белка: приложение к фосфоламбану», Биофиз. J., 76 (5), 2587 –2599 (1999).BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

21.

Д. Сингх В. Райку, «Сравнение подходов, основанных на полном распределении и средних значениях, для определения эффективности резонансного переноса энергии флуоресценции в ансамблях белков в живых клетках», Биофиз. J., 98 (10), 2127 –2135 (2010). http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2010.01.048 BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

23.

P. Frederix et al., «Динамическое моделирование методом Монте-Карло для моделирования FRET и фотообесцвечивания в системах с множественными донорно-акцепторными взаимодействиями», Дж.Phys. Chem. В, 106 (26), 6793 –6801 (2002). http://dx.doi.org/10.1021/jp014549b JPCBFK 1520-6106 Google Scholar

24.

M. Frazieret al., «Исследование образования доменов в смесях сфингомиелин / холестерин / POPC с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии и моделирования Монте-Карло», Биофиз. J., 92 (7), 2422 –2433 (2007). http://dx.doi.org/10.1529/biophysj.106.100107 BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

28.

B. Corry D. JayatilakaP. Ригби, «Гибкий подход к расчету эффективности резонансной передачи энергии между несколькими донорами и акцепторами в сложной геометрии», Биофиз. J., 89 (6), 3822 –3836 (2005). http://dx.doi.org/10.1529/biophysj.105.069351 BIOJAU 0006-3495 Google Scholar

30.

Дж. Лакович, Принципы флуоресцентной спектроскопии, Google Scholar

31.

Z. GryczynskiJ. LubkowskiE. Буччи, Флуоресцентная спектроскопия, Том 278 методов в энзимологии, 538 –569 (1997).NPPBDP 0275-9292 Google Scholar

33.

B. Corryet al., «Улучшенная структура открытого канала MscL, определенная с помощью конфокальной микроскопии FRET и моделирования», J. Gen. Physiol., 136 (4), 483 –494 (2010). JGPLAD 0022-1295 Google Scholar

34.

B. AdairD. Энгельман, «Спиральные трансмембранные домены Glcyophorin-A димеризуются в фосфолипидных бислоях, исследование резонансного переноса энергии», Биохимия, 33 (18), 5539 –5544 (1994).0006-2960 Google Scholar

36.

Р. ВармаС. Мэр, «GPI-заякоренные белки организованы в субмикронные домены на поверхности клетки», Природа, 394 (6695), 798 –801 (1998). 0028-0836 Google Scholar

37.

А. Кенуорти М. Едидин, «Распределение гликозилфосфатидилинозитол-заякоренного белка на апикальной поверхности клеток MDCK исследовано с разрешением <100 ангстрем с использованием визуализации резонансного переноса энергии флуоресценции», Дж.Cell Biol., 142 (1), 69 –84 (1998). http://dx.doi.org/10.1083/jcb.142.1.69 JCLBA3 0021-9525 Google Scholar

39.

А. КенуортиN. Петранова М. Едидин, «FRET-микроскопия с высоким разрешением B-субъединицы холерного токсина и GPI-заякоренных белков в плазматических мембранах клеток», Мол. Биол. Ячейка, 11 (5), 1645 г. –1655 (2000). MBCEEV 1059-1524 Google Scholar

41.

K. Börjesson et al., «Пара FRET аналогов нуклеиновых оснований, облегчающая подробные структурные измерения в системах, содержащих нуклеиновые кислоты», Дж.Являюсь. Chem. Soc., 131 4288 –4293 (2009). 0002-7863 Google Scholar

Harley Benton представляет две новые 24-ладные модели Dullahan без головы

Приблизительное время чтения: 1 минута

Harley Benton Dullahan-AT 24 и FT 24 · Источник: Харли Бентон

Вы помните Harley Benton Dullahan конца 2019 года? Что ж, похоже, компания представила две новые 24-ладные версии с моделями Harley Benton Dullahan-FT 24 и AT 24.Читайте дальше, чтобы узнать, чем эти новые модели отличаются от более ранних предложений.

Харлей Бентон Дуллахан-FT 24

Этот новый Harley Benton Dullahan является продолжением июньского выпуска специальной модели FT с жареной шеей. Модель Dullahan-FT 24 имеет корпус из ольхи с отделкой Natural Open Pore Black Satin . Кленовый гриф имеет профиль Modern C , гриф клен и радиус 350 мм, а также 24 из нержавеющей стали лады в формате jumbo.Как и в стандартной версии, обе новые модели оснащены парой хамбакеров Roswell Alnico-5 .

Харлей Бентон Дуллахан-FT 24

Харлей Бентон Дуллахан-AT 24

Модель Dullahan-AT 24 выглядит очень похоже, но имеет корпус из красного дерева , шпон клена и действительно красивую «прозрачную черную» окраску. Он имеет тот же кленовый гриф с профилем Modern C , но с грифом из эбенового дерева с радиусом 350 мм.

Харлей Бентон Дуллахан-AT 24

Отличное соотношение цены и качества Современный дизайн без головы

Эти новые модели без головы стоят намного дешевле, чем что-то вроде Kiesel Leia , о котором мы рассказывали на прошлой неделе. Если вы ищете современную гитару без головы по этой цене, вы были бы безумны, если бы хотя бы не попробовали ее!

Вы можете перейти по ссылке ниже, чтобы заказать один из Thomann. Акции должны начать поступать в течение следующих нескольких недель. Я предполагаю, что эти модели будут быстро распроданы, так как характеристики и цена действительно хороши, поэтому, если вы хотите купить себе один, не задерживайтесь слишком долго!

Дополнительная информация

* Партнерская ссылка

13 июл 2020 от Jef

Теги из этого поста

Новости GTR Обезглавленный .

Модельный ряд LADA у официального дилера LADA в Санкт-Петербурге Форсаж

Сколько стоит LADA в СПб?

Почему новую LADA выгодно купить у официального дилера?

LADA новости | Лада-Центр – официальный дилер LADA в Санкт-Петербурге

Тест-драйв всех моделей ЛАДА у официального дилера Автовек в Екатеринбурге

Тест-драйв Лада в автосалоне Автовек

Правила проведения тест-драйва автомобилей Лада

Как проходит тест-драйв Лада в автосалоне Автовек

АвтоВАЗ выпустит четыре новых модели Lada до 2025 года — Где и что

Читайте также

4 новые модели Lada, которые появятся в 2021 году – Daily-Motor

Lada Largus FL

Lada Granta (2 поколение)

Lada Vesta FL

Lada Vesta SW Sport

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Что сохраняется в файле cookie?

новых моделей димера липопротеин-липазы

Abstract

ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярное клонирование

LPL

Приготовление флуоресцентного цистеина, меченного LPL

Анализы активности LPL

Активность флуоресцентно меченого LPL

Подготовка слайдов для микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF)

Взаимодействия LPL-LPL, визуализированные с помощью smFRET с использованием TIRF-микроскопии

Анализ данных smFRET

Подготовка образцов и жидкостная хроматография Nano-Flow Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ЖХ-МС / МС)

Качественная идентификация и идентификация сшитых пептидов по необработанным данным ЖХ-МС / МС

Моделирование LPL с использованием Rosetta Macromolecular Suite

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение исходной модели димера LPL

Создание ограничений расстояния smFRET между партнерами-димерами LPL

Специфическая маркировка LPL флуорофорами

Использование межмолекулярного FRET для измерения расстояний между субъединицами димера

Таблица 1

Применение экспериментально полученных данных к новым моделям димеров LPL

Особенности новых моделей димеров LPL

ОБСУЖДЕНИЕ

Вы играли на 12-ладовой гитаре Тейлора?

Вы играли на 12 ладах Тейлора?

Основы на 12 ладах

Sadowsky объявляет о выпуске Masterbuilt 24-ладной модели

Реальная история моделей

гибкий инструмент для понимания FRET в сложных геометрических формах

1.

Введение

2.

Методы

2.1.

Схема моделирования Монте-Карло

Таблица 1

Рис. 1

2.2.

Допущения

2.3.

Новые входные параметры

2.3.1.

Кластеризация флуорофоров

Фиг.2

2.3.2.

Присвоение типа флуорофора

2.3.3.

Размер n-мер

2.3.4.

Эффективность маркировки

2.3.5.

Координаты, предоставляемые пользователем

3.

Результаты

3.1.

Фоновая концентрация

Рис. 3

Рис. 4

3.2.

Мультимерные белки и олигомеры